三葉青地上部分總黃酮提取物制備工藝優(yōu)化研究

余文靜，蔡韋煒，陳 丹，熊朝棟，廖淑彬

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

三葉青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）又稱三葉崖爬藤，屬葡萄科崖爬藤屬植物，是我國珍稀中藥材，也是福建省特色中草藥［1］，具有清熱解毒、活血止痛、祛風(fēng)化痰等功效，民間常用于小兒高熱、多種炎癥及肝病的治療［2］，野生三葉青主要分布于我國福建、江西、浙江、臺(tái)灣、廣東等省，文獻(xiàn)記載始見于清代吳其濬的《植物名實(shí)圖考》［3］。近年來，三葉青因其突出的抗腫瘤、保肝和免疫調(diào)節(jié)等作用已被臨床廣泛應(yīng)用［4-6］，人工栽培基地建設(shè)已逐漸開展?！逗鲜≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》［7］《浙江省中藥炮制規(guī)范》［8］和《福建省炮制規(guī)范》［9］收載了三葉 青藥材及飲片，以全草或塊根入藥。課題組前期研究表明，三葉青組分復(fù)雜，主要活性成分為黃酮類和酚酸類；三葉青地上部分及其提取物具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛作用，黃酮類成分是其主要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［10-16］。因此，本研究以總黃酮含量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)［11，16］，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)法，優(yōu)化三葉青地上部分總黃酮提取物（THAA）提取工藝及大孔吸附樹脂純化工藝，提高三葉青地上部分總黃酮純化率，為THAA藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及制劑研究奠定質(zhì)量穩(wěn)定的原料藥基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)［尤尼柯（上海）儀器有限公司］；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；pH計(jì)［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試劑 異葒草苷-2"-O-鼠李糖苷對(duì)照品（自制，純度98%）；三葉青藤莖葉（寧化縣益珍農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定）；水為純化水；甲醇、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 THAA總黃酮含量測定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱定干燥至恒重的異葒草苷-2"-O-鼠李糖苷對(duì)照品12.30 mg，置50mL量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL中含0.2460 mg異葒草苷-2"-O-鼠李糖苷）。

2.1.2 供試品溶液制備 ①醇提取供試品溶液：精密量取提取液適量，置25mL量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。②洗脫純化供試品溶液：精密量取洗脫液適量，置25mL量瓶，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。③THAA供試品溶液：精密稱取THAA約20 mg，置25mL量瓶中，用50%甲醇超聲溶解并放至室溫，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 測定方法 精密吸取供試品溶液2.0mL，置25mL量瓶中，加50%甲醇至6mL，精密加入5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻，放置6 min，再精密加入10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻，放置6 min，精密加入4%氫氧化鈉試液10.0mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min；以50%甲醇同法配制溶液為空白，在500 nm波長處測定吸光度。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下異葒草苷-2"-O-鼠李糖苷對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下自“加50%甲醇至6mL”起同法操作顯色，測定，以異葒草苷-2"-O-鼠李糖苷對(duì)照品的濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異葒草苷-2"-O-鼠李糖苷在9.84～59.04μg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A＝1.119×10-2C－2.350×10-3，r＝0.9996。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)考察設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)針對(duì)影響三葉青地上部分飲片乙醇回流提取中影響總黃酮含量的主要因素，考察提取溶劑乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間等關(guān)鍵因素，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)的水平及固定條件。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 提取工藝單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察條件

2.2.2 提取溶劑乙醇濃度影響 分別取三葉青地上部分藥材粗粉3g，精密稱定，共5份，分別用30%、45%、60%、75%、90%乙醇溶液，以1∶25的料液比，加熱回流2h，趁熱過濾，得濾液。按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下同法操作測定總黃酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮類物質(zhì)的提取量隨乙醇濃度的提高而增加，但乙醇濃度超過75%時(shí)黃酮類物質(zhì)提取量反而下降。提示選擇45%、60%、75%作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步考察乙醇濃度因素項(xiàng)的三個(gè)水平。結(jié)果見圖1A。

2.2.3 料液比影響 分別取三葉青地上部分藥材粗粉3g，精密稱定，共5份，分別用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的料液比，以75%乙醇，加熱回流2h，趁熱過濾，得濾液。按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下同法操作測定總黃酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨料液比增高，黃酮類物質(zhì)的提取量逐漸增高，至1∶30后黃酮類物質(zhì)的提取量維持在較高水平基本不變。提示選擇料液比1∶30及上下各1個(gè)水平即1∶25、1∶30、1∶35作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步考察料液比因素項(xiàng)的三個(gè)水平。結(jié)果見圖1B。

2.2.4 提取時(shí)間影響 分別取三葉青地上部分藥材粗粉3g，精密稱定，共5份，以1∶25的料液比、75%乙醇，分別加熱回流1、1.5、2、2.5、3h，趁熱過濾，得濾液。按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下同法操作測定總黃酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間在2 h內(nèi)，黃酮類物質(zhì)的提取量隨時(shí)間增高，2 h后隨提取時(shí)間延長，黃酮類物質(zhì)的提取量反而降低。提示選擇加熱回流時(shí)間2 h及上下各1個(gè)水平即1.5、2、2.5 h作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步考察提取時(shí)間因素項(xiàng)的三個(gè)水平。結(jié)果見圖1C。

圖1 提取條件影響因素考察結(jié)果

2.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表，對(duì)提取關(guān)鍵影響因素乙醇濃度（因素A）、料液比（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）四個(gè)因素，以總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素及水平

2.2.6 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 分別取三葉青地上部分藥材粗粉3g，精密稱定，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)方案進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下同法操作測定總黃酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取次數(shù)和乙醇濃度是影響三葉青地上部分總黃酮提取的主要因素，具有顯著性差異。影響因素由大到小順序?yàn)樘崛〈螖?shù)（D）＞乙醇濃度（A）＞料液比（B）＞提取時(shí)間（C）。由極差分析可知，采用60%乙醇和75%乙醇為提取溶劑對(duì)總黃酮的提取影響極小，故從節(jié)約成本考慮，確定最佳提取工藝組合為A2B1C2D3。結(jié)果見表3、表4。

表3 正交設(shè)計(jì)L9（34）及試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.2.7 提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證優(yōu)選的三葉青地上部分總黃酮提取工藝的穩(wěn)定性和合理性，按照最佳提取工藝條件分別提取試驗(yàn)3批。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該提取工藝穩(wěn)定可靠，三葉青地上部分粗提物平均得率19.70%，3批粗提物中總黃酮含量分別為29.21、28.98、28.77mg／g。結(jié)果見表5。

表5 3批三葉青地上部分粗提物總黃酮含量測定結(jié)果（n＝3）

2.3 大孔吸附樹脂純化工藝優(yōu)化

2.3.1 上樣液制備 稱取三葉青地上部分粗提物適量，用水溶解成相應(yīng)濃度，離心，取上清液作為上樣液。

2.3.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理與再生 預(yù)處理，取各型號(hào)大孔吸附樹脂以2倍體積的95%乙醇浸泡24h，充分溶脹后裝于柱中，用95%乙醇洗至流出液加水（1∶5）不渾濁，再改用大量蒸餾水沖洗，洗至無醇味，蒸餾水浸泡備用。

簡單再生，用95%乙醇沖洗至流出液無色或不再變淺，然后用蒸餾水沖洗至無醇味，即完成簡單再生。

強(qiáng)化再生，在柱內(nèi)加入高于樹脂層10cm的3%～5%鹽酸溶液浸泡2～4h，然后用3 BV鹽酸溶液通柱，再用蒸餾水洗至接近中性；繼續(xù)用3%～5%的氫氧化鈉溶液浸洗2～4 h；再同上法用3 BV同濃度的氫氧化鈉溶液通柱，最后再用蒸餾水清洗至pH值為中性，再用2～3 BV乙醇洗柱，然后用蒸餾水洗去乙醇，即完成強(qiáng)化再生。

2.3.3 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附量及解吸率的考察及選擇 分別取預(yù)處理后抽濾至不滴水的HPD100、D101、X-5、AB-8、NKA-9、HDP826六種型號(hào)大孔吸附樹脂各1g，精密稱定，分別置于100mL錐形瓶中，加入濃度相同的總黃酮提取液各25mL，恒溫振蕩24h，使樹脂充分吸附，濾過，得濾液1。按下式計(jì)算樹脂飽和吸附量。

式中，C0為提取液中黃酮濃度（mg／mL），C1為濾液1中黃酮濃度（mg／mL），V1為加入的提取液體積（mL），W為大孔吸附樹脂質(zhì)量（g）。

取充分吸附后的大孔吸附樹脂，吸干表面后，分別置于100mL錐形瓶中，精密加入50mL 95%乙醇，繼續(xù)恒溫振蕩24h，使黃酮解吸附，濾過，得濾液2。按下式計(jì)算樹脂的解吸率。

式中，C2為濾液2中黃酮含量（mg／mL），V2為所加乙醇的體積（mL），Q為樹脂吸附黃酮的量（mg），W為大孔吸附樹脂質(zhì)量（g）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附性能考察，HDP100大孔吸附樹脂的吸附量和解吸率最佳。故確定選擇HPD100大孔吸附樹脂純化三葉青地上部分總黃酮。結(jié)果見表6。

表6 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附性能的考察

2.3.4 動(dòng)態(tài)吸附中水洗量考察 取上樣液適量，上樣吸附于20mL柱體積經(jīng)預(yù)處理后的樹脂柱中，吸附一定時(shí)間后，蒸餾水沖洗，流速2 BV／h，每10mL收集一份洗脫液，Molish反應(yīng)和鹽酸-鎂粉反應(yīng)跟蹤監(jiān)測，確定水洗體積為4 BV。

2.3.5 動(dòng)態(tài)吸附中洗脫溶劑選擇 取上樣液適量，上樣吸附于20mL柱體積經(jīng)預(yù)處理后的樹脂柱中，吸附一定時(shí)間后，蒸餾水沖洗，棄去水洗液，再依次用5 BV的10%、20%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脫，解吸附，流速2 BV／h，收集每0.5 BV流出液，按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下同法操作測定總黃酮含量，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，總黃酮濃度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，40%乙醇能解吸附大部分總黃酮，故選擇40%乙醇為最佳洗脫溶劑。結(jié)果見圖2A。

2.3.6 動(dòng)態(tài)吸附中洗脫劑用量的考察 取上樣液適量，上樣吸附于20mL柱體積經(jīng)預(yù)處理后的樹脂柱中，蒸餾水沖洗，棄去水洗液，再用40%乙醇、流速2 BV／h洗脫，收集0～10.0 BV流出液，按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下同法操作測定總黃酮含量，繪制洗脫曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.5～2.0 BV的40%乙醇洗脫液中，黃酮含量均較高，故確定收集的40%乙醇洗脫液體積為0.5～2.0 BV。結(jié)果見圖2B。

圖2 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果

2.3.7 設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定最佳動(dòng)態(tài)吸附條件 為獲得總黃酮提取物純化工藝中的最佳動(dòng)態(tài)吸附條件，通過考察上樣濃度、上樣流速、上樣pH、徑高比四個(gè)主要因素，各取三個(gè)水平設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。試驗(yàn)方案見表7。

表7 正交試驗(yàn)因素水平表

根據(jù)L9（34）正交因素水平表試驗(yàn)，總黃酮純度和得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，精密量取一定體積上樣液上柱，吸附一定時(shí)間后，4 BV蒸餾水洗脫后棄去，40%乙醇洗脫，收集0.5～2.0 BV洗脫液，合并洗脫液，減壓濃縮，40℃下真空干燥，得三葉青地上部分總黃酮提取物（THAA）棕色粉末，測定總黃酮純度，計(jì)算總黃酮得率。

綜合得分＝0.5×總黃酮含量（%）＋0.5×總黃酮得率（%）。

采用綜合評(píng)分法對(duì)各因素水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)總黃酮純化的綜合評(píng)分的影響大小順序?yàn)镃（上樣液pH）＞D（徑高比）＞A（上樣液濃度）＞B（上樣流速），上樣液濃度對(duì)結(jié)果有顯著性影響（P＜0.05），其他影響因影響較小。從節(jié)約時(shí)間、提高效率等綜合考慮，確定THAA最佳純化工藝為A3B2C1D3，即上樣液濃度3mg／mL，上樣流速2 BV／h，上樣液pH＝3，柱徑高比為1∶8。正交試驗(yàn)結(jié)果見表8，方差分析結(jié)果見表9。

表8 正交設(shè)計(jì)L9（34）試驗(yàn)結(jié)果

表9 方差分析

2.3.8 上樣量的考察 取20mL柱體積預(yù)處理好的樹脂，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選的吸附條件，以每10mL為一流份接收40%乙醇洗脫液，按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下同法操作測定總黃酮含量，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，總黃酮含量為縱坐標(biāo)，繪制泄露曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)上樣體積小于4 BV時(shí)，洗脫液中黃酮含量平穩(wěn)緩慢增加，當(dāng)上樣體積大于5 BV后，洗脫液中黃酮明顯增加。提示選擇4 BV作為上樣量合適。結(jié)果見圖2C。

2.3.9 樹脂重復(fù)利用次數(shù)考察 試驗(yàn)考察HPD100大孔吸附樹脂經(jīng)簡單再生，再上樣、洗脫，按“2.1.2”和“2.1.3”項(xiàng)下同法操作測定THAA中總黃酮含量及其總黃酮得率，繪制大孔吸附樹脂利用次數(shù)-總黃酮含量的變化趨勢(shì)圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用HPD100大孔吸附樹脂在優(yōu)化工藝條件下純化提取物，經(jīng)簡單再生后重復(fù)利用10次以上，純化的提取物總黃酮含量及總黃酮得率仍保持穩(wěn)定，為確保產(chǎn)品質(zhì)量，故暫定本工藝中大孔吸附樹脂可重復(fù)使用10次。結(jié)果見圖2D。

2.3.10 純化工藝驗(yàn)證 取三葉青地上部分粗提物3批，按照優(yōu)化得到的最佳工藝條件純化，驗(yàn)證以上工藝的可靠性，制成的3批THAA測定總黃酮含量及總黃酮得率，代入正交試驗(yàn)綜合評(píng)分公式分析，證明該工藝穩(wěn)定可行。從三葉青地上部分粗提物制備3批THAA成品，為棕黃色粉末，平均得率為10.77%，折算成從原藥材飲片制備THAA成品平均得率為2.12%。結(jié)果見表10。

表10 3批樣品含量測定結(jié)果（n＝3）

3 討論

實(shí)驗(yàn)建立以THAA效應(yīng)組分群中含量較高的異葒草苷-2"-O-鼠李糖苷為對(duì)照的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定樣品中總黃酮含量［11，16］，作為THAA制備工藝優(yōu)化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。提取溶劑的篩選，曾考察熱水提取法，但提出的雜質(zhì)較多，總黃酮含量遠(yuǎn)低于醇提法。比較超聲提取法，雖然提取效率尚可，但總黃酮含量依然低于回流提取法，綜合環(huán)境污染性、提取成本等因素，實(shí)驗(yàn)選擇乙醇回流提取THAA。但隨提取溶劑乙醇濃度的提高，黃酮類成分提取量增加的同時(shí)脂溶性物質(zhì)溶出也增加，冷卻至室溫時(shí)產(chǎn)生的大量沉淀包裹黃酮類成分，不利于進(jìn)一步純化，其中葉綠素等色素還對(duì)比色法測定產(chǎn)生干擾，故選擇的乙醇濃度不宜過高。

經(jīng)藥材飲片粉碎度考察，實(shí)驗(yàn)中飲片粉碎后如果不能全部通過二號(hào)篩，其中的黃酮類成分提取不完全；如果飲片粉碎后全部通過五號(hào)篩，粉末過細(xì)，提取過程易產(chǎn)生爆沸且易糊化，影響提取過程的安全性及黃酮類成分的溶出。故最終選擇飲片粉碎度為粗粉，即能全部通過二號(hào)篩，但混有能通過四號(hào)篩不超過40%的飲片粉末。由于三葉青地上部分飲片蓬松，吸收溶劑后明顯膨脹。為使其充分浸泡于提取溶劑中，考察料液比參數(shù)選擇在1∶15～1∶35的范圍。

研究從6種大孔吸附樹脂中篩選出對(duì)三葉青地上部分主體黃酮類化合物吸附和解吸附能力最佳的純化用大孔吸附樹脂HPD-100。三葉青地上部分粗提物黃酮類物質(zhì)含量較低，其中部分水溶性較差或吸附性較差，靜態(tài)吸附率較低，動(dòng)態(tài)吸附中可能較快超過泄露點(diǎn)，故上樣液總黃酮濃度一般配制3mg／mL左右，可考察的濃度范圍較窄。影響大孔吸附樹脂分離純化的因素包括上樣濃度、上樣流速、上樣液pH、徑高比等，且各因素間存在交叉影響，故試驗(yàn)采用此4個(gè)主要因素，各取3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化并獲得THAA的最佳純化工藝。采用最佳工藝制備的三葉青地上部分提取物THAA總黃酮含量均達(dá)60%以上，且制備工藝具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，為THAA藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及進(jìn)一步開發(fā)健康制品奠定了基礎(chǔ)。