新型氮雜環(huán)卡賓鉑(Ⅱ)配合物的抗腫瘤活性研究

梁冰冰，唐成飛，何娟，姚華剛

(廣東藥科大學(xué)中山校區(qū)醫(yī)藥化工學(xué)院，中山 528400)

以順鉑為基礎(chǔ)的鉑類抗腫瘤藥物在臨床上取得巨大的成功，目前鉑類藥物仍然是癌癥治療的首選藥物[1-4]。與分子靶向藥物比較，順鉑具有療效顯著、治療費用少、抗瘤譜廣等優(yōu)勢，適合癌癥患者使用。但鉑類藥物毒副作用(腎毒性、耳毒性及神經(jīng)毒性等)，水不穩(wěn)定及耐藥性問題在一定程度上限制其臨床使用[5]，促使人們尋找能替代順鉑的更高效、廣譜、無毒的新型金屬抗癌藥物，如鉑氮雜環(huán)卡賓配合物。1991年，ARDUENGO 等[6]首次分離得到游離氮雜環(huán)卡賓(N-heterocyclic carbene，NHC)，NHC是一種中性雙電子供體，因此易與缺電子試劑發(fā)生反應(yīng)生成新的物質(zhì)。NHC 在與金屬結(jié)合時，其所形成的 C-M 鍵強于 P-M 鍵，這種金屬氮雜環(huán)卡賓配合物除了應(yīng)用于化學(xué)反應(yīng)的催化外，近年來，過渡金屬(銀、金、銠和鉑等)NHC配合物在抗腫瘤活性研究中也顯示出良好的抗腫瘤活性[7-8]。本研究主要對已經(jīng)設(shè)計合成的兩種金屬鉑配合物4和5(以下簡稱配合物4和配合物5)，通過進行細胞毒性、細胞攝取、定位細胞死亡方式等，然后進一步探討它們的抗腫瘤活性和機制。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器 紫外-可見分光光度計(美國Varian公司 ，型號：Cary 300 )；熒光分光光度計(日本島津公司，型號： RF-301PC)；多功能酶標儀(瑞士 Tecan 公司 ，型號：Infinite M200 Pro)。

1.1.2試藥 噻唑藍 (MTT，批號：C10769615)、Hoechst染料、Annexin V-FITC試劑盒、Caspase-Glo?試劑盒、雙抗(青霉素-鏈霉素)(批號：2199839)均購于Sigma Aldrich公司；BCA試劑盒( Novagen Inc，USA )； 電致化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(Amersham Inc，USA)；聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(Millipore，USA )；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)(高糖型)，批號：8129333)、RPMI1640 培養(yǎng)基(批號：8129119)、澳洲胎牛血清(批號：2292602)均購于Hyclone Laboratoreis Inc.公司；正辛醇(批號：20190625)、無水乙醇(批號：20190701)均購于Alfa Aesar公司。

1.2配合物的合成 配合物的合成方法見文獻[9-10]。結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 鉑類金屬配合物4和配合物5的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3細胞系及培養(yǎng)情況 人類宮頸癌細胞(HeLa)、人類非小細胞肺癌細胞(A549)、耐順鉑非小細胞肺癌細胞(A549R)、人乳腺癌細胞(MCF-7)和人類正常肝細胞(LO2)均來自中山大學(xué)實驗動物中心。 A549和A549R 細胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中每毫升含青霉素100 U和鏈霉素100 μg。細胞置于細胞組織培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，置于37 ℃ 恒溫箱，箱內(nèi)輸入氣體為 5%二氧化碳(CO2)和 95%空氣。耐順鉑細胞A549R使用添加順鉑 RPMI 164 培養(yǎng)，從而維持細胞對順鉑的耐藥性。細胞實驗中所有細胞均加二甲亞砜(DMSO) (1%，V/V)作為對照組。

1.4親水親脂系數(shù)實驗 配合物的親水親脂系數(shù)(lgPO/W)經(jīng)正辛醇/水經(jīng)典搖瓶法測定[11]。

1.4.1預(yù)飽和 取等體積的正辛醇和超純水混合，溶液放在搖床上以200×g搖動震蕩，預(yù)飽和48 h，靜置分層，分別獲得預(yù)飽和的水相和正辛醇相，標記存放。

1.4.2鉑類金屬配合物樣品溶解分配 稱取少量樣品置于15 mL離心管中，分別加入預(yù)飽和的水相和正辛醇相各5 mL，將溶液置于水平搖床，以200×g搖動震蕩48 h 。靜置分層，分別得到配合物兩相溶液，以15 000 r·min-1離心5 min，濾過，去除未溶解的樣品沉淀。

1.4.3紫外吸收光譜測定 以甲醇為稀釋劑，等濃度稀釋兩相，分別測定吸光度(A值)。測定時，參比池中要相應(yīng)加入等體積不含藥物的預(yù)飽和水相或正辛醇相。盡量保證正辛醇和水相的甲醇稀釋體積相同，當藥物在某相中分配過少(配合物多為水相)，可考慮增加所取體積進行測試，但要將吸光度(A)值除以相應(yīng)擴增比例。

1.4.4親水親脂系數(shù)的計算 lgPO/W=lg(AO/AW) ，式中AO與AW分別為配合物特定波長下正辛醇及水相中的A值。

1.5細胞攝取實驗 將HeLa細胞懸液加入到含有DMEM培養(yǎng)基的 100 mm Corning培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，放入培養(yǎng)箱中，待細胞長至約 70%時，將鉑配合物4或配合物5樣品加入到培養(yǎng)皿中，濃度10 μmol·L-1，孵育 12 h，同時以沒有加入藥物處理的細胞作為對照組。 孵育結(jié)束后，將各個培養(yǎng)皿中HeLa細胞分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)1～2 mL洗滌3次，加入 胰酶2 mL進行消化2 min，然后加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基4 mL吹打均勻，離心4 min，棄去上清液，重復(fù)洗滌2或3次；加入PBS 2 mL，吹打均勻，使其充分形成單細胞懸液，分別用于提取核、線粒體、總細胞[8]。

1.6蛋白免疫印跡分析 將HeLa細胞接種于 Corning 的 100 mm 的細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng) 24 h后，分別加入配合物2.5，7.5 μmol·L-1，孵育 12 h，棄去皿中培養(yǎng)基，用細胞刮收集所有細胞，用預(yù)冷的 PBS 洗滌2次，加入 RIPA 細胞裂解液在冰上裂解細胞，離心，收集上清液。用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離目標蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜浸泡于封閉液中，室溫振搖2 h。然后與相應(yīng)的一抗( β-actin，γH2AX )孵育于4 ℃，振搖過夜。用含辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的二抗于室溫孵育1 h 。最后是用增強的ECL試劑盒進行信號檢測[12]。

1.7細胞電鏡拍攝實驗 將HeLa細胞接種于Corning 的 100 mm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的配合物，于培養(yǎng)箱中避光孵育 12 h，然后不經(jīng)漂洗直接用細胞刮收集貼壁和懸浮細胞，離心，收集細胞要肉眼可見細胞沉淀至粒徑2～5 mm，輕輕加入電鏡固定液1 mL，緩緩移入4 ℃冰箱暫存，4 ℃冰袋運輸，在保存和運輸過程中固定液切勿冷凍結(jié)冰。

1.8Caspase-3/7酶活性檢測 Caspase-3/7酶活性通過Caspase-Glo?試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書測定。

目前，工業(yè)裝配外骨骼主要類型有3種：第1種是以瑞士NOONEE公司[5]研發(fā)的Chairless chair為代表的椅子型工業(yè)外骨骼，它主要用于生產(chǎn)裝配車間，為工人提供長時間靜態(tài)支撐；第2種是以法國RB3D公司[6]研發(fā)的HERCULE V3為代表的力量輔助型外骨骼，它主要用于力量輔助、重物搬運和工具操控；第3種是以美國洛克希德馬丁公司[7]推出的FORTIS為代表的工具支撐型外骨骼，它應(yīng)用范圍廣，可以輔助支撐多種類型工具。

2 結(jié)果

2.1配合物的親脂親水能力 配合物4和配合物5的lgPo/w分別為(0.99±0.03)和(1.73±0.08)，均為正值，說明二者都是親脂性，并且配合物5脂溶性大于配合物4。

2.2配合物的體外細胞毒性 結(jié)果見表1。對于 HeLa 細胞來說，配合物 4的半數(shù)抑制濃度(IC50)值為(4.4±0.2)μmol·L-1，約是順鉑IC50值的4.0倍，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。配合物 4 對 A549R 細胞毒性約為順鉑對耐藥性細胞的毒性的 5.5倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 配合物對不同細胞株的 IC50值

Tab.1 IC50 values of tested compounds towards different cell lines

表1 配合物對不同細胞株的 IC50值

藥物HelaA549A549R順鉑17.3±1.022.7±1.056.2±3.2配合物44.4±0.2①②2.5±0.510.2±2.7①配合物58.2±0.2①3.8±0.212.2±2.6①藥物LO2MCF-7順鉑20.1±2.329.7±1.2配合物44.2±2.112.4±2.3配合物56.6±0.614.2±2.1

①與順鉑比較，t=15.58～30.34，P<0.05；②與配合物5比較，t=22.03，P<0.05。

①Compared with cisplatin，t=15.58-30.34，P<0.05；②Compared with complex 5，t=22.03，P<0.05.

2.3ICP-MS細胞攝取實驗 ICP-MS 結(jié)果表明，加藥 12 h 后處理腫瘤細胞的各細胞器，并且檢測其中鉑含量。結(jié)果表明，配合物4和配合物5在總細胞中鉑含量都明顯高于順鉑；經(jīng)過配合物4和配合物5處理后，細胞內(nèi)鉑主要分布在細胞核中，其中配合物5的總細胞攝取量高于配合物4，更高于順鉑的總攝取。

2.4配合物導(dǎo)致DNA損傷的研究 免疫印跡分析結(jié)果(圖3 )表明，配合物 4 在 425 nm 光照條件下能使 HeLa 細胞γH2AX 蛋白的磷酸化水平升高，并且對配合物具有濃度依賴性，配合物 4 能有效誘導(dǎo) DNA 損傷。

圖2 配合物的ICP-MS攝取實驗結(jié)果

圖3 配合物4對HeLa細胞γH2AX蛋白表達水平的影響

2.5配合物的細胞電鏡拍攝 掃描電鏡拍攝結(jié)果可以看出，與對照組細胞比較，配合物4處理的細胞空泡化現(xiàn)象比較明顯，放大倍數(shù)后觀察到細胞核膜破裂不完整、染色質(zhì)的染色體因發(fā)生濃縮而變深，以及凋亡小體的形成。見圖4。

圖4 電鏡下觀察配合物4對HeLa細胞的影響

3 討論

KIEIN等[13]合成Mono-Pt 配合物具有顯著的抗腫瘤活性，同時研究表明其配合物能夠通過自噬方式引起細胞死亡。為了研究已設(shè)計合成的金屬鉑配合物(Ⅱ)的生物活性，筆者進行相關(guān)實驗進行說明。本研究中配合物的親脂親水系數(shù)，結(jié)果表明，配合物4和配合物5均是親脂性的，說明配合物能夠通過主動運輸?shù)姆绞竭M入細胞。并且配合物5的脂溶性大于配合物4，說明配合物5比配合物4更容易進入細胞，從而發(fā)揮作用。

為了研究配合物對腫瘤細胞的殺傷作用，利用MTT檢測的方法進行，實驗結(jié)果表明配合物 4是這幾種金屬化合物中抗腫瘤活性最好的，其IC50值低于順鉑，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時配合物4對A549R細胞的毒性約為順鉑的5.5倍，說明配合物 4 能夠有效地克服順鉑的耐藥性。與配合物5比較，配合物 4 具有較高的細胞毒性(P<0.05)，說明將具有共軛面積更大的苯并喹啉配體與甲基苯硫醚配體配位，能夠有效協(xié)同增加鉑配合物的抗腫瘤活性。與配合物5比較，配合物4較好的抗腫瘤活性與其較高的脂溶性及高細胞攝取效率有關(guān)。

由于合成的配合物能夠有效殺死腫瘤細胞，但其在進入細胞后的分布也是需要關(guān)注的問題。ICP-MS 實驗結(jié)果表明，加入配合物 12h 后對細胞進行處理，檢測各細胞器中鉑含量，結(jié)果配合物4和配合物5進入細胞都主要聚集在細胞核中，其中配合物5 的總細胞攝取量明顯高于順鉑；同時也高于配合物4的總細胞攝取量，這與配合物的脂溶性結(jié)果是一致的，表1的結(jié)果顯示配合物5 的脂溶性比配合物4 的好。與此同時，ICP-MS結(jié)果還可以看出配合物4的細胞器分布中，細胞核的鉑含量分布明顯高于線粒體等細胞器，表現(xiàn)出較好的細胞毒性和分布選擇性，因此配合物4更具有進一步的研究價值。

已有研究表明，該類金屬鉑配合物進入細胞后主要集中在細胞核中，破壞腫瘤細胞核內(nèi)結(jié)構(gòu)，如核內(nèi)DNA，發(fā)揮殺死腫瘤細胞的作用[14]。γH2AX 蛋白是細胞核內(nèi)DNA相關(guān)特征性的抗體蛋白，配合物4能有效誘導(dǎo)核DNA的損傷，且濃度越高損傷越大，從而可以推斷在高濃度的配合物的作用下，腫瘤細胞能夠被有效的通過核損傷被殺死，達到有效抗腫瘤作用。通過掃描電鏡拍攝結(jié)果可以看出，配合物4處理后腫瘤細胞出現(xiàn)比較明顯的空泡化現(xiàn)象以及凋亡小體的形成，空泡化和凋亡小體是細胞晚期凋亡的主要特征。說明該配合物進入細胞后引起細胞的凋亡，通過這種凋亡的方式殺傷腫瘤細胞。

細胞凋亡的主要標志性的原因過程目前多認為是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 ( caspase ) 的被活化[15]。用Caspase-Glo試劑盒分析測定 caspase-3/7 的活性是否因為配合物的作用發(fā)生改變。實驗結(jié)果表明，配合物4和配合物5能夠激活腫瘤細胞的caspase-3/7 的活性，且具有濃度依賴性。這表明配合物引起細胞凋亡依賴于Caspase-3/7酶的激活。

綜上所述，本研究對設(shè)計合成的兩種新的金屬鉑(Ⅱ)配合物4和配合物5進行生物試驗，細胞攝取定位實驗研究表明，兩種配合物進入細胞后均定位在細胞核中，并且這些配合物在正常條件下表現(xiàn)相比順鉑具有較強的細胞毒性(P<0.05)，而且配合物 4 比配合物 5 表現(xiàn)得更明顯(P<0.05)。同時機制研究表明配合物 4在腫瘤細胞中顯著誘導(dǎo) DNA 的損傷，caspase-3/7 活性實驗結(jié)果表明配合物在高濃度時對腫瘤細胞的影響是造成細胞的凋亡(P<0.05)。本研究結(jié)果對于卡賓配合物的抗腫瘤研究具有一定的參考價值，為類似新藥的設(shè)計合成提供了一定的研究基礎(chǔ)。

①與對照組比較，t=7.22～12.80，P<0.05。