蒙古族不同齲敏感兒童變形鏈球菌產(chǎn)酸耐酸及耐酸因子遺傳多態(tài)性研究

繆 羽，王昭君，祁安舒

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院口腔科，內(nèi)蒙古 包頭 014030；2.河北經(jīng)貿(mào)大學金融學院）

變形鏈球菌（S.mutans）作為主要的致齲菌，通過粘附、產(chǎn)酸、耐酸等作用導致牙體硬組織脫礦與再礦化的失衡[1～3]。菌細胞經(jīng)糖酵解產(chǎn)生乳酸后口腔pH值降低，釉質(zhì)崩解脫落脫礦，形成齲齒；同時為了適應(yīng)低pH值的口腔環(huán)境，菌細胞通過酸適應(yīng)性或耐酸性維持一個相對中性的胞內(nèi)環(huán)境得以長期生存[4～6]。乳牙齲病發(fā)生與地域、民族、生活習慣均有相關(guān)性[7，8]，蒙古族遺傳多態(tài)性及生活飲食方式對齲病的影響可能存在不確定性。本課題通過蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌的致齲過程分析，為區(qū)域蒙古族齲病防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象及樣本收集

受試者選取2015-09~2015-12包頭市蒙古族幼兒園3~5歲70名的蒙古族兒童（高齲40名，無齲30名）。使用CPI探針在自然光條件下收集上述兒童牙菌斑，無齲兒童選取頰側(cè)面菌斑，高齲兒童取齲病損區(qū)的菌斑。受試兒童取樣前一天晚上不刷牙漱口，第二天早晨不進食喝水，所取牙菌斑置于含硫乙醇鹽轉(zhuǎn)送液的EP管中，上端加液體石蠟密封，冰浴下轉(zhuǎn)送到-20℃的冰箱保存。所有受檢兒童均家長同意，并簽知情同意書。

1.2 診斷標準

點隙窩溝或光滑面有明顯齲洞、釉質(zhì)下破壞、可探及底部發(fā)軟或洞壁的病損為齲。以齲失補牙數(shù)（decayed missing filled teeth，dmft）作為高齲和無齲判定標準，dmft≥5為高齲組，dmft=0為無齲組[9]。

1.3 納入及排除標準

（1）納入標準：①出生于內(nèi)蒙古包頭地區(qū)的蒙古族（三代內(nèi)無與其他民族婚配）；②3~5歲的兒童，乳牙已經(jīng)全部萌出、未發(fā)生脫落，無恒牙早萌現(xiàn)象；③齲壞牙齒未進行充填等治療；④未戴牙齒矯正器者；⑤檢查前一個小時未進食，能夠配合取樣；（2）排除標準：①口腔有除齲病以外其他嚴重感染病灶；②有全身系統(tǒng)性疾病和（或）家族遺傳性疾?。虎垡蚱渌膊〗?個月內(nèi)服用過抗生素等藥物。

1.4 實驗菌株

40例高齲兒童和30例無齲兒童牙菌斑，經(jīng)過培養(yǎng)，形態(tài)學、生化反應(yīng)、16sDNA鑒定，共獲得40株變形鏈球菌臨床分離株（21株來自高齲者，19株來自無齲者），國際參考菌株ATCC 25175（廣東省微生物菌種保藏中心）。

1.5 實驗方法

1.5.1 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株產(chǎn)酸、耐酸能力測定以0.5為間隔配制含5%蔗糖pH值為7.0~4.0的BHI培養(yǎng)基。取國際標準株和臨床分離株菌懸液，按照菌液與液體培養(yǎng)基1：10（v/v）比例接種細菌，37℃厭氧袋內(nèi)培養(yǎng)48h，3000r/min離心15min，收集上清液體，精密酸度計測定上清液體的終末pH值，每個pH值測三次，取平均值，計算pH值變化值△pH值（初始pH值-終末pH值）即產(chǎn)酸能力。同樣條件下，收集培養(yǎng)基內(nèi)的細菌，用4mL無菌生理鹽水稀釋震蕩混勻，紫光分光光度計測定540nm處的吸光度A值即耐酸能力。

1.5.2 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株DNA提取經(jīng)形態(tài)學鑒定的高齲組、無齲組變形鏈球菌臨床分離株接種于選擇培養(yǎng)基上，厭氧袋內(nèi)培養(yǎng)48h，挑取單個菌落于10mL BHI培養(yǎng)基內(nèi)增菌，細菌DNA提取試劑盒提取和純度檢測：提取DNA的A260/280比值在1.7~2.0之間，沒有蛋白質(zhì)和酚的污染，-20℃冰箱保存。

1.5.3 PCR反應(yīng)和uncD擴增依次混勻并離心下列試劑：（1）1μL上游引物（引物1）；（2）1μL下游引物（引物2）；（3）2μL模板DNA；（4）25μL PCRmix；（5）21μL H2O。

uncD擴增：充分擴增PCR反應(yīng)產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)分析，凝膠DNA回收試劑盒回收產(chǎn)物，-20℃冰箱保存。

1.5.4 蒙古族兒童變形鏈球菌耐酸因子F-ATPase亞基uncD基因的RFLP分析uncD選擇限制性內(nèi)切酶是AluI和HinfI。按照酶切條件：37℃恒溫水浴中孵育18h，酶切產(chǎn)物行3%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.5.5 DNA測序40株蒙古族兒童高齲、無齲變形鏈球菌臨床分離株與變形鏈球菌標準菌株進行細菌基因組DNA提取和PCR產(chǎn)物擴增，16SrDNA鑒定，測序結(jié)果在EZTaxon數(shù)據(jù)庫進行Identify比對，利用MEGA軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)進化樹。

2 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析，蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌在pH值7.0~4.0條件下，高齲組和無齲組變形鏈球菌產(chǎn)酸和耐酸能力比較，以、采用獨立樣本t檢驗分析處理（檢驗水準α=0.05，P＜0.05差別有統(tǒng)計學意義）。采用確切概率法分析處理蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌耐酸因子F-ATPase亞基uncD基因分型（P＜0.05為差別有統(tǒng)計學意義）。

3 結(jié)果

3.1 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株產(chǎn)酸能力比較

蒙古族兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株的產(chǎn)酸能力隨著pH值升高而升高；同一pH值條件下，高齲組產(chǎn)酸能力高于無齲組；pH值為7~6、4~4.5時，高齲組和無齲組的產(chǎn)酸能力差別尚無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；pH值為5.0~5.5時，高齲組與無齲組比較差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（見表1）。

表1 pH7.0～4.0條件下不同齲敏感兒童變鏈菌的產(chǎn)酸能力(x±s)

3.2 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株耐酸能力比較

隨著pH值降低，蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離菌株的生長受到抑制；同一pH值，無齲組菌株的生長抑制更明顯；pH值4.5條件下，高齲組與無齲組菌株的耐酸性比較差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其他pH環(huán)境中，兩組間比較差別尚無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（見表2）。

3.3 DNA測序結(jié)果

序列拼接后片段長度1336bp，結(jié)果如下：

表2 pH7.0～4.0條件下不同齲敏感兒童變鏈菌的生長情況(±s)

表2 pH7.0～4.0條件下不同齲敏感兒童變鏈菌的生長情況(±s)

pH值 吸光度A值P值高齲組（n=21） 無齲組（n=19）71.49263±0.0449391.40638±0.0648900.293 6.51.25738±0.0394551.21975±0.0655170.630 61.22225±0.0511611.22063±0.517440.982 5.50.89238±0.0593540.85863±0.0635890.704 50.51988±0.0645430.50413±0.0519710.852 4.50.24913±0.0131450.19850±0.0109560.010 40.16363±0.0104160.16213±0.0092670.916

3.4 樣品的比對和菌株進化

圖1 樣品在EZTaxon數(shù)據(jù)庫上Identify

EZTaxon數(shù)據(jù)庫上進行Identify比對結(jié)果顯示樣品的序列與變形鏈球菌（S.mutans）的序列同源性很高，相似度高達100%。

圖2 菌株系統(tǒng)進化樹

蒙古族兒童高齲組和無齲組變形鏈球菌臨床分離株經(jīng)blast比對和進化樹分析，可確定樣品中的細菌為變形鏈球菌（S.mutans），測序成功。

3.5 變形鏈球菌耐酸因子F-ATP酶的亞基uncD基因分析

以DNA為模板，特異引物擴增基因uncD，約1.3Kb，相對分子質(zhì)量與引物相同，擴增條帶亮度較高，無一雜帶，說明特異性較高（見圖3）。

圖3 變形鏈球菌臨床株F-ATPase亞基uncD基因擴增

通過對蒙古族不同齲敏感兒童變形鏈球菌耐酸因子F-ATPase亞基uncD的AluI-RFLP分析，表現(xiàn)為A和B兩種基因型，且不同耐酸菌株中分布不同，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），高齲組菌株B型居多，無齲組菌株A型居多（見表3）。

表3 蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株耐酸因子F-ATPase亞基uncD基因型分布

4 討論

齲病貫穿于整個生命周期，乳牙齲病的發(fā)生發(fā)展使兒童的身心健康生長發(fā)育受到嚴重威脅。繆羽等調(diào)查[10]包頭市3~5歲兒童患齲率65.7%，充填率僅2.3%，乳牙齲病形勢不容樂觀。本實驗對內(nèi)蒙古包頭地區(qū)3~5歲蒙古族高齲、無齲兒童口腔變形鏈球菌初步分析，認為蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株在pH值7.0~4.0的BHI液體培養(yǎng)基中生長態(tài)勢良好，隨pH值升高產(chǎn)酸能力升高，同時菌株生長受到抑制，耐酸能力影響不一。同一pH值條件下，高齲組產(chǎn)酸能力、耐酸能力均高于無齲組，無齲組菌株生長抑制更明顯；說明高齲組中變形鏈球菌數(shù)量多，齲病敏感性不同，產(chǎn)酸效果與齲病嚴重性相關(guān)，致齲性強。薛晶等人對不同齲敏感人群牙菌斑中變形鏈球菌群的分布的研究發(fā)現(xiàn)，高齲兒童檢出率中位居前列，高達93.3%，無齲組的檢出率僅為50%[11，12]，本研究與其相一致。pH為4~4.5時，無齲組雖然產(chǎn)酸，但與高齲的產(chǎn)酸能力差別無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；pH升至6~7.0時，無齲與高齲的產(chǎn)酸能力差別尚無統(tǒng)計學意義（P>0.05），可能是糖酵解開始發(fā)生和達到最大臨界值時，遺傳主導的變形鏈球菌在不同個體中表現(xiàn)和能力各異，致齲能力結(jié)果不同[13]，這也充分解釋齲病致病因素的宿主個性化特點。pH為5~5.5時，致齲菌生長趨勢下，高齲與無齲產(chǎn)酸能力差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明這一基線水平患齲率、齲壞程度與菌株敏感性相關(guān)。pH值4.5條件下，高齲組與無齲組菌株耐酸性有差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其他pH環(huán)境中，菌株生長受到抑制，兩組間差別尚無統(tǒng)計學意義（P>0.05），在復雜的口腔微生態(tài)環(huán)境中，細菌生存于適合自己的環(huán)境，基因類型及其遺傳多態(tài)性可能是酸反應(yīng)效應(yīng)與齲病結(jié)果不同的原因[14，15]。

本實驗依據(jù)生理生化和16SrDNA相結(jié)合的方法對變形鏈球菌進行鑒定，確定培養(yǎng)篩選的細菌為變形鏈球菌，為下一步實驗研究打下了基礎(chǔ)。變形鏈球菌臨床株F-ATPase亞基uncD基因擴增反應(yīng)條帶清晰，確保了基因型純度。與耐酸有關(guān)的質(zhì)子移位膜ATP酶（membrane-bound proton-translocating F-ATPase）是一種重要的致齲酶，在齲病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的毒力作用，通過排除H+，維持跨膜pH梯度，與細菌的耐酸能力密切相關(guān)，它既增加變鏈菌的致齲性，又發(fā)揮不同齲敏感的競爭能力。本研究對內(nèi)蒙古的蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌的耐酸菌株利用限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性分析和核酸測序比較突變位點，在限制性內(nèi)切酶Alu和Hinf作用下分析發(fā)現(xiàn)uncD的基因型存在A、B兩組基因型，高齲者以B型為主，低齲者以A型為主，且不同耐酸菌株中分布差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05），不同齲敏感性所含的齲病基因數(shù)量、類型有差別，證實了蒙古族口腔變形鏈球菌uncD具有遺傳多態(tài)性。不同種族與齲病相關(guān)性國內(nèi)外也有報道：烏魯木齊市維吾爾族兒童口腔分離的變鏈菌耐酸因子F-ATPase主要功能亞基uncD、uncEBF具有遺傳多態(tài)性，與菌株耐酸能力相關(guān)，不同齲敏感巴西學齡前兒童S.mutans中高齲組攜帶更多的基因型。美國黑人不同齲敏感兒童S.mutans基因多態(tài)性與攜帶基因型呈相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，蒙古族不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌產(chǎn)酸耐酸能力不同，PH值的變化與變形鏈球菌的產(chǎn)酸和耐酸能力有一定關(guān)系，這也提示著齲病的發(fā)生與變形鏈球菌的產(chǎn)酸和耐酸能力有關(guān)，同時，變形鏈球菌的耐酸因子F-ATPase亞基uncD具有遺傳多態(tài)性，與致齲嚴重性相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)uncD具有特殊基因型與種族齲病關(guān)聯(lián)性，這需要我們對蒙古族兒童口腔變形鏈球菌的耐酸因子的其他基因型進一步研究。