飲料酒中香草醛的研究進展

莫新良，楊 亮，滕明德，鐘艷霞，李芳香

（茅臺學院釀酒工程系，貴州仁懷 564501）

香草醛（vanillin）是香子蘭花莢中的典型香莢蘭豆香氣物質(zhì)，又稱香蘭素、香草素、香蘭醛，其化學名為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛。香草醛是一種重要的香氣化合物，因其具有令人愉悅的甜香、濃烈的奶香氣及香莢蘭豆香草香氣，廣泛應用于食品、飲料等領(lǐng)域，常作為香料添加于糕點、糖果及清涼飲料等食品中，起助香和定香作用[1]。

飲料酒是指酒精體積含量為0.5%～60%的酒精飲料[2]。飲料酒，特別是經(jīng)陳釀過的葡萄酒[3]、黃酒[4-5]、日本燒酒[6]、白蘭地[7]、朗姆酒[7-8]等含有相當數(shù)量的香草醛，其對酒的香氣、口感以及穩(wěn)定性等品質(zhì)具有重要作用[8]。此外，香草醛具有多種生理活性功能，如通過自身聚合化及與自由基反應清除自由基，從而擁有較強的抗氧化活性，同時還具有抗炎、增加免疫力、預防和抑制各種慢性疾病的發(fā)生與發(fā)展等功能[9-11]，深受人們廣泛關(guān)注。香草醛在飲料酒中的香氣閾值為22～438.52 μg/L[8,12]。研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素的降解和阿魏酸的轉(zhuǎn)化是香草醛的重要來源，而飲料酒的原輔料中通常含有大量的木質(zhì)素和阿魏酸[13-14]，為香草醛的形成提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。本文從飲料酒中香草醛的分析方法、香氣貢獻、含量差異及形成機理等方面進行綜述，以期為我國飲料酒中香草醛及其形成機理研究提供參考依據(jù)。

1 飲料酒中香草醛的分析方法

香草醛具有強極性且在酒中含量甚微，常規(guī)的檢測方法難以將其有效檢出。目前，關(guān)于飲料酒中香草醛的分析方法主要有樣品預處理、儀器檢測、定性定量分析及香氣貢獻判定和確認等幾部分。樣品預處理過程主要有化學衍生化（Chemical derivatization，CD）[15]、液-液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）[16]、固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）[4,17]、固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）[18-19]、液-液微萃?。╨iquid-liquid microextraction，LLME）[4-5]等，儀器檢測主要有：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[3-5]、高 效 液相色譜（High-performance liquid chromatography，HPLC）[6,20-21]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[22-23]等。以下將具體介紹飲料酒中香草醛的分析方法。

1.1 飲料酒中香草醛的樣品預處理方法

飲料酒基質(zhì)復雜，其中存在香草醛等各種香氣成分濃度低，且有著不同的揮發(fā)性、溶解性及極性等性質(zhì)的物質(zhì)。因此，樣品預處理方法的選擇非常重要。

1.1.1 化學衍生化法（CD） 對于香草醛、不飽和烯醛等這樣一些香氣貢獻大但含量低的物質(zhì)，常規(guī)方法難以分析，通常采用CD 進行處理分析，因需先將被分析物質(zhì)萃取出來再進行化學衍生，故該法較為繁瑣。輕工業(yè)部食品發(fā)酵研究所[24]曾用該預處理方法分析了茅臺酒中的愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚等12 種揮發(fā)性酚類物質(zhì)，由于受當時香氣物質(zhì)認知條件限制，沒有香草醛的相關(guān)信息。傅玉書等[15]使用雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺做衍生劑，將茅臺酒等白酒中的香草醛等酚類物質(zhì)檢測出來，香草醛不但被鑒定出來，同時還得到初步定量分析。曹長江等[25]使用羥胺鹽酸鹽作為衍生劑，將白酒中含量低的反-2-壬烯醛、反,反2,4-壬二烯醛等檢測出來。

1.1.2 液-液萃取法（LLE） LLE 是一種根據(jù)相似相溶原理，利用香草醛等微量成分在溶劑相和樣品基質(zhì)中的分配系數(shù)差異，直接從樣品中萃取、分離揮發(fā)性成分的方法。其缺點是耗時、費力且需要的樣品及溶劑較多，但該方法因具有操作簡便、萃取效果好、能較全面提取樣品中的目標物質(zhì)等優(yōu)點，被廣泛應用在飲料酒風味物質(zhì)分析中[16,26-27]。丁云連[16]應用該萃取法分析出了清香型白酒中包括香草醛在內(nèi)的90 種香氣化合物；楊亮等[26]利用該方法分析了缺陷型白酒中的揮發(fā)性成分，香草醛被分析出來；尹建邦等[27]采用此方法分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)橡木桶陳釀的葡萄酒香氣成分如香草醛等的香氣強度明顯高于未經(jīng)橡木桶陳釀的葡萄酒。

1.1.3 固相萃取法（SPE） SPE 是一種用固體材料吸附樣品中需分析的成分，然后用恰當?shù)南疵搫⒛繕宋锵疵撓聛淼姆椒?。其缺點是方法開發(fā)較復雜、且萃取小柱的成本較高，但其因具有集樣品中目標物質(zhì)的富集與凈化為一體、重現(xiàn)性較好等優(yōu)點而被應用在飲料酒的香氣物質(zhì)分析中[4,17,28]。應用該方法時，吸附劑和洗脫劑的選擇是關(guān)鍵，需依據(jù)待處理的樣品基質(zhì)而定。用在飲料酒中香氣物質(zhì)分析的吸附劑主要為LiChrolut–EN[4,17,28]，洗脫劑主要有二氯甲烷、乙醚、戊烷等。如在葡萄酒的香氣物質(zhì)分析中[17]，酒樣通過填料吸附后，用二氯甲烷進行洗脫，59 種葡萄酒中的香草醛等香氣成分被成功分析出來；在白酒香氣物質(zhì)鑒定中[28]，用戊烷、乙醚對經(jīng)吸附后的酒樣洗脫，包括香草醛在內(nèi)的多種香氣物質(zhì)被鑒定出來；在黃酒香氣物質(zhì)分析中[4]，用二氯甲烷作洗脫劑，香草醛等微量揮發(fā)性香氣成分被順利分析出。

1.1.4 固相微萃取法（SPME） SPME 應用在飲料酒微量成分分析中，主要為頂空固相微萃?。╤ead-space SPME，HS-SPME）。HS-SPME 是一種利用被分析物在萃取頭與萃取基質(zhì)之間達到平衡時的分配系數(shù)和吸附量的差異來進行分離濃縮的方法[19]。該法優(yōu)點較多，如無需溶劑且集采樣、萃取、濃縮為一體，操作簡便、快速，但也存在萃取效果會受到諸多因素如萃取頭、萃取溫度、基質(zhì)等嚴重影響的缺點，尤其是存在萃取頭對某些極性強、含量低的揮發(fā)性物質(zhì)響應差的缺點，故該方法在飲料酒香草醛的分析方面應用不多，目前主要集中在陳釀葡萄酒中有較高含量香草醛等香氣成分的分析中[29-30]。尹建邦等[29]利用該法鑒定出了經(jīng)橡木桶陳釀的葡萄酒中的橡木香氣物質(zhì)，香草醛是其成分之一。李蘭曉等[30]采用此法快速檢測了經(jīng)不同橡木制品陳釀的葡萄酒中主要陳釀香氣成分及其變化，香草醛的相關(guān)信息包含在其中。

1.1.5 液-液微萃取法（LLME） LLME 是一種用極少體積有機溶劑萃取一定體積樣品中目標物質(zhì)的方法。其優(yōu)點是只需一步萃取無需多步濃縮樣品的繁瑣操作步驟，是一種快速簡單且無需大量溶劑的萃取方法。但該方法不適合用于樣品中寬范圍的香氣物質(zhì)的全面分析。Ferreira 最早開發(fā)該方法定量分析了葡萄酒中有機酸等極性風味成分[31]，因其操作簡單，隨后逐漸被其他研究者采納用來分析相關(guān)目標物質(zhì)。飲料酒中用HS-SPME 方法難以分析檢測的香草醛用LLME 方法可以完成，LLME 應用在黃酒[4-5]、白酒[32]等香草醛的定量分析中，結(jié)果均比較理想。莫新良等[5]利用此方法對黃酒中的香草醛進行分析，較理想地將黃酒中的香草醛定量出來；趙雅敏等[32]運用LLME 快速定量了70 種不同白酒樣品中的9 種酚類物質(zhì)，香草醛包含在其中。

1.2 飲料酒中香草醛的檢測方法

1.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS） 飲料酒中香草醛等成分經(jīng)預處理后，即可通過儀器來進行檢測分析，檢測儀器通常采用質(zhì)譜，如對黃酒[4-5]、白酒[16,26]、葡萄酒[27,29]等香草醛的檢測分析。隨著儀器的快速發(fā)展，各種高端質(zhì)譜的誕生，飲料酒中香草醛等各種揮發(fā)性物質(zhì)檢測的種類更加豐富，如Zhu 等[33]應用全二維氣相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從醬香型白酒中分離出528 種物質(zhì)，陳雙等[34]同樣用該檢測方法從清香型白酒中檢測到1092 個峰，定性了340 種揮發(fā)性物質(zhì)。

1.2.2 高效液相色譜法（HPLC） 對于熱敏性、沸點比較高或極性強的物質(zhì)的分析，通常選擇HPLC 來進行檢測，配合適當?shù)臋z測器，該方法能夠?qū)ξ镔|(zhì)進行準確的定量。紫外可見吸收檢測器（ultraviolet-visible detector, UVD）[6,20]和二極管陣列檢測器（Diodearray Detection，DAD）[35-36]，在飲料酒中香草醛的分析中應用比較廣泛，Koseki 等[6,20]采用HPLC-UVD定量分析了日本燒酒中酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)香草醛是其陳釀酒中的重要香氣物質(zhì)；之后用同樣方法快速分析了日本燒酒模擬酒中香草醛的形成途徑及其影響因素。Goldberg 等[35]用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器（photodiode array detector，PDAD）分析了12 種國外蒸餾酒中的11 種酚類物質(zhì)，香草醛均被檢測出；Turkoz 等[21]用HPLC-DAD 快速分析了葡萄酒中包括香草醛在內(nèi)的8 種酚類物質(zhì)。Vanbeneden等[36]用高效液相色譜-電化學（electrochemistry detection，ECD）法分析了啤酒老化過程中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vingylguaiacol，4-VG）的降解及其產(chǎn)物的形成，在老化后的啤酒模擬溶液中鑒定到了香草醛。

1.2.3 LC-MS 隨著儀器的快速發(fā)展，LC-MS 被應用在飲料酒化合物分析中，利用此技術(shù)不但能對已知物質(zhì)進行定量分析，同時還能對未知物進行定性鑒定。Pai 等[22]用LC-MS 分析發(fā)現(xiàn)印度啤酒中香草醛的含量均比較低；Gonzalez-Centeno 等[37]用LCMS 研究了橡木在霞多麗葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵和陳釀過程中的作用及相關(guān)香氣物質(zhì)，香草醛是其研究的主要香氣成分之一；Canas 等[23]研究了微氧條件下陳釀過程中葡萄蒸餾酒中的香氣物質(zhì)變化情況，用LC-MS 檢測定性鑒定香草醛等香氣物質(zhì)，用HPLC-UVD 定量分析，發(fā)現(xiàn)在有氧條件下隨著儲存時間的延長，香草醛的含量逐漸增加。

1.3 飲料酒中香草醛的定性定量方法

1.3.1 定性方法 香氣物質(zhì)的定性分析常用的手段為標準品比對法、質(zhì)譜庫比對法、保留指數(shù)對比法。當未知化合物色譜保留值、質(zhì)譜庫信息以及香氣特征與標準品完全一致時，即可得以確認[38]。對于無標準品的化合物，可以采用保留指數(shù)法定性（Retention Index，RI 或Kovats 指數(shù)），相比與用一個參比化合物，這種標定方法更為精確[39]。將保留指數(shù)法與質(zhì)譜譜庫對比法結(jié)合使用是飲料酒中常用的定性方法[4-5,16]。

1.3.2 定量方法 飲料酒中香草醛的定量方法主要有外標定量法和內(nèi)標定量法。外標法定量法方法簡單，只需校正待測組分峰，但對儀器穩(wěn)定性及進樣量的準確性要求較高。內(nèi)標法定量并未嚴格要求進樣量且因內(nèi)標的加入可消除一定的系統(tǒng)誤差，但因在樣品中加入一個組分，易導致面積測量誤差增加[40]。飲料酒中香草醛的定量分析用得比較多的是內(nèi)標法[4-5,9]。

1.4 飲料酒中香草醛的香氣貢獻分析方法

1.4.1 香草醛香氣貢獻的判定 判定飲料酒中風味物質(zhì)香氣貢獻的方法主要有氣相色譜嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術(shù)中的香氣強度分析法（Osme）[16,27]和香氣萃取稀釋分析法（aroma extract dilution analysis，AEDA）[4,11,16]，這些方法和GC-MS 結(jié)合后即可初步判斷香草醛等物質(zhì)的香氣貢獻。Osme 技術(shù)[18]是將預處理濃縮獲得的樣品，直接進樣進行GC-O 分析，其結(jié)果以香氣強度表示。AEDA 法[41]是將預處理濃縮后得到的組分與溶劑以一定比例梯度稀釋，每一個稀釋度樣品進樣進行GC-O 聞香，直到聞不到香氣為止，結(jié)果由FD 值來確定。這兩種方法已普遍應用在飲料酒香草醛等呈香化合物的香氣貢獻分析中。Lee 等[42]用Osme的方法鑒定出了葡萄酒中81 種具有香氣活性的物質(zhì)，香草醛在其中。用AEDA 的方法分析發(fā)現(xiàn)，香草醛在傳統(tǒng)黃酒、機械黃酒和新酒中的FD 值分別為1024、132 和32，是黃酒中的重要香氣貢獻物質(zhì)[4,43]。

GC-O 能夠發(fā)現(xiàn)具有重要貢獻的香氣物質(zhì)，但因基質(zhì)效應的影響，鑒定到的這些物質(zhì)呈現(xiàn)的香氣強度與飲料酒樣品中本身香氣強度存在一定差異，故通常采用香氣活力值（odor activity value，OAV）的大小來確證其重要程度。OAV 是香氣物質(zhì)在飲料酒中的含量與其在相應基質(zhì)中的香氣閾值的比值[41]，OAV＞1，說明該香氣物質(zhì)對酒樣貢獻明顯。Franitza 等[8]研究發(fā)現(xiàn)香草醛在朗姆酒中的FD 為2048，OAV 為42，證實香草醛在該酒中的重要性；趙東瑞[9]發(fā)現(xiàn)香草醛在古井貢酒中的FD≥729，但是其OAV 均小于1，說明白酒基質(zhì)對香草醛的香氣表達有明顯的抑制作用，故在評價香氣物質(zhì)對飲料酒香氣貢獻時，采用多種方法并結(jié)合OAV 是很有必要的。

1.4.2 關(guān)鍵香氣物質(zhì)的香氣重要性驗證 確定了酒樣中重要貢獻的香氣物質(zhì)后，還需進一步對其進行驗證，通常采用香氣重組、香氣缺失實驗完成。在進行香氣重組時，通常對OAV＞1 的物質(zhì)進行香氣重組，如在陳釀黃酒香氣研究中[4]，共鑒定到43 個活性香氣物質(zhì)，卻僅采用31 個OAV＞1 的物質(zhì)進行重組，OAV 為56 的香草醛在其中。鑒于不同物質(zhì)在同一基質(zhì)中可能產(chǎn)生的風味物質(zhì)間的交互作用，在香氣重組時，除了采用OAV＞1 的物質(zhì)，還有必要考慮那些OAV＜1 但FD 值卻很高的物質(zhì)，如在濃香型白酒古井貢酒香氣分析中[9]，共鑒定到60 個香氣物質(zhì)，除采用35 個OAV＞1 的香氣物質(zhì)外，也將另外11 個OAV＜1但FD 值很高的物質(zhì)一起進行重組，香草醛在這11 個物質(zhì)之中。

當重組后的溶液香氣與實際飲料酒樣品香氣相似時，即可確認重組溶液中的香氣物質(zhì)是該酒中的重要香氣貢獻物質(zhì)[4,12]，此時，即可進行缺失實驗。缺失實驗的目的是為確定重組的化合物中某一種或某一類香氣物質(zhì)對該酒風味形成的貢獻，當某一香氣物質(zhì)缺失后，重組溶液的香氣和實際酒樣有顯著性差異時，即可認為該物質(zhì)是關(guān)鍵香氣物質(zhì)。如在陳釀黃酒香氣研究中[4]，缺失實驗證明香草醛、葫蘆巴內(nèi)酯等是黃酒中的香氣貢獻關(guān)鍵物質(zhì)；在濃香型白酒古井貢酒香氣分析中[9]，缺失實驗證明香草醛、苯乙醇等是白酒中的香氣貢獻關(guān)鍵物質(zhì)。

2 飲料酒中的香草醛及其含量分析

按照生產(chǎn)工藝的不同，飲料酒主要分為三大類：發(fā)酵酒、蒸餾酒和配制酒。黃酒與啤酒、葡萄酒并稱為“世界三大發(fā)酵酒”，白酒是世界六大蒸餾酒之一，中國黃酒和白酒是中國獨有的酒種。表1 列出了部分飲料酒中香草醛的含量情況。

表1 飲料酒中香草醛的分析方法及其含量Table 1 Analysis method and content of vanillin in alcoholic beverages

2.1 葡萄酒中的香草醛

關(guān)于葡萄酒中香草醛的研究主要集中在經(jīng)橡木桶陳釀的葡萄酒方面，葡萄酒中香草醛含量為0.66～590000 μg/L[21,43]。相對來說，國外葡萄酒中香草醛的研究起步較早。1984 年，Aiken 等[50]發(fā)現(xiàn)通過橡木桶陳釀過的葡萄酒其香氣物質(zhì)香草醛等產(chǎn)生的香草香、橡木香及調(diào)料香味顯著增加。2002 年，Lopez等[17]定量了西班牙59 種葡萄酒中的27 種重要香氣物質(zhì)，香草醛的含量在白葡萄新酒中為1.43 μg/L，在紅葡萄陳釀酒中為9.60～140.00 μg/L，平均含量為59.00 μg/L。2003 年，Lee 等[42]對美國加利福尼亞州的19 種白葡萄陳釀酒的香氣成分進行了定量分析，香草醛含量為107.00～1172.00 μg/L。2004 年，Culleré等[43]對6 種西班牙紅葡萄酒中的78 種香氣成分進行了定量分析，其中，香草醛的含量為0.66～2.09 μg/L。2018 年，Turkoz 等[21]定量分析了土耳其葡萄酒中包括香草醛在內(nèi)的8 種酚類物質(zhì)，香草醛的含量在10000～590000 μg/L。以上研究表明，不同地區(qū)不同品種的葡萄酒中香草醛的含量差異較大，總的來說，葡萄酒新酒中香草醛含量極低，經(jīng)過陳釀過的特別是橡木桶陳釀過的葡萄酒，其香草醛的含量普遍較高。

我國研究者們對國內(nèi)葡萄酒中香草醛的研究雖然起步較晚，卻對橡木制品陳釀過的葡萄酒中香草醛的定性、定量及其變化規(guī)律等分析得較為透徹。2011 年，尹建邦等[29]定量分析了經(jīng)橡木桶陳釀的赤霞珠葡萄酒中的橡木香氣成分，結(jié)果顯示香草醛含量為754.56 μg/L，是該產(chǎn)區(qū)葡萄酒中含量最高的橡木香氣成分。2015 年，李蘭曉等[30]分析發(fā)現(xiàn)橡木制品類型及陳釀時間對葡萄酒的陳釀香氣有重要影響，通過橡木片陳釀的葡萄酒，香草醛含量在30 d 時達到最高值，此后逐漸減少，而橡木板陳釀的葡萄酒，其含量在90 d 的陳釀過程中一直在增加。

2.2 黃酒中的香草醛

黃酒中香草醛含量在3.40～4058.12 μg/L 之間[4-5]。關(guān)于黃酒香草醛的研究主要集中在國內(nèi)，大多是關(guān)于成品黃酒中香草醛的含量差異、儲存過程中的含量變化及其影響因素等方面的研究。莫新良等[5,44]對中國不同種類黃酒中香草醛進行分析，發(fā)現(xiàn)香草醛的含量為80.12～4058.12 μg/L，陳釀酒中香草醛的含量普遍高于新酒中的含量，說明香草醛主要來源于儲存過程，進一步跟蹤發(fā)現(xiàn)，隨著儲存時間的延長，香草醛的含量在不斷增加，其主要來源于4-VG 的降解，氧氣和溫度有利于香草醛的形成。Chen 等[4,45]綜合分析了陳釀黃酒、新酒及傳統(tǒng)黃酒、機械黃酒中的香氣物質(zhì)，香草醛在這四種黃酒中的含量分別為1460.00、3.40、1180.00 和381.00 μg/L，模擬黃酒缺失實驗證明，香草醛是陳釀黃酒中非常重要的香氣貢獻物質(zhì)?？偟膩碚f，香草醛在黃酒新酒中含量比較低，陳釀有利于香草醛的形成。另外，關(guān)于黃酒生產(chǎn)過程中糖化劑麥曲中的香草醛也有一定的研究，莫新良等[46]通過分析發(fā)現(xiàn)，麥曲中香草醛的總含量為126.00～549.40 μg/kg，腳踏麥曲中香草醛的總含量均高于機械麥曲中的總含量。

2.3 啤酒中的香草醛

關(guān)于啤酒中香草醛的研究較少，可能與啤酒新鮮度有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，新鮮啤酒中香草醛的含量較低甚至沒有，但陳釀或老化一段時間，其含量則增加。Pai 等[22]分析印度啤酒中的酚類物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，香草醛的含量在2.43～20.54 μg/L 之間。Scholtes 等[47]研究發(fā)現(xiàn)香草醛在12 種新鮮啤酒中的含量范圍為2.30～113.80 μg/L，在陳釀14 個月的啤酒中，其含量達到了180.00 μg/L。Vanbeneden 等[36]對啤酒老化過程中4-VG 的降解及其產(chǎn)物的形成進行了分析，發(fā)現(xiàn)在老化后的啤酒模擬溶液中，鑒定到了香草醛和羅布麻酚兩種香氣物質(zhì)，二者共占4-VG 減少量的85%，氧氣有助于香草醛的形成。

2.4 白酒中的香草醛

白酒中香草醛的含量為0.54～306.00 μg/L[9,48]，白酒香型眾多，不同香型、不同種類香草醛差異較大。傅玉書等[15]估測了茅臺酒中的香草醛含量為30 μg/L；趙雅敏等[32]分析發(fā)現(xiàn)，香草醛在醬香型、濃香型和清香型白酒中的平均含量分別為128.20、86.40 和89.00 μg/L，含量范圍分別為66.00～255.70、0.00～130.50 及73.60～111.50 μg/L，而威士忌中香草醛平均含量為1734.30 μg/L，含量范圍為1154.20～2180.30 μg/L。趙東瑞等[9]定量分析結(jié)果顯示古井貢酒中香草醛的濃度為210.00～306.00 μg/L。史冬梅等[48]對中國白酒103 種樣品中的6 種酚類物質(zhì)進行分析，香草醛在94 種白酒中被檢出，其含量為0.54～279.18 μg/L。陳璐等[49]對古井貢酒原酒香氣成分在蒸餾過程中的變化進行研究，結(jié)果表明，香草醛在不同餾分中的含量隨著蒸餾時間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢，香草醛的含量變化范圍為5.98～40.10 μg/L。綜合目前的各種研究，不難發(fā)現(xiàn)，白酒中香草醛的研究主要集中在成品酒各香型白酒中香草醛含量方面，雖有對生產(chǎn)中的蒸餾過程中香草醛的含量變化進行了分析，但并未在白酒中陳釀過程及其影響因素等方面進行系統(tǒng)研究。

3 飲料酒中香草醛的形成機制

關(guān)于香草醛在飲料酒中形成機理的研究，主要集中在葡萄酒、啤酒、黃酒和日本燒酒等飲料酒釀造及貯存過程。飲料酒的原輔料通常來源于植物，而植物細胞壁中的阿魏酸、木質(zhì)素、丁香酚等物質(zhì)作為前體均可通過化學或生物的途徑轉(zhuǎn)化形成香草醛，其中，阿魏酸的轉(zhuǎn)化和木質(zhì)素的降解是香草醛的重要來源[1,14,51]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在飲料酒釀造和貯存過程中，香草醛的形成主要是通過阿魏酸的非氧化脫羧反應代謝途徑轉(zhuǎn)化和木質(zhì)素的降解而成的。

3.1 飲料酒中香草醛由阿魏酸的轉(zhuǎn)化形成途徑

3.1.1 結(jié)合態(tài)阿魏酸轉(zhuǎn)化成游離阿魏酸及其相關(guān)的酶 阿魏酸，即4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是自然界中極其豐富的苯丙烯酸衍生物，主要存在于草本植物、木本植物和糧谷殼等細胞壁中。農(nóng)副產(chǎn)品如麥麩、米糠和甜菜糖漿等，均含有數(shù)量不等的阿魏酸[14]。在植物細胞壁中，阿魏酸很少以游離態(tài)的形式存在，大多與各種碳水化合物以糖苷鍵、酯鍵等相連。在谷物的細胞壁中，阿魏酸的單體和多種二聚體主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上，因此，要獲得游離阿魏酸，需打破阿魏酸與多聚糖之間連接的酯鍵[42]。通過化學法（酸、堿、熱）或酶的水解作用，可以使植物中結(jié)合的阿魏酸游離出來。其中，在酶的水解中，阿魏酸酯酶是水解阿魏酸酯鍵的一種關(guān)鍵酶[52]。

阿魏酸酯酶（EC3.1.1.73，ferulic acid esterase,FAE）又稱肉桂酸酯酶，屬于羧酸酯水解酶的一個亞類，是一種能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來的胞外酶。若和其它酶如纖維素酶、半纖維素酶或木聚糖酶協(xié)同作用，更加有利于阿魏酸的釋放。因為纖維素酶和半纖維素酶能夠降解植物細胞壁中的多聚糖，從而有助于阿魏酰酯酶和結(jié)合態(tài)的阿魏酸酯的接觸[53]。

3.1.2 飲料酒中阿魏酸轉(zhuǎn)化成香草醛的途徑 由阿魏酸降解產(chǎn)生香草醛的途徑非常復雜，綜合概括主要有四條代謝途徑，分別是：非氧化脫羧反應、側(cè)鏈還原、不依賴于輔酶A 的去乙酰反應和依賴于輔酶A 的去乙酰反應[1]。

其中在非氧化脫羧反應中，阿魏酸首先脫羧形成4-VG，然后4-VG 再氧化形成香草醛，在反應基質(zhì)中還有極少部分的副產(chǎn)物香草酸和愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生[1]。已有的研究發(fā)現(xiàn)，在飲料酒釀造和貯存過程中香草醛的形成主要是通過阿魏酸的非氧化脫羧反應這條代謝途徑轉(zhuǎn)化而成的[20,44,54]，具體代謝途徑見圖1。

圖1 飲料酒中阿魏酸轉(zhuǎn)化成香草醛的形成途徑Fig.1 Pathways of vanillin formation from the degradation of ferulicacid in alcoholic beverages

Koseki 等[20]研究了日本燒酒shochu 模擬酒中香草醛的形成途徑，發(fā)現(xiàn)該途徑是由原料細胞壁中的結(jié)合態(tài)阿魏酸水解成游離的阿魏酸后，再脫羧形成4-VG，4-VG 再氧化成香草醛，香草醛又可轉(zhuǎn)化成香草酸。其中，4-VG 是在蒸餾過程中產(chǎn)生的，香草醛和香草酸是在儲存過程中形成的。香草醛的形成與儲存溫度、基質(zhì)pH、酒精度有關(guān)。2008 年，Vanbeneden 等[36]分析了啤酒貯存過程中香草醛的形成途徑，證明香草醛是由4-VG 轉(zhuǎn)化而來，其中氧氣和溫度有利于此反應的進行。Mo 等[54]對黃酒發(fā)酵過程中阿魏酸和4-VG 的變化進行了跟蹤，發(fā)現(xiàn)在黃酒釀造過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，阿魏酸和4-VG 的濃度逐漸增加，發(fā)酵的前5 d 上升幅度較大，第6 d后上升緩慢，并且證明阿魏酸和4-VG 的產(chǎn)生源于麥曲而不是酵母。2016 年，莫新良等[44]對黃酒中香草醛的形成及其影響因素進行了研究，發(fā)現(xiàn)香草醛是4-VG 降解的主要產(chǎn)物，氧氣、溫度及儲存時間有利于香草醛的形成。

3.1.3 阿魏酸轉(zhuǎn)化成香草醛過程中的相關(guān)微生物將植物細胞壁中結(jié)合態(tài)阿魏酸轉(zhuǎn)化為游離阿魏酸的阿魏酸酯酶，主要由真菌、細菌等產(chǎn)生，如曲霉（Aspergillus）[55]、青 霉（Penicillium）[56]、乳 酸 菌（Lactic acid bacteria）[52]、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[57]和鏈霉菌（Streptomyces）[58]等產(chǎn)生，表2 列出了文獻報道中的部分相關(guān)微生物。

由阿魏酸降解產(chǎn)生香草醛的途徑中，與之相關(guān)的微生物主要有真菌（如黑曲霉（Aspergillus niger）、白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）等）[59-60]；某些細菌（如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[61]、阿氏芽胞桿菌（Bacillus aryabhattai）[62]、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）[63]、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）[64]和鏈霉菌（Streptomyces）[58]等）（見表2）。綜合表2 發(fā)現(xiàn)，細菌分泌阿魏酸酯酶的效果比真菌要好，產(chǎn)生阿魏酸或香草醛的含量也比真菌的多。故細菌是該途徑中香草醛形成的重要微生物。

表2 香草醛形成過程中的相關(guān)微生物Table 2 Different microorganisms involved in synthesis of vanillin

3.2 飲料酒中木質(zhì)素的降解形成香草醛的途徑

木質(zhì)素是一種由苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的、具有復雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子物質(zhì)，主要由對羥基苯丙烷、紫丁香基丙烷和愈創(chuàng)木基丙烷單元通過醚鍵和碳-碳鍵隨機聚合而成，不同植物纖維原料木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)組成不同，當受到溫度、酸度、化學試劑等影響時，木質(zhì)素被水解或氧化降解形成單體或低聚物[65-66]。

研究發(fā)現(xiàn)，當飲料酒用橡木桶長期儲存時，飲料酒中的酒精、酸度及微量氧氣等有助于橡木木質(zhì)素的降解、木質(zhì)素單體或低聚成分的溶出及陳釀香氣成分的形成，其中能深刻影響陳釀香氣的幾種重要的橡木揮發(fā)性成分有香草醛、丁香醛等，在此過程中，橡木木質(zhì)素降解形成香草醛等香氣化合物融入飲料酒中，其降解途徑主要包括部分水解，醚鍵和碳-碳鍵的斷裂，脫甲氧基化、烷化和縮合反應，在較低溫度的溫和條件下，醚鍵和碳-碳鍵斷裂，生成酚類單體、二聚體和寡聚體化合物，再轉(zhuǎn)化成香草醛等香氣物質(zhì)[66]，具體代謝途徑模型見圖2。香草醛是橡木浸漬物的主要成分，具有令人愉悅的香草和香子蘭甜香香氣，對飲料酒的風味品質(zhì)及酒質(zhì)風格起到重要作用[3,13,67]。

圖2 飲料酒中木質(zhì)素降解形成香草醛的代謝途徑模型Fig.2 Metabolic pathway model of vanillin formation from the degradation of lignin in alcoholic beverages

3.3 飲料酒中香草醛來源的鑒別

要呈現(xiàn)香草醛的特有風味，未經(jīng)過長時間橡木桶陳釀的飲料酒很難達到相應濃度要求，新酒若達到則存在人為添加的可能，而添加合成香草醛香精以呈現(xiàn)其甜香風味的酒，將被歐盟法規(guī)（European Commission, EC，Regulation No. 110/2008）所禁止[68]。因此，關(guān)于鑒別和區(qū)分飲料酒中香草醛甜香及香草香風味的真實來源（是來源于自然發(fā)酵或陳釀產(chǎn)生還是外來添加的合成香精）的研究，受到國外該領(lǐng)域范圍內(nèi)研究的重點關(guān)注。Van 等[68]用氣相色譜-同位素比質(zhì)譜儀檢測分析了48 種蒸餾酒樣品中的香草醛的來源，發(fā)現(xiàn)不同來源的香草醛所具有的δ13C 值不同，人為添加合成香草醛香精的蒸餾酒中的13C 值和自然產(chǎn)生的完全不同。來源于橡木桶陳釀的蒸餾酒中香草醛的δ13C 值為-28.9‰～-25.7‰，而人為添加合成香草醛香精的蒸餾酒中香草醛的δ13C 值為-32.5‰～-29.3‰，能夠被很好的區(qū)分開來，為甄別是否是人為添加香草醛人工合成添加劑來源的飲料酒提供了好的鑒定依據(jù)。

4 結(jié)語

香草醛是飲料酒中重要的風味和生物活性物質(zhì)，然而現(xiàn)階段仍缺乏對香草醛分析的有效方法，這些缺陷可能存在樣品預處理上，也可能在GC-O 階段香草醛的香氣被其它物質(zhì)所掩蓋而無法鑒定，亦或是關(guān)鍵香氣的構(gòu)成是香草醛等幾種香氣物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果。這些問題的解決，需要開發(fā)一些新的研究策略來完成，但無論如何，最后仍然需要進行定性定量、GC-O、OAV 分析，并進行香氣重組與缺失試驗。

對香草醛的產(chǎn)生路徑及代謝相關(guān)微生物，有部分研究通過相關(guān)性分析、參與代謝的酶及陳釀過程影響因素等層面進行了探討，這也有助于解析飲料酒中香草醛的產(chǎn)生機理、改善飲料酒風味。隨著新技術(shù)的開發(fā)及組學的廣泛使用，使得全面揭示飲料酒生產(chǎn)過程中香草醛的代謝機制成為可能，如在研究生物代謝香草醛中，可以香草醛關(guān)鍵結(jié)構(gòu)為靶向，采用代謝組學的研究思路解析其代謝，在宏基因組解析傳統(tǒng)發(fā)酵過程中與香草醛代謝相關(guān)的微生物的基礎(chǔ)上，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組及宏蛋白質(zhì)學方法，考察相關(guān)微生物代謝酶的轉(zhuǎn)錄或翻譯情況，以驗證微生物功能，從而構(gòu)建香草醛代謝圖譜。

飲料酒中香草醛的含量與其品質(zhì)關(guān)系密切，目前，國內(nèi)相關(guān)研究比較薄弱，雖在黃酒和葡萄酒中有一定的研究，但在白酒中的研究尤其是其在形成機理方面的研究非常欠缺。白酒作為中國的國酒，其香型眾多，釀造工藝、釀造微生物、釀造環(huán)境千差萬別，不同地域不同香型的白酒形成了其獨特的風格，其中香草醛的含量也差異顯著。未來對白酒中香草醛的研究，應集中在不同地區(qū)、不同香型白酒以及同一香型白酒不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)中香草醛的檢測分析方法、含量差異、變化規(guī)律、影響因素等方面，以此探尋并明晰白酒中香草醛的形成機制，通過優(yōu)良自然微生物發(fā)酵或良好的貯存條件對其進行調(diào)控，以期為更好的提高白酒中香草醛的含量，最終達到有效控制白酒品質(zhì)的目的提供基礎(chǔ)。