工程微生物合成香草醛的進(jìn)展與挑戰(zhàn)

邱 笛,周 超,張根林

(石河子大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 新疆兵團(tuán)化工綠色過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832003)

香草醛(4-羥基-3-甲氧基苯甲醛),又稱香蘭素,由于具有類似奶油香草味氣味,經(jīng)常被用作香料、食品和化妝品的添加劑[1]。另外,香草醛還具有抗真菌[2]、抗癌[3]和抗氧化[4]等生物活性,被廣泛應(yīng)用于制藥領(lǐng)域[5-6]。預(yù)計(jì)到2025年,香草醛的全球需求量將在2016年18 600 t的基礎(chǔ)上增加6.2%[7]。目前,香草醛可通過(guò)天然提取、化學(xué)合成以及生物合成法獲取。天然提取的香草醛來(lái)源于蕓香科的香豆莢[8-9],通過(guò)滲透法(乙醇和水)、油樹(shù)脂法(乙醇)或超臨界CO2萃取法獲得[9-10]。因?yàn)橹参锾崛～@得的香草醛產(chǎn)量低、成本高且香豆莢種植需要占用大量的土地,不能滿足市場(chǎng)的需求?；瘜W(xué)合成的香草醛,是由化石資源的碳?xì)浠衔镏苽涞?如愈創(chuàng)木酚和丁香酚,其中,以愈創(chuàng)木酚為基礎(chǔ)的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程是利用乙醛酸作為縮聚劑,將甲酰基引入苯酚中形成中間產(chǎn)物,隨后再由苯基乙醛酸轉(zhuǎn)化為醛[11-12],由愈創(chuàng)木酚合成的香草醛占全球供應(yīng)市場(chǎng)的85%。雖然化學(xué)合成的香草醛產(chǎn)量高、成本低,但是反應(yīng)過(guò)程使用有毒有害的化學(xué)試劑以及底物選擇性差[13-14],所以不符合綠色化學(xué)和可持續(xù)的理念。

隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展,利用DNA重組、基因編輯技術(shù),定向調(diào)控生物體的代謝網(wǎng)絡(luò)并改造宿主細(xì)胞,以可再生資源為底物生產(chǎn)有價(jià)值的天然產(chǎn)物成為研究熱點(diǎn)。通過(guò)在微生物宿主中重建代謝途徑、阻斷競(jìng)爭(zhēng)代謝支路等策略引導(dǎo)碳流更快更多地流向目標(biāo)產(chǎn)物,平衡代謝通量,可提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。目前,已有利用微生物以葡萄糖、丁香酚、異丁香酚、木質(zhì)素和阿魏酸等不同碳源合成香草醛的研究,可見(jiàn)生物合成香草醛是一種很有前景的綠色制造工藝[15-16]?；诖?本文全面綜述香草醛的生物合成途徑、優(yōu)化與調(diào)控香草醛合成途徑的相關(guān)工程策略,同時(shí)提出微生物異源合成香草醛所面臨的挑戰(zhàn),以期為香草醛的高效生物合成提供參考。

1 工程微生物細(xì)胞合成香草醛

近20年來(lái),人們利用微生物以不同底物合成香草醛,解析并驗(yàn)證了香草醛的合成途徑。微生物合成的香草醛代謝途徑主要有2條(圖1)：芳香族氨基酸途徑和莽草酸途徑[17]。芳香族氨基酸途徑合成的香草醛起始于苯丙氨酸[18-22]或酪氨酸[23-30],而從莽草酸途徑合成的香草醛以3-脫氫莽草酸[31-35]為前體。除了這2條途徑外,研究人員還設(shè)計(jì)了其他的代謝策略[36-60]來(lái)合成香草醛。

PAL—phenylalnine ammonia lyase;C4H—cinnamate-4-hydrosylase;TAL—tyrosine ammonia lyase;C3H—4-coumarate 3-hydroxylase;HpaB/HpaC—4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase;COMT—caffeate O-methyltransferase;EhyA/B—eugenol hydroxylase;CalB—coniferyl alcohol dehydrogenase;CalA—coniferyl aldehyde dehydrogenase;FDC—coenzyme-independent decarboxylase;FCS—trans-feruloyl-CoA synthetase;ECH—enoyl-CoA hydratase/aldolase;VpVAN—vanillin synthase;IEM—isoeugenol monooxygenase;ARO3/ARO4—3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase;AROB—dehydroquinate synthase;AROD—dehydroquinate dehydratase;AROZ—3-dehydrogenase shikimic acid dehydrase;OMT—O-methyltransferase;ACAR—carboxylic acid reductases。藍(lán)色代表芳香族氨基酸途徑,綠色代表其他合成路徑,橙色代表莽草酸途徑圖1 生物合成香草醛的可能途徑Fig.1 The possible bio-synthetic pathway of vanillin

1.1 利用苯丙氨酸合成香草醛

在植物中,香草醛基于L-苯丙氨酸的脫氨作用,通過(guò)木質(zhì)素前體肉桂酸、對(duì)香豆酸、咖啡酸以及阿魏酸,最終形成香草醛。具體過(guò)程如下：苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸,然后經(jīng)過(guò)肉桂酸4-羥化酶(C4H)和對(duì)香豆酸3-羥化酶(C3H)兩步羥化形成咖啡酸,再利用甲基轉(zhuǎn)移酶(MTs)的甲基化作用合成香草醛前體阿魏酸,最后在阿魏酰輔酶A合成酶(FCS)和水合酶/醛縮酶(ECH)作用下生成香草醛[18-19]。

在植物中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)和2種依賴細(xì)胞色素P450酶的C4H和C3H參與催化L-苯丙氨酸合成香草醛中的前體咖啡酸[20]。因?yàn)镻450酶在細(xì)菌宿主中的表達(dá)難以實(shí)現(xiàn),所以Huang等[21]在大腸桿菌中以L-苯丙氨酸為前體物,利用其內(nèi)源的4-羥基苯乙酸-3-羥化酶(4HPA3H)從頭合成,得到766.68 mg/L咖啡酸。此外,Luo等[22]在大腸桿菌中通過(guò)敲除基因tyrA(編碼預(yù)苯酸脫氫酶)防止碳通量流向酪氨酸,增強(qiáng)L-苯丙氨酸的供應(yīng),使咖啡酸產(chǎn)量提高至1 355.8 mg/L,說(shuō)明提高L-苯丙氨酸的供應(yīng)對(duì)香草醛的合成非常重要。

1.2 利用酪氨酸合成香草醛

酪氨酸是芳香族氨基酸中的重要成分,是生產(chǎn)黃酮類、生物堿類和萜類化合物的關(guān)鍵前體[23]?？梢訪-苯丙氨酸生產(chǎn)香草醛,不過(guò)中間產(chǎn)物——對(duì)香豆酸可以直接由L-酪氨酸生成[24]。與從L-苯丙氨酸合成香草醛的途徑相比,從L-酪氨酸的途徑更簡(jiǎn)短,可以避免反式肉桂酸的存在,特別是L-酪氨酸的4位含有羥基,直接由酪氨酸解氨酶(TAL)作用生成對(duì)香豆酸。因此,L-酪氨酸作為前體可能優(yōu)于L-苯丙氨酸[25]。在以L-酪氨酸合成香草醛的途徑中,中間產(chǎn)物咖啡酸的合成研究成果較多。Kang等[26]利用優(yōu)化后的TAL和C3H,在高產(chǎn)酪氨酸的大腸桿菌中,合成了150 mg/L咖啡酸。Jang等[27]以L-酪氨酸為起始物,利用TAL將L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酸,然后在C3H的羥化作用下得到咖啡酸,在添加200 mg/L酪氨酸的條件下產(chǎn)生了191.8 mg/L咖啡酸。為了避免補(bǔ)充酪氨酸,Li等[28]在釀酒酵母中表達(dá)RcTAL和C3H,從葡萄糖合成11.4 mg/L咖啡酸。為了減輕異源合成受質(zhì)?？截悢?shù)的限制,Qi等[29]在釀酒酵母中也使用類似的合成途徑從L-酪氨酸合成香草醛前體咖啡酸,并通過(guò)多拷貝染色體整合策略提高咖啡酸的產(chǎn)量,使咖啡酸的產(chǎn)量比Li等[28]的結(jié)果提高了32%[30]。Ni等[1]利用大腸桿菌為宿主,以L-酪氨酸為底物,將其轉(zhuǎn)化為4-香豆酸后,再利用阿魏酸介導(dǎo)的香草醛生物合成途徑,獲得97.2 mg/L香草醛。

1.3 莽草酸途徑合成香草醛

3-脫氫莽草酸可由葡萄糖的糖酵解途徑(EMP)的赤蘚糖-4-磷酸和磷酸戊糖途徑中(PPP)磷酸烯醇式丙酮酸的經(jīng)縮合反應(yīng)獲得。香草醛合成能以3-脫氫莽草酸為前體,經(jīng)3-脫氫莽草酸脫水酶合成原兒茶酸,然后在氧甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)和羧酸還原酶(ACAR)的作用下生成香草醛,或經(jīng)過(guò)ACAR的還原作用生成原兒茶醛,最后在OMT的甲基化作用下生成香草醛。1998年,Li等[31]首次在大腸桿菌中以葡萄糖為簡(jiǎn)單碳源從頭合成香草酸,在高產(chǎn)3-脫氫莽草酸的大腸桿菌中引入AroZ、COMT和來(lái)自粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)的芳基醛脫氫酶(ALDH),最終僅檢測(cè)到微量的香草醛,且ALDH還原香草酸的過(guò)程需要額外補(bǔ)充輔因子NADH。Hansen等[32]通過(guò)引入諾卡氏菌的ACAR和磷酸乙酯轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)在酵母中合成香草醛,因?yàn)锳CAR能催化ATP和NADPH將原兒茶酸還原成原兒茶醛且將香草酸還原為香草醛,基于此,分別在釀酒酵母和裂殖酵母中以葡萄糖合成45和65 mg/L香草醛,成為酵母合成香草醛的開(kāi)端。但由于宿主內(nèi)許多內(nèi)源性的酶容易將所需的醛轉(zhuǎn)化為不需要的醇,成為微生物合成香草醛的主要障礙[33]。因此,2014年,Kunjapur等[34]在大腸桿菌K12中通過(guò)敲除控制醛酮還原酶和醇脫氫酶表達(dá)的基因,以葡萄糖為原料獲得119 mg/L香草醛,比親本菌株的產(chǎn)量高55倍。2016年,Kunjapur等[35]利用3-脫氫莽草酸脫水酶(AsbFBt)催化內(nèi)源性的3-脫氫莽草酸轉(zhuǎn)化為原兒茶酸且過(guò)表達(dá)氧甲基轉(zhuǎn)移酶(OMTHS)合成香草酸,最后在羧酸還原酶(CarNi)與加入的蛋氨酸作用下,香草醛的產(chǎn)量增加到419 mg/L。

1.4 其他途徑合成香草醛

異丁香酚是廉價(jià)易得的生物質(zhì),由異丁香酚合成香草醛是利用異丁香酚單加氧酶(IEM)使其側(cè)鏈氧化而得到[36]。Zhao等[37]用兩親性短肽18A和異丁香酚單加氧酶融合增強(qiáng)異丁香酚單加氧酶的活性,由異丁香酚生物轉(zhuǎn)化得到14.5 mmol/L的香草醛。隨后,Wang等[38]利用來(lái)自硝基還原假單胞菌Jin1中具有高特異性的異丁香酚單加氧酶,轉(zhuǎn)化得到252 mmol/L香草醛。同樣,丁香酚也可作為合成香草醛的經(jīng)濟(jì)底物,在丁香酚羥化酶(EhyA/B)作用下生成松柏醇,然后其被松柏醇脫氫酶(CalB)氧化為松柏醛,之后松柏醛被松柏醛脫氫酶(CalA)轉(zhuǎn)入阿魏酸合成香草醛的途徑中。以阿魏酸[39-40]為前體生產(chǎn)香草醛可以分為非輔酶A依賴型和依賴輔酶A兩種方式,非輔酶A依賴型是通過(guò)香草醛合酶(VpVAN)實(shí)現(xiàn)的。如Gallage等[41]利用香草莢中內(nèi)源性的VpVAN催化阿魏酸轉(zhuǎn)化為香草醛。同樣,Arya等[42]利用Agrobacterium介導(dǎo)的VpVAN在香豆莢中催化阿魏酸合成香草醛,但是含量?jī)H為544.72 μg。因?yàn)榘⑽核徂D(zhuǎn)化為香草醛只是阿魏酸分解代謝的一個(gè)中間步驟,產(chǎn)生的香草醛可迅速轉(zhuǎn)化為其他副產(chǎn)物或通過(guò)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴的反應(yīng)將香草醛轉(zhuǎn)化為香草酸。為了防止香草醛進(jìn)一步氧化,Gioia等[39]利用熒光假單胞菌BF13為宿主,最高得到1.28 g/L的香草醛,證實(shí)敲除香草醛脫氫酶vdh基因是獲得高產(chǎn)量香草醛所必需的[43]。Fleige等[44]使用擬淀粉菌Amycolatopsissp.ATCC 39116,以此同樣敲除vdh基因并過(guò)表達(dá)fcs/ech獲得突變株,高產(chǎn)19.3 g/L香草醛。Furuya等[45]在大腸桿菌中表達(dá)輔酶脫羧酶(FDC)、加氧化酶(Cso2),以阿魏酸為底物將4-乙烯基愈創(chuàng)木酚 (4-vinylguaiacol)轉(zhuǎn)化生成7.8 g/L香草醛。研究者們發(fā)現(xiàn),FCS和ECH不僅依賴輔酶A,而且兩者的比例對(duì)香草醛產(chǎn)量影響很大[46-47]。最近,Chen等[48]在大腸桿菌JM109中將fcs和ech基因比例調(diào)控為1∶1,成功構(gòu)建由阿魏酸生物合成香草醛的全細(xì)胞催化體系,將20 mmol/L阿魏酸轉(zhuǎn)化為15 mmol/L香草醛,有效地消除了高濃度阿魏酸引起生產(chǎn)香草醛的瓶頸問(wèn)題。表1總結(jié)了相關(guān)代謝途徑合成香草醛的成果。

表1 工程微生物合成香草醛策略及其產(chǎn)量

2 工程微生物合成香草醛面臨的挑戰(zhàn)

盡管香草醛的生物合成被認(rèn)為是環(huán)境友好且低能耗的方法,但是其合成受到復(fù)雜的酶促反應(yīng)和輔因子供應(yīng)等條件的限制[61]。因?yàn)閷?duì)宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō),香草醛的存在對(duì)宿主存在威脅,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制[62],所以解除反饋抑制和增強(qiáng)異源酶的高效表達(dá)是香草醛生物合成的關(guān)鍵性因素[63-64](圖2)。

圖2 工程微生物合成香草醛面臨的挑戰(zhàn)Fig.2 Challenges of vanillin production in engineered microorganism

2.1 宿主耐受性

對(duì)大多數(shù)宿主來(lái)說(shuō),高濃度的香草醛不僅對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制效應(yīng),還會(huì)影響與氨基酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)合成,最終抑制細(xì)胞活性[65-67]。另外,微生物在生產(chǎn)香草醛的過(guò)程中,由于細(xì)胞的呼吸會(huì)分泌乙醇,高濃度乙醇的存在會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成脅迫并干擾氧化還原平衡[68-69]。因此,增加工程菌對(duì)環(huán)境的耐受性是突破香草醛生物合成瓶頸的重要途徑。代謝基因的調(diào)控、目標(biāo)化合物的轉(zhuǎn)移和菌株的馴化是解除香草醛和乙醇對(duì)細(xì)胞毒害的主要方法。

第一種方法是通過(guò)基因調(diào)控來(lái)提高菌株對(duì)香草醛的耐受性。Liang等[70]成功鑒定宿主與香草醛耐受性相關(guān)的醛酮還原酶基因GCY1和過(guò)氧化物酶膜信號(hào)受體基因PEX5,并證實(shí)還原酶失活體Gcy1pY56F具有NADPH依賴的香草醛還原酶活性,可以直接增強(qiáng)菌株對(duì)香草醛的耐受性。Cao等[71]證實(shí),轉(zhuǎn)錄因子YRR1缺失能增強(qiáng)HAA1編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子促進(jìn)轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程,從而提高酵母對(duì)香草醛的耐受性。第二種方法是目標(biāo)化合物香草醛的修飾轉(zhuǎn)移,通常是將香草醛的醛基進(jìn)行羥化、醛基糖苷化來(lái)降低香草醛毒害作用[72-73]。引入還原酶將香草醛轉(zhuǎn)化為毒性較低的香草醇研究較多。Wang等[74]過(guò)表達(dá)醇脫氫酶(ADH6)、YNL134C(NADH依賴的醛還原酶)和YJR096W(烯酮還原酶)基因,促進(jìn)香草醛還原為香草醇。Brochado等[75]利用計(jì)算機(jī)模擬,在釀酒酵母中引入尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT),利用在分批培養(yǎng)中得到毒性更低且更易溶的β-D-葡萄糖基香草醛(vanillinβ-D-glucoside-VG)。在高乙醇的特定條件下,Natesuntorn等[76]證實(shí)DNA某些區(qū)域的拷貝數(shù)變化可以提高釀酒酵母的耐受性。Morard等[77]發(fā)現(xiàn),釀酒酵母中非整數(shù)倍的Ⅲ號(hào)染色體在乙醇耐受進(jìn)化實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常存在,且非整數(shù)倍體可被自然菌株用來(lái)增強(qiáng)自身的乙醇耐受性。除此之外,研究人員還嘗試增加麥角甾醇含量來(lái)維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性以減輕產(chǎn)物香草醛對(duì)細(xì)胞代謝的負(fù)擔(dān)[78-79]。

2.2 代謝通量不平衡

生物合成香草醛效率低的另一挑戰(zhàn)是代謝通量不平衡。因此,代謝工程的重點(diǎn)是重新編輯細(xì)胞代謝通路,解除內(nèi)源性代謝以產(chǎn)生高附加值產(chǎn)品[80]。莽草酸途徑合成香草醛需要2個(gè)前體：4-磷酸-赤蘚糖(E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。然而,酵母中E4P的可用碳通量至少比PEP的少一個(gè)數(shù)量級(jí)[81]。為了高效提供E4P,并解決其內(nèi)在的稀缺性,Liu等[82]將酵母中的中心碳代謝途徑重排,引入來(lái)自短雙歧桿菌的磷酸酮醇酶(Bbxfpk)和來(lái)自克魯氏梭菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰化酶(Ckpta)的異源磷酸酮醇酶途徑(PHK),最終將部分碳通量從糖酵解途徑直接導(dǎo)向E4P,過(guò)表達(dá)Bbxfpk后E4P的濃度增加5.4倍;隨后,敲除PHK途徑中的GPP1,使p-HCA(合成香草醛的前體物)產(chǎn)量提高40%,該策略可以將更多代謝通量流向E4P。Hassing等[83]將中心碳與芳香族氨基酸代謝直接連接,以提高酵母生產(chǎn)2-苯乙醇的能力,主要是過(guò)表達(dá)丙酮酸激酶變體和消除苯乙醇形成,以此消除對(duì)羥基苯乙醇形成來(lái)改善磷酸烯醇式丙酮酸供應(yīng),顯著提高了釀酒酵母中2-苯乙醇的產(chǎn)量。

代謝通量的分支競(jìng)爭(zhēng)途徑也是代謝通量不平衡的主要原因。在大腸桿菌中含有許多具有醛還原酶活性的內(nèi)源性酶,會(huì)導(dǎo)致形成的最終產(chǎn)物是香草醇而不是香草醛,Kunjapur等[34]通過(guò)滅活3種醛酮還原酶(AKRs)和乙醇脫氫酶(ADHs),得到香草醛產(chǎn)量為119 mg/L。

2.3 反饋抑制

生物合成香草醛可以利用苯丙氨酸和酪氨酸為起始物,但是以苯丙氨酸、酪氨酸為底物的酶在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上受到嚴(yán)格調(diào)控[84-85](圖2)。在釀酒酵母中,過(guò)表達(dá)反饋不敏感突變酶3-脫氧-D-阿拉伯糖庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶和分支酸突變酶(chorismate mutase)來(lái)實(shí)現(xiàn)消除對(duì)關(guān)鍵酶的反饋抑制[86]。DAHP合酶由ARO4基因編碼,是催化芳香族氨基酸途徑的第一步,如果其229位的亮氨酸突變?yōu)橘嚢彼岬玫紸RO4K229L,則可使其不再被酪氨酸反饋抑制[87]。第二個(gè)受到酪氨酸抑制并由色氨酸激活的基因是ARO7,如果將用甘氨酸取代141位的絲氨酸,得到的ARO7G141S,可消除酪氨酸的抑制作用[88]。Luttik等[86]變構(gòu)調(diào)控ARO4和ARO7的表達(dá),可顯著影響胞內(nèi)苯丙氨酸、酪氨酸的濃度。Gold等[89]在酵母中通過(guò)敲除苯丙酮酸脫羧酶基因ARO10并過(guò)表達(dá)ARO4K229L的基因,最終將酪氨酸積累到129 mmol/L。之后,Rodriguez等[90]同樣過(guò)表達(dá)抗反饋抑制ARO4K229L和ARO7G141S的基因,并敲除丙酮酸脫羧酶基因PDC5和ARO10,最終獲得香草醛前體對(duì)香豆酸的產(chǎn)量為1.93 g/L。Li等[91]為了解決L-酪氨酸途徑的瓶頸,對(duì)釀酒酵母BY4741進(jìn)行遺傳修飾,通過(guò)過(guò)表達(dá)突變的ARO4K229L和ARO7G141S的基因,使香草醛前體物對(duì)香豆酸的產(chǎn)量提高3.61倍;同時(shí),刪除PDC5和ARO10來(lái)減少副產(chǎn)物苯乙醇的形成。Zhou等[92]在釀酒酵母中敲除GAL80調(diào)控系統(tǒng)以消除酪氨酸反饋抑制且刪除苯丙酮酸脫羧酶基因(ARO10),咖啡酸產(chǎn)量從222.7 mg/L提高到569 mg/L,成功強(qiáng)化了香草醛中間體咖啡酸的合成。

3 提高生物合成香草醛的工程化策略

為了緩解香草醛生物合成途徑中存在的挑戰(zhàn),關(guān)鍵酶的篩選、輔因子的優(yōu)化、混菌的培養(yǎng)等均是有效的工程化策略(圖3)。

圖3 提高香草醛產(chǎn)量的工程化策略Fig.3 Strategies of enhancing the titer of vanillin

3.1 關(guān)鍵酶的篩選

在香草醛合成路徑中,特定酶的活性或特異性低造成中間產(chǎn)物的積累是導(dǎo)致終產(chǎn)物含量低的瓶頸之一。因此,代謝工程目標(biāo)之一就是提高關(guān)鍵酶的表達(dá)水平[93-94]。香草醛的合成途徑涉及多個(gè)關(guān)鍵酶表達(dá),如裂解酶、羥化酶、脫氫酶和脫羧酶等(表2)。因?yàn)橄悴菟嶙鳛榇x途徑的副產(chǎn)品存在[95-96],所以引入羧酸還原酶的酶促反應(yīng)策略可以有效提高香草醛含量,如來(lái)自諾卡氏菌的羧酸還原酶CAR,以ATP和NADPH為輔因子,在大腸桿菌中具有較高的香草酸還原活性[97-98]。Park等[99]從膿腫分枝桿菌中得到B1MLD編碼的CAR,再由CAR介導(dǎo)的全細(xì)胞生物催化,可還原產(chǎn)生2.86 g/L香草醛。因?yàn)橐媵人徇€原酶需要消耗較多能量,將其甲基化可提高香草醛的產(chǎn)量并提高其穩(wěn)定性[100-101]。甲基轉(zhuǎn)移酶催化的氨基酸通常是組氨酸或酪氨酸,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體通過(guò)SN2親核取代進(jìn)行甲基化[102]。Hansen等[32]通過(guò)表達(dá)兒茶酚甲基轉(zhuǎn)移酶(HsCOMT)來(lái)增強(qiáng)香草醛的合成效率,將香草醛生物合成途徑引入裂殖酵母和釀酒酵母中,利用葡萄糖分別合成香草醛65和45 mg/L。同樣,Kunjapur等[35]利用來(lái)自H.sapiens的兒茶酚甲基轉(zhuǎn)移酶從頭合成香草醛,發(fā)現(xiàn)從原兒茶酸甲基化合成香草醛是限速步驟,基于此,敲除抑制甲硫氨酸合成的轉(zhuǎn)錄因子metJ、過(guò)表達(dá)甲基化途徑的metA和cysE基因,最后得到香草醛產(chǎn)量為272 mg/L。由此可見(jiàn),在香草醛合成途徑中涉及甲基化反應(yīng)時(shí),可通過(guò)解除對(duì)S-腺苷甲硫氨酸生物合成和再生來(lái)提高香草醛產(chǎn)量。盡管通過(guò)使用來(lái)自H.sapiens的兒茶酚甲基轉(zhuǎn)移酶能提高香草醛含量,但是其活性較低。為了提高氧甲基轉(zhuǎn)移酶活性,還可以利用蛋白質(zhì)工程手段提高甲基轉(zhuǎn)移酶的特性[103],達(dá)到以非天然的底物來(lái)合成所需的甲基化產(chǎn)物。

表2 香草醛合成中涉及的關(guān)鍵酶

除了關(guān)鍵酶的篩選外,酶性能的改造對(duì)提高高附加值產(chǎn)物的產(chǎn)量也有重要作用。定向進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)以及理性設(shè)計(jì)是改造酶的主要手段?；魜嗛萚104]在大腸桿菌中通過(guò)定向進(jìn)化改造來(lái)自黏紅酵母的酪氨酸氨裂解酶TAL,將篩選的酶在S9N和A11Y位點(diǎn)進(jìn)行組合突變,可解決TAL酶活性低的問(wèn)題,最終獲得394.2 mg/L對(duì)香豆酸。異丁香酚單加氧酶(IEM)是從異丁香酚合成香草醛的關(guān)鍵酶,但受到產(chǎn)物抑制而導(dǎo)致酶活低,Zhao等[37]通過(guò)半理性設(shè)計(jì)進(jìn)行定點(diǎn)突變篩選得到突變酶T52P,獲得酶活提高35%的突變菌。甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)是合成香草醛前體阿魏酸的關(guān)鍵酶,但其催化活性低限制了香草醛的高效合成,Law等[105]構(gòu)建COMTY200L突變體,將其區(qū)域選擇性提高到90%,從而提高了甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。因此,通過(guò)對(duì)關(guān)鍵酶的篩選以及對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行改造,可以提高酶的活性,增加其與底物的結(jié)合力,從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的含量。

3.2 輔因子供應(yīng)

輔因子,如ATP、NADP(H)/NAD(H)及金屬元素等對(duì)生物體的生化反應(yīng)至關(guān)重要[106-107],因?yàn)槟承╆P(guān)鍵酶常需要輔因子來(lái)維持高活性,而輔因子供應(yīng)不足可能導(dǎo)致合成過(guò)程受限。因此,通過(guò)改變輔因子供應(yīng)是實(shí)現(xiàn)高附加值化學(xué)品高效生產(chǎn)的重要方法[108-110]。

咖啡酸作為香草醛合成的核心前體物之一,其合成與輔因子供應(yīng)密切相關(guān)[111]。在細(xì)菌中難以實(shí)現(xiàn)P450酶的功能表達(dá),主要是因?yàn)榧?xì)菌缺乏細(xì)胞色素P450還原酶(CPRs)/氧化還原伴侶。因此,Qiu等[5]在咖啡酸合成中使用HpaB和HpaC異源酶組合代替依賴于細(xì)胞色素P450單加氧酶的C4H,在此過(guò)程中,電子通過(guò)HpaC從NADH轉(zhuǎn)移到FAD形成FAD(H2),被HpaB進(jìn)一步捕獲,在O2存在下氧化對(duì)香豆酸[112-113],因此,FAD(H2)可能是電子轉(zhuǎn)移中的限速步驟。Chen等[114]過(guò)表達(dá)磷酸雙乙酰酶/磷酸酮醇酶(XFPK/PTA)與天然轉(zhuǎn)醛縮酶Tal,同時(shí)抑制E4P且促進(jìn)NADPH再生,有利于酵母合成咖啡酸。此外,增加胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸的供應(yīng)也是提高天然產(chǎn)物產(chǎn)量有效的方法[115-116]。Chen等[117]利用來(lái)自擬蘭芥的咖啡酰O-甲基轉(zhuǎn)移酶(AtCOMT)在大腸桿菌中以簡(jiǎn)單碳源代替3,4-二羥基苯甲醇(3,4-DDBA)從頭合成,得到240.69 mg/L的香草醇。在香草醛合成途徑中,從咖啡酸到阿魏酸步驟中存在S-腺苷甲硫氨酸甲基供體和NADPH的供應(yīng)問(wèn)題。為了提高SAM生產(chǎn)中NADPH的濃度,通過(guò)sRNA方法敲除NADPH消耗途徑的aroE、argC、proA、ilvC和proC這5個(gè)基因,使SAM濃度比野生菌株的提高70%[118]。同時(shí),金屬離子在香草醛合成中也有重要意義,如敲除鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體有助于增加香草醛的產(chǎn)量[119]。

3.3 共培養(yǎng)策略

因?yàn)榇竽c桿菌不能高效表達(dá)細(xì)胞色素P450酶[120],而釀酒酵母合成芳香族氨基酸受到反饋抑制[90],所以可利用共培養(yǎng)系統(tǒng)將整個(gè)合成途徑分配在不同宿主中,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)香草醛的高效合成。

共培養(yǎng)策略是利用菌株間的互利共生作用來(lái)提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量、減少宿主細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)且確保輔因子供應(yīng)和代謝通量平衡[121-123]。利用共培養(yǎng)系統(tǒng)合成高值化學(xué)品的成果不少,如紫杉醇、柚皮素和迷迭香酸等。Zhou等[124]將不能單獨(dú)產(chǎn)生紫杉醇前體的釀酒酵母與大腸桿菌共培養(yǎng),以此將乙?；甲仙纪榈暮铣赏緩椒譃閮蓚€(gè)模塊,最終獲得33 mg/L含氧紫杉烷。Zhang等[125]建立釀酒酵母與大腸桿菌共培養(yǎng)體系,以D-木糖為唯一碳源來(lái)培養(yǎng)2種工程菌生產(chǎn)柚皮素,還可以避免生成副產(chǎn)物乙醇。基于此,將共培養(yǎng)策略應(yīng)用于生物合成香草醛途徑有積極意義[126-128]。Lesage等[129]利用黑曲霉與擔(dān)子菌合成香草醛,因?yàn)榘⑽核峥杀缓谇狗纸鉃橄悴菟?然后香草酸被擔(dān)子菌還原為香草醛,由此獲得237 mg/L的香草醛。在以苯丙氨酸為起始物合成香草醛中間體時(shí),細(xì)胞色素P450依賴的C4H在香豆酸[130]的生產(chǎn)中起關(guān)鍵作用,因此利用釀酒酵母代替大腸桿菌表達(dá)P450酶可有效促進(jìn)香草醛的合成。香草醇是香草醛前體,Yang等[131]利用共培養(yǎng)策略,以2株大腸桿菌(YMC12和YMC13)分別作為上下游宿主以減少菌株間競(jìng)爭(zhēng),用葡萄糖和甘油作為混合碳源,菌株YMC12負(fù)責(zé)用甘油產(chǎn)生3,4-DHBA,而菌株YMC13將3,4-DHBA轉(zhuǎn)化為香草醇,當(dāng)兩株菌的接種量為1∶1時(shí),最終得到328.9 mg/L香草醇。由此可見(jiàn),共培養(yǎng)策略在高效合成香草醛及其衍生物方面有較好的潛力。

4 總結(jié)與展望

隨著對(duì)香草醛合成代謝途徑的不斷研究以及相關(guān)酶和基因的鑒定和表征,利用工程微生物合成香草醛成為新的機(jī)遇。本文綜述了香草醛生物合成面臨的3個(gè)主要挑戰(zhàn)并分析了造成這些挑戰(zhàn)的主要原因。為了獲得高產(chǎn)量的香草醛,目前研究主要集中在以下方面：①對(duì)合成途徑進(jìn)行調(diào)整和關(guān)鍵酶挖掘;②提高菌株對(duì)香草醛耐受性;③保證輔因子供應(yīng),促進(jìn)氧化還原平衡。未來(lái),我們還可以通過(guò)多種策略進(jìn)一步提高香草醛產(chǎn)量：①通過(guò)人工智能與機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合,理性設(shè)計(jì)獲得活性更高的酶,構(gòu)建調(diào)控元件,使能量最優(yōu)地流向香草醛的合成。②構(gòu)建智能傳感器,在線監(jiān)測(cè)香草醛合成,同時(shí)設(shè)計(jì)反應(yīng)器,建立反應(yīng)分離耦合體系,及時(shí)分離終產(chǎn)物以降低毒性;③與發(fā)酵工程相結(jié)合調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài),同時(shí)利用融合蛋白的表達(dá)來(lái)減少微生物生產(chǎn)香草醛過(guò)程中副產(chǎn)物的積累。