SATB1介導(dǎo)上調(diào)Snail/Slug信號通路促進(jìn)直腸癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤預(yù)后分析

李彥 潘烽平 彭勃 李海強(qiáng) 張明明 周莉

隨著現(xiàn)代外科全直腸系膜切除術(shù)（TME）理論的廣泛認(rèn)可和應(yīng)用以及術(shù)前新輔助放、化療的開展，直腸癌患者在保證腫瘤根治前提下的極限保肛手術(shù)屢見不鮮，但仍有5%~40%的患者術(shù)后發(fā)生局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［1］。究其原因，考慮與手術(shù)殘留但又未被常規(guī)病理學(xué)發(fā)現(xiàn)的危險(xiǎn)轉(zhuǎn)移灶有關(guān)。研究表明，腫瘤在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，其分子水平及生化代謝水平方面已發(fā)生異常改變，出現(xiàn)功能異常的癌基因產(chǎn)物或產(chǎn)物表達(dá)增強(qiáng)，并由此引出腫瘤微轉(zhuǎn)移與腫瘤分子切緣的概念，并可將腫瘤微轉(zhuǎn)移作為評估腫瘤分子切緣的標(biāo)準(zhǔn)之一。本文回顧性分析80例直腸癌患者的臨床資料，通過SATB1介導(dǎo)Snail/Slug信號通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化評估腫瘤微轉(zhuǎn)移，分析直腸癌標(biāo)本切緣及區(qū)域淋巴結(jié)腫瘤微轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后相關(guān)性，探討SATB1介導(dǎo)上調(diào)Snail/Slug信號通路促進(jìn)直腸癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤預(yù)后的指導(dǎo)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年5月至2016年5月本院80例直腸癌患者的臨床資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）中低位直腸癌Dixon術(shù)式，除外Mile’s及Hartmann術(shù)式，腫瘤均位于腹膜反折處或腹膜反折以下；（2）均為M0，除外有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）直腸癌初次治療，除外曾行腫瘤局切或曾行術(shù)前新輔助放化療；（4）單純直腸癌，除外罹患其它惡性腫瘤患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后需進(jìn)一步行放療；（2）術(shù)中下切緣快速冰凍病例切片提示陽性而需補(bǔ)切除；（3）術(shù)后石蠟病理回報(bào)下切緣或環(huán)周切緣陽性患者。其中男41例，女39例，平均年齡（63.1±9.3）歲。所有患者手術(shù)均由同一組醫(yī)生完成，手術(shù)方式均為DIXON術(shù)式，所有標(biāo)本采集均獲得本人同意并簽署知情同意書，報(bào)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法 （1）標(biāo)本取材及資料收集：下切緣組織、正常腸黏膜組織、腫瘤組織標(biāo)本取材時(shí)間均為手術(shù)中標(biāo)本離體后立即進(jìn)行；環(huán)周切緣標(biāo)本及區(qū)域淋巴結(jié)標(biāo)本取材與病理科環(huán)周切緣取材同步進(jìn)行。標(biāo)本取材后立即放入-80 ℃深低溫冰箱保存。患者臨床資料包括：一般資料（性別、年齡、BMI值等）、T分期、N分期、TNM分期、腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、腫瘤直徑（cm）、KRAS及NRAS基因突變情況、微衛(wèi)星DNA穩(wěn)定性、術(shù)后化療完成情況及術(shù)后隨訪情況（時(shí)間依賴生存狀態(tài)，包括無瘤生存時(shí)間、局部復(fù)發(fā)時(shí)間、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間三個(gè)時(shí)間控制點(diǎn)）等指標(biāo)。（2）RNA提取和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）：提取總RNA，將2 μl RNA溶液在核酸測定儀檢測RNA260/280 OD值，測定RNA濃度，于-80 ℃保存；將1 μl RNA及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒置入冰上融化，70 ℃水浴中孵育5 min，低速離心后42 ℃60 min，70 ℃10 min上機(jī)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 第一鏈，反應(yīng)產(chǎn)物置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩YBR? Green Realtime PCR Master Mix反應(yīng)體系（引物序列見表1），95 ℃變性60 s，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸15 s，PCR反應(yīng)共40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)后繪制溶解曲線，應(yīng)用MJ Opticon Monitor 3.0分析軟件計(jì)算得Ct值，然后以GAPDH mRNA作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最后計(jì)算各標(biāo)本RNA相對表達(dá)量。（3）Western blotting分析：提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，每個(gè)樣本取40 μg分別加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）的樣本孔中進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到甲醇浸泡后的PVDF膜，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min，麗春紅染液染色，5%脫脂牛奶封閉，兔抗人SATB1單克隆抗體（1∶1000）、鼠抗人Snail單克隆抗體（1∶1000）、兔抗人Slug多克隆抗體（1∶2000）、兔抗人E-cadherin多克隆抗體（1∶1500）、兔抗人Vimentin多克隆抗體（1∶500）、鼠抗人GAPDH多克隆抗體（1∶700），一抗4 ℃過夜孵育。洗滌膜3次并在室溫下與二抗孵育2 h。使用超敏型ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑進(jìn)行顯色，用UVP凝膠成像儀檢測蛋白灰度并拍照成像。

表1 SATB1及Snail/Slug信號通路基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法，患者預(yù)后（時(shí)間依賴生存狀態(tài)，包括無瘤生存時(shí)間、局部復(fù)發(fā)時(shí)間、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間三個(gè)時(shí)間控制點(diǎn)）的相關(guān)因素行COX多因素分析，生存率影響采用Kaplan-Meier法，并制作生存曲線，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 局部復(fù)發(fā)患者與無瘤生存患者SATB1及EMT各標(biāo)志基因表達(dá)比較 80例患者隨訪時(shí)間40~67個(gè)月，平均（53.6±12.6）月，無瘤生存67例，局部復(fù)發(fā)9例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移4例（肝轉(zhuǎn)移1例、肺轉(zhuǎn)移1例，合并肝肺轉(zhuǎn)移2例），無死亡患者。局部復(fù)發(fā)患者相比無瘤生存患者切緣及區(qū)域淋巴結(jié)組織中SATB1、Snail及Slug表達(dá)明顯增加，E-cadherin表達(dá)減少，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者相比無瘤生存患者SATB1表達(dá)增加。RT-qPCR結(jié)果顯示：相比無瘤生存患者（SATB1、E-cadherin、Snail及Slug相對表達(dá)量分別為：3.014±0.361、1.081±0.141、2.211±0.343及2.431±0.413），局部復(fù)發(fā)患者SATB1（5.135±0.713；t=2.776，P=0.0091）、Snail（3.714±0.453；t=2.698，P=0.0094）及Slug（3.981±0.676；t=2.837，P=0.0086）表達(dá)均顯著增高，E-cadherin表達(dá)減少（0.713±0.131；t=2.031，P=0.0371）；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者SATB1（4.417±0.676；t=2.351，P=0.0215）表達(dá)增高，Snail（2.341±0.416）、Slug（2.576±0.348）及E-cadherin（1.098±0.067）表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Western blotting分析結(jié)果同以上結(jié)論。

2.2 SATB1及EMT各標(biāo)志基因（E-cadherin、Snail及Slug）行RT-qPCR及Western blotting檢測結(jié)果結(jié)合Spearman法檢驗(yàn)時(shí)間依賴生存狀態(tài)相關(guān)性分析 （1）當(dāng)預(yù)后以無瘤生存為時(shí)間控制點(diǎn)時(shí)，E-cadherin表達(dá)與無瘤生存時(shí)間呈正相關(guān)（r=0.817，P<0.05），SATB1表達(dá)與無瘤生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.571，P<0.05），Snail表達(dá)與無瘤生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.667，P<0.05），Slug表達(dá)與無瘤生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.883，P<0.05）；（2）當(dāng)預(yù)后以局部復(fù)發(fā)為時(shí)間控制點(diǎn)時(shí)，E-cadherin表達(dá)與局部復(fù)發(fā)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.341，P<0.05），SATB1表達(dá)與局部復(fù)發(fā)時(shí)間呈正相關(guān)（r=0.856，P<0.05），Snail表達(dá)與局部復(fù)發(fā)時(shí)間呈正相關(guān)（r=0.754，P<0.05），Slug表達(dá)與局部復(fù)發(fā)時(shí)間呈正相關(guān)（r=0.431，P<0.05）；（3）當(dāng)預(yù)后以遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為時(shí)間控制點(diǎn)時(shí)，SATB1表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)間呈正相關(guān)（r=0.616，P<0.05），見圖1。

2.3 COX多因素分析 （1）當(dāng)預(yù)后以無瘤生存為時(shí)間控制點(diǎn)時(shí)，T分期、TNM分期、腫瘤分化程度、SATB1、Snail及Slug均為影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，其中SATB1表達(dá)增加為獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。（2）當(dāng)預(yù)后以局部復(fù)發(fā)為時(shí)間控制點(diǎn)時(shí)，T分期、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑（cm）、術(shù)后化療完成情況、SATB1、E-cadherin、Snail及Slug均為影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，其中SATB1表達(dá)增加為獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。（3）當(dāng)預(yù)后以遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為時(shí)間控制點(diǎn)時(shí)，T分期、N分期、TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、術(shù)后化療完成情況、SATB1均為影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，其中SATB1表達(dá)增加為獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。

圖1 SATB1及Snail/Slug信號通路基因表達(dá)與時(shí)間依賴生存狀態(tài)相關(guān)性分析

3 討論

傳統(tǒng)方法判斷直腸癌手術(shù)標(biāo)本切緣主要基于對切緣組織的常規(guī)病理學(xué)（即細(xì)胞形態(tài)學(xué)）觀察，然而在常規(guī)病理學(xué)診斷為切緣陰性患者中，仍有10%~30%患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2］。究其原因，考慮常規(guī)病理學(xué)對形態(tài)上（或表型上）與正常細(xì)胞無可見差異的癌前細(xì)胞或具有潛在轉(zhuǎn)化能力的“正常”細(xì)胞無區(qū)分能力有關(guān)，這就引出腫瘤微轉(zhuǎn)移的概念。腫瘤微轉(zhuǎn)移是指用常規(guī)影像學(xué)、病理學(xué)方法不能檢出的非血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)小簇或單個(gè)癌細(xì)胞的微小轉(zhuǎn)移灶，是多種惡性腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在因素。STAB1是人類組織特異性核基質(zhì)域DNA結(jié)合蛋白，位于人3號染色體短臂2區(qū)3帶，是人類T細(xì)胞的增殖和分化過程中一種必不可缺少的調(diào)控蛋白［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)，SATB1表達(dá)上調(diào)與多種類型的侵襲性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤相關(guān)，包括胃癌，乳腺癌，膀胱癌，肝癌和前列腺癌等。這些結(jié)果均表明，SATB1是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素，SATB1過表達(dá)的患者常預(yù)后不佳，是研究腫瘤治療的靶點(diǎn)［4］。SATB1可通過介導(dǎo)Snail/Slug信號通路參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），在細(xì)胞分化胚胎發(fā)育過程中扮演重要的調(diào)控角色，也是影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移重要步驟［5］。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失標(biāo)志著腫瘤發(fā)生EMT，也是EMT過程發(fā)生的基礎(chǔ)與核心。

FU等［6］研究表明，惡性腫瘤可以通過構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒而使SATB1表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，并通過構(gòu)建干擾質(zhì)粒下調(diào)細(xì)胞中SATB1表達(dá)使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤向正常形態(tài)轉(zhuǎn)變，提示SATB1表達(dá)的下調(diào)可以逆轉(zhuǎn) EMT過程。本研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)，局部復(fù)發(fā)的中低位直腸癌患者相比無瘤生存患者切緣及區(qū)域淋巴結(jié)組織中SATB1、Snail及Slug表達(dá)明顯增加，而E-cadherin表達(dá)減少；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者相比無瘤生存患者切緣及區(qū)域淋巴結(jié)組織中SATB1表達(dá)增加。LAMBERT等［7］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中，通過構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒而上調(diào)SATB1表達(dá)可促進(jìn) E-cadherin抑制因子Snail和Slug表達(dá)，繼而抑制E-cadherin表達(dá)，最終誘發(fā)腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生。而TARHAN等［8］研究發(fā)現(xiàn)SATB1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡，并影響患者預(yù)后，與患者預(yù)后不良存在明顯相關(guān)性，促進(jìn)腫瘤侵襲和進(jìn)展。在本研究中，腫瘤切緣組織中E-cadherin表達(dá)與患者無瘤生存時(shí)間呈正相關(guān)，與局部復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)；而SATB1、Snail及Slug表達(dá)與患者無瘤生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，與局部復(fù)發(fā)呈正相關(guān)；SATB1表達(dá)與患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。表明SATB1表達(dá)增加可通過介導(dǎo)Snail/Slug信號通路調(diào)控直腸癌切緣腺上皮組織間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，與直腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移潛能顯著相關(guān)。

研究表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在細(xì)胞分化過程中起重要調(diào)控作用，也是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移最重要的一步。EMT發(fā)生后，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性，細(xì)胞間基質(zhì)緊密鏈接減少，細(xì)胞進(jìn)而獲得間質(zhì)特性，導(dǎo)致細(xì)胞通路基因表達(dá)發(fā)生改變，繼而細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)行為發(fā)生改變，使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，此種侵襲性表型細(xì)胞產(chǎn)生特異性降解蛋白酶進(jìn)而降解基底膜而有利于腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移［9］。本研究中結(jié)果也支持點(diǎn)，COX多因素風(fēng)險(xiǎn)比例模型檢驗(yàn)提示，E-cadherin表達(dá)減少、Snail及Slug表達(dá)增加主要是影響患者無瘤生存為時(shí)間及腫瘤局部復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，但無論預(yù)后為何種時(shí)間依賴生存狀態(tài)，SATB1表達(dá)增加為獨(dú)立性危險(xiǎn)因素。表明EMT可有效評估腫瘤微轉(zhuǎn)移，是腫瘤原位侵襲和遠(yuǎn)處遷徙、進(jìn)展的基礎(chǔ)。本研究僅在分子水平的基因和蛋白層面證實(shí)了直腸癌微轉(zhuǎn)移與SATB1及EMT標(biāo)志基因的表達(dá)密切相關(guān)，至于SATB1是通過何種途徑誘導(dǎo)EMT過程，是直接調(diào)控EMT標(biāo)志基因（如E-cadherin、Snail及Slug等），還是通過其他信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)調(diào)控EMT過程，SATB1是否在細(xì)胞生物學(xué)水平直接影響直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為，還有待進(jìn)一步研究。

結(jié)合RT-qPCR及Western blotting在中低位直腸癌手術(shù)患者標(biāo)本切緣及區(qū)域淋巴結(jié)的檢測結(jié)果及患者的預(yù)后情況，作者分析ATB1表達(dá)可能通過Snail/Slug信號通路抑制E-cadherin而介導(dǎo)中低位直腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生。在常規(guī)病理學(xué)檢測為陰性的中低位直腸癌手術(shù)標(biāo)本的切緣及區(qū)域淋巴結(jié)組織中，SATB1的過表達(dá)可作為評估患者腫瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素，并進(jìn)一步評估腫瘤分期分級及患者腫瘤負(fù)荷來預(yù)測組織發(fā)生腫瘤微轉(zhuǎn)移，提示患者發(fā)生腫瘤局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)患者術(shù)后行放、化療、靶向及免疫治療等腫瘤綜合治療的必要性，為提高直腸癌個(gè)體化綜合治療精準(zhǔn)性提供新的理論依據(jù)。