鐵甲草中齊墩果酸的含量測(cè)定

趙瑩 葉小玲 蘇璐丹

【摘 要】 目的：建立鐵甲草中大黃素和齊墩果酸的含量測(cè)定方法。方法：采用HPLC法測(cè)定鐵甲草中齊墩果酸的含量。Waters XBridge Peptide BEH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-PBS（85∶[KG-*3/5]15），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，測(cè)定齊墩果酸的含量。結(jié)果：齊墩果酸在5～50 μg/mL的濃度范內(nèi)呈良好線性關(guān)系（Y=4533X+909.6，R=0.9996），平均回收率為99.39%，RSD為1.53%（n=6）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確靈敏、穩(wěn)定可靠，可用于鐵甲草中齊墩果酸的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法;鐵甲草;齊墩果酸;含量測(cè)定

Abstract：Objective To establish High Performance Liquid Chromatography methods for the determination of the Oleanolic acid in Cassia mimosoides. Methods HPLC methods were used to determine the quantity of the Oleanolic acid in Cassia mimosoides. The Oleanolic acid analysis was performed on a Waters XBridge Peptide BEH C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）with the mobile phase consisting of methyl alcohol-PBS（85∶[KG-*3/5]15） at 210 nm. The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min and injection volume 10 μL at 35 ℃. Results The Oleanolic acid had a good linear relationship in the concentration range of 5～50 μg/mL （Y=4533X+909.6，R=0.9996）. The average recovery was 99.39% and RSD was 1.53%（n=6）. Conclusion The method is accurate， sensitive， stable and reliable. It can be used for the determination of Oleanolic acid in Cassia mimosoides.

Keywords：High Performance Liquid Chromatography; Cassia mimosoides; Oleanolic Acid; Content Determination

鐵甲草（Cassia mimosoides Linn.）為豆科（Leguminousae）決明屬一年或多年生亞灌木狀草本植物，以全草入藥，主要分布于廣東、福建、云南、臺(tái)灣、貴州和廣西等地，其味甘、性平，具有清肝明目、散瘀化積的功效[1]。有研究結(jié)果表明，鐵甲草能夠有效抑制脂肪酶，防止脂肪肝[2-3];其主要化學(xué)成分有大黃素、齊墩果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素等[4-5]。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鐵甲草的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理作用方面，有關(guān)鐵甲草藥材質(zhì)量控制的研究很少，且未見(jiàn)對(duì)其有效成分進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以鐵甲草中具有抗炎保肝的有效成分齊墩果酸[6]，作為定量檢測(cè)指標(biāo)成分，建立鐵甲草中齊墩果酸的HPLC含量測(cè)定方法，為鐵甲草的質(zhì)量控制和合理開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters Alliance 2695型高效液相色譜儀（Waters公司）; Waters XBridge Peptide BEH C18（4.6mm×250mm，5μm）; WJX-A1000型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）;JP-100S型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）;MING-CHE 24UV超純水機(jī)（法國(guó)Merck Millipore公司）。

齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)：C1723001），購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;鐵甲草采于廣東省梅州市蕉嶺縣，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)翟明老師鑒定為豆科決明屬植物鐵甲草（Cassia mimosoides）的全草;其他試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取齊墩果酸對(duì)照品1mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得。

2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取鐵甲草粗粉2g，加入2moL/L的鹽酸10mL，充分浸潤(rùn)后，在60℃水浴下，酸水解2h，濾渣用超純水水洗至中性，干燥后加入10倍量的90%的乙醇溶液和0.5%NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至8，50℃超聲30 min，抽濾后，水浴加熱濃縮成浸膏。

浸膏用甲醇超聲溶解后，離心取上清液，定容至10mL，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge Peptide BEH C18（4.6mm×250mm，5μm）;流動(dòng)相：甲醇：PBS=85∶[KG-*3/5]15;檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm;流速：1.0mL/min;進(jìn)樣量：10μL，柱溫：35℃。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下的齊墩果酸對(duì)照品0.5、1、2、3、4、5mL溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得濃度為5、10、20、30、40、50μg/mL系列濃度的齊墩果酸對(duì)照品溶液，于“2.3”項(xiàng)下的色譜條件，以齊墩果酸對(duì)照品溶液色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，齊墩果酸對(duì)照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程Y=4533X+909.6，R=0.9996。結(jié)果表明，在5～50μg/mL的濃度范圍內(nèi)，齊墩果酸對(duì)照品溶液的峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

2.5 專(zhuān)屬性考察 取項(xiàng)目“2.1”和“2.2”項(xiàng)所制備的對(duì)照品溶液和供試品溶液，在“2.3”的色譜條件下進(jìn)樣，齊墩果酸的保留時(shí)間約為13.77min，峰型穩(wěn)定，分離度良好，有較好的基線分離，未見(jiàn)雜質(zhì)峰干擾，具有良好的專(zhuān)屬性。如圖1所示。

2.6 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液1.0mL，于“2.3”項(xiàng)的色譜條件下，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μL，檢測(cè)得到大黃素峰面積的RSD為1.36%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0mL，分別于0、2、4、6、8、12h于“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，檢測(cè)得到齊墩果酸的峰面積的RSD為0.82 %。表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取6份等質(zhì)量鐵甲草粗粉2.00g，按“2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，于“2.3”項(xiàng)的色譜條件，檢測(cè)得到齊墩果酸峰面積的RSD為1.47 %。表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的等質(zhì)量鐵甲草粗粉6份，每份2.00g，分別精密加入同一濃度的齊墩果酸對(duì)照品，按上述“2.2”的提取方法平行制備成供試品溶液，于“2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算得到平均回收率結(jié)果為99.39%，RSD為1.53%。表明該方法測(cè)得的結(jié)果有良好準(zhǔn)確性。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取3份不同批藥材各2.00g，按照“2.2”項(xiàng)的制備方法制備成供試品溶液，每份樣品分別在“2.3”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣三次，記錄峰面積，計(jì)算樣品中齊墩果酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

在考察齊墩果酸的色譜條件時(shí)，曾采用甲醇水，甲醇-0.1%甲酸和甲醇-PBS作為流動(dòng)相，考察結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相選擇為甲醇-PBS（85∶[KG-*3/5]15）時(shí)，樣品中齊墩果酸分離度更好，峰型穩(wěn)定，無(wú)雜峰干擾。由于齊墩果酸同時(shí)含有羥基和羧基基團(tuán)，在堿性條件下更易被提取，在提取條件的考察過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)加入適量堿溶液使其pH值至8時(shí)，更利于齊墩果酸成分的提取。

本實(shí)驗(yàn)建立應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定鐵甲草中齊墩果酸含量的方法，方法精密度高、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率均符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求。測(cè)得3批樣品中，齊墩果酸的含量在3.67% ～3.73%之間，含量較高，且齊墩果酸在臨床上主要用于護(hù)肝降酶，與鐵甲草的功效相符，說(shuō)明齊墩果酸適合作為鐵甲草的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)成分，該方法可作為鐵甲草質(zhì)量控制的方法，從而為鐵甲草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考依據(jù)。

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