高致齲性變異鏈球菌臨床分離株的初步篩選

王成龍　劉佼佼　蘇東華　儲(chǔ)冰峰　李少華　夏偉　羅燕萍　楊繼勇　丁紅梅　趙強(qiáng)　鄧斌　席慶　徐娟　邵寧生

[摘要] 目的 初步篩選高致齲性變異鏈球菌臨床分離株。方法 通過檢測41株變異鏈球菌臨床分離株的產(chǎn)酸能力、耐酸能力、黏附能力和合成細(xì)胞外多糖能力，初步篩選出高致齲性變異鏈球菌臨床分離株。結(jié)果 不同的變異鏈球菌臨床分離株體外致齲能力不同，其中3株產(chǎn)酸能力、耐酸能力、黏附能力和合成細(xì)胞外多糖能力均較高，提示可能為高致齲性變異鏈球菌臨床分離株，另外3株產(chǎn)酸能力、耐酸能力、黏附能力和合成細(xì)胞外多糖能力均較低，提示可能為低致齲性變異鏈球菌臨床分離株。結(jié)論 通過篩選可能獲得了高致齲性變異鏈球菌臨床分離株。

[關(guān)鍵詞] 變異鏈球菌； 產(chǎn)酸； 耐酸； 黏附； 細(xì)胞外多糖； 篩選

[中圖分類號] R 780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.006

變異鏈球菌是人類口腔中的主要致齲菌。研究[1]表明：從高齲患者口腔中分離獲得的變異鏈球菌臨床分離株比從無齲健康人口腔中獲得的分離株具有更強(qiáng)的致齲能力，更易誘發(fā)齲??；也有研究[2]證實(shí)，

不同齲指數(shù)患者口腔中的變異鏈球菌的體外致齲能力是不同的，提示不同個(gè)體齲易感性的差異可能與口腔中變異鏈球菌不同毒力株的致齲能力不同有關(guān)。從臨床上分離鑒定的變異鏈球菌臨床分離株中篩選出具有較高致齲能力的菌株，對于研究齲病的發(fā)病機(jī)理是非常必要的。在以前的研究[3]中，本課題組從臨床上分離鑒定出41株變異鏈球菌臨床分離株，本研究在此基礎(chǔ)上，通過檢測變異鏈球菌臨床分離株的黏附能力、合成細(xì)胞外多糖的能力、產(chǎn)酸能力和耐酸能力，對變異鏈球菌臨床分離株的致齲特性進(jìn)行分析，希望從41株變異鏈球菌臨床分離株中篩選出高致齲性變異鏈球菌株。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

變異鏈球菌國際參考菌株Ingbritt（首都醫(yī)科大學(xué)

附屬北京口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所）；41株變異鏈球菌臨床分離株[3]（從臨床上分離獲得，41株菌株已通過基因分型鑒定為不同基因型，其中1～10號菌株來源于無齲健康人，11～41號菌株來源于高齲患者）。

1.2 菌懸液的制備

將-70 ℃凍存的變異鏈球菌臨床分離株41株及國際參考菌株Ingbritt復(fù)蘇，接種于腦心浸液（brain-heart infusion，BHI）培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h；再分別取各菌株的培養(yǎng)物100 μL，轉(zhuǎn)種于20 mL BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長晚期（OD600約為0.5）。將42株菌株的培養(yǎng)物分別于4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，收集細(xì)菌沉淀物，無菌中性PBS緩沖液洗菌2次，并重懸成菌懸液，細(xì)菌密度約為5×108 CFU·mL-1。

1.3 黏附實(shí)驗(yàn)[4-5]

1.3.1 唾液包被羥磷灰石（saliva-coated hydroxy-

apatite，SHA）的制備 取一健康成人進(jìn)食2 h后的非

刺激性全唾液，冰浴，于4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min，收集上清液，60 ℃水浴30 min以滅活蛋白酶，并用直徑為0.45 μm的無菌針頭式過濾器過濾以去除細(xì)菌和雜質(zhì)，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

在分析天平上準(zhǔn)確稱取羥磷灰石顆粒4 mg，置于1.5 mL Eppendorf管中，高壓滅菌；每管中加入已高壓滅菌的黏附緩沖液200 μL（KCl 50 mmol·L-1、

KH2PO4 1 mmol·L-1、CaCl2 1 mmol·L-1、MgCl2

0.1 mmol·L-1，溶解于蒸餾水并調(diào)pH值至6.8后定容至200 mL），37 ℃水浴平衡過夜；然后吸去黏附緩沖液，每管加入已制備好的唾液100 μL，37 ℃、6 r·min-1旋轉(zhuǎn)2 h，然后吸去唾液，用200 μL黏附緩沖液洗滌2次后，加入100 μL含5 g·L-1牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的黏附緩沖液，37 ℃、6 r·min-1旋轉(zhuǎn)30 min，吸去液體，再用黏附緩沖液洗滌3次，即制備成SHA。

1.3.2 SHA黏附實(shí)驗(yàn) 分別取各變異鏈球菌臨床分離株和國際參考菌株的菌懸液100 μL加入到含有4 mg SHA的Eppendorf管中，在37 ℃厭氧條件下，6 r·min-1旋轉(zhuǎn)90 min；吸去菌液，用500 μL黏附緩沖液洗滌3次以去除未黏附的菌體細(xì)胞；吸去液體，每管加入200 μL無菌中性PBS緩沖液和無菌玻璃珠，用旋渦振蕩器振蕩混勻120 s，將已黏附至SHA上的菌體細(xì)胞從其上脫離下來并懸浮于中性PBS緩沖液中，即為原液。將原液用中性PBS緩沖液做10倍系列稀釋，取10-2和10-3稀釋液各100 μL，分別接種于輕型唾液鏈球菌-桿菌肽瓊脂（mitis salivarius with bacitracin

agar，MSB）培養(yǎng)平板內(nèi)，厭氧環(huán)境（80%N2、10%H2、

10%CO2）下，37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)培養(yǎng)平板上形成的菌落數(shù)并結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算得到各菌株的菌落形成單位（CFU·mL-1），以間接反映菌株的黏附能力。每個(gè)樣品一式三份，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 合成細(xì)胞外多糖實(shí)驗(yàn)[6-7]

1.4.1 菌株細(xì)胞外多糖的制備 分別取各變異鏈球菌臨床分離株和國際參考菌株的菌懸液，按菌液與培養(yǎng)基體積比為1∶10的比例將其接種至含1%蔗糖的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h，將各菌株24 h培養(yǎng)物經(jīng)4 ℃、5 000 r·min-1離心30 min，收集上清液后，細(xì)菌沉淀物用等同于培養(yǎng)基體積的蒸餾水洗滌并離心2次，合并3次上清液，作為水溶性細(xì)胞外多糖；水洗后的細(xì)菌沉淀物中加入等體積的0.5 mol·L-1 NaOH洗滌并離心3次，合并上清液，作為水不溶性細(xì)胞外多糖。兩部分上清液各取5 mL，分別加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃放置過夜，離心后棄水相；再分別于沉淀中加入5 mL的蒸餾水和0.5 mol·L-1 NaOH將其溶解，用蒽酮法測定水溶性及水不溶性細(xì)胞外多糖的含量。每個(gè)樣品一式三份。

1.4.2 蒽酮法測定細(xì)胞外多糖含量 分別取葡聚糖稀釋液0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80 mL，加入蒸餾水至1.00 mL，于15 ℃水浴中加入0.2%蒽酮-硫酸液3.00 mL，攪拌3 min后放入95 ℃水浴中煮6 min，冷卻；加樣于96孔板中，每孔100 μL，每個(gè)樣品一式三份；然后于酶聯(lián)反應(yīng)檢測儀630 nm處測定吸光度值OD630，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取樣品1.0 mL，于15 ℃水浴中加入0.2%蒽酮-硫酸液3.00 mL，攪拌3 min后放入95 ℃水浴中煮6 min，冷卻；加樣于96孔板中，每孔100 μL，每個(gè)樣品一式三份；然后于酶聯(lián)反應(yīng)檢測儀630 nm處測定吸光度值OD630。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品中多糖的含量。

1.5 耐酸實(shí)驗(yàn)[8]

分別取各變異鏈球菌臨床分離株和國際參考菌株的菌懸液，按菌液與培養(yǎng)基體積比為1∶10的比例將其分別接種至初始pH值為4.0～7.0（以pH值0.5為間隔）的BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h。將各菌株48 h培養(yǎng)物經(jīng)4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，細(xì)菌沉淀物用5 mL無菌中性PBS緩沖液稀釋，振蕩器上混勻1 min，以無菌中性PBS緩沖液作陰性對照，于可見光分光光度計(jì)600 nm處測定吸光度值OD600。每個(gè)樣品一式三份。

本研究用各菌株在不同pH值條件下OD600的平均值（用x表示）評價(jià)變異鏈球菌臨床分離株耐酸能力的強(qiáng)弱。設(shè)pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時(shí)的OD600測量值分別為x1、x2、x3、x4、x5、x6、

x7，則x=（x1+x2+x3+x4+x5+x6+x7）/7。分別計(jì)算出臨床分離株和國際參考菌株的OD600的平均值，比較其耐酸能力。

1.6 產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)[7-9]

分別取各變異鏈球菌臨床分離株和國際參考菌株的菌懸液，按菌液與培養(yǎng)基體積比為1∶10的比例將其接種至含5%葡萄糖、初始pH值為4.0～7.0（以pH值0.5為間隔）的BHI培養(yǎng)基中，該pH值作為菌株生長前pH值，即pH0；37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)物經(jīng)4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，取上清培養(yǎng)基，pH計(jì)測定pH值，作為菌株生長后pH值，即pH1。計(jì)算菌株代謝產(chǎn)酸，降低培養(yǎng)基pH值的能力，ΔpH=pH0-pH1。每個(gè)樣品一式三份。

本研究用各菌株在不同pH值條件下ΔpH的平均值（用y表示）評價(jià)變異鏈球菌臨床分離株產(chǎn)酸能力的強(qiáng)弱。因?yàn)闇y量結(jié)果顯示，當(dāng)pH值為4.0和4.5時(shí)，各菌株幾乎都不產(chǎn)酸，因此本實(shí)驗(yàn)不進(jìn)行pH值為4.0和4.5時(shí)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。設(shè)pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時(shí)的ΔpH分別為y1、y2、y3、y4、y5，則y=（y1+y2+y3+

y4+y5）/5。分別計(jì)算出臨床分離株和國際參考菌株的ΔpH值，比較其產(chǎn)酸能力。

2 結(jié)果

2.1 變異鏈球菌臨床分離株的黏附能力

變異鏈球菌對牙面的黏附存在非蔗糖依賴性和蔗糖依賴性黏附兩種機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)檢測變異鏈球菌臨床分離株在無蔗糖存在的條件下對SHA的黏附情況，比較各菌株之間黏附能力的差異。

通過計(jì)數(shù)培養(yǎng)平板上形成的菌落數(shù)，并結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算得出各菌株的菌落形成單位（CFU·mL-1），

即黏附量（圖1）。由圖1可見，變異鏈球菌臨床分離株對羥磷灰石的黏附量不同，絕大部分變異鏈球菌臨床分離株的黏附量位于1.5×105～3.5×105 CFU·mL-1之間，僅38、16、33、17和12號變異鏈球菌臨床分離株的黏附量高于此范圍，3、1、5、4和9號變異鏈球菌臨床分離株的黏附量低于此范圍。

2.2 變異鏈球菌臨床分離株合成細(xì)胞外多糖的能力

變異鏈球菌臨床分離株合成水不溶性細(xì)胞外多糖的能力不同，絕大部分變異鏈球菌臨床分離株合成水不溶性細(xì)胞外多糖的量位于0.010～0.020 g·L-1之間，僅17、33、12、2和11號變異鏈球菌臨床分離株合成水不溶性細(xì)胞外多糖的量高于此范圍，5、20、9、4、16、28、37、40和7號分離株合成水不溶性細(xì)胞外多糖的量低于此范圍（圖2）。

2.3 變異鏈球菌臨床分離株的耐酸能力

在不同pH值條件下，各菌株的生長情況明顯不同。隨著pH值的降低，各菌株的生長均受到抑制。當(dāng)外界環(huán)境的pH值持續(xù)降低、酸度繼續(xù)增加時(shí)，對各菌株生長和繁殖的影響繼續(xù)增大，pH值越低，抑制作用就越強(qiáng)。各菌株吸光度值越大，說明該菌株受到pH值變化的影響越小，該菌株的耐酸能力越強(qiáng)。各菌株在不同pH值條件下OD600的平均值測定結(jié)果見圖3：絕大部分變異鏈球菌臨床分離株OD600的平均值位于0.70～0.85之間，僅8、12、1、33、17、2和23號臨床分離株高于此范圍，29、5、21、4、9和26號臨床分離株低于此范圍。

2.4 變異鏈球菌臨床分離株的產(chǎn)酸能力

在不同pH值條件下，各菌株的產(chǎn)酸能力明顯不同。隨著pH值的降低，各菌株的產(chǎn)酸能力均下降。當(dāng)外界環(huán)境的pH值持續(xù)降低、酸度繼續(xù)增加時(shí)，對各菌株產(chǎn)酸能力的影響持續(xù)增大，pH值越低，產(chǎn)酸情況就越差。各菌株ΔpH越大，說明該菌株產(chǎn)酸能力越強(qiáng)。各菌株在不同pH值條件下ΔpH的平均值測定結(jié)果見圖4：絕大部分變異鏈球菌臨床分離株ΔpH平均值位于1.6～1.8之間，僅14、12、33、17和29號臨床分離株高于此范圍，10、4、9、19、5、27和15

號臨床分離株低于此范圍。

2.5 變異鏈球菌高致齲性和低致齲性臨床分離株的

鑒定

設(shè)黏附、合成水不溶性細(xì)胞外多糖、產(chǎn)酸和耐酸4項(xiàng)能力都強(qiáng)的變異鏈球菌臨床分離株為高致齲性分離株，其中任何一項(xiàng)能力不強(qiáng)的，不歸屬于高致齲性菌株之列，低致齲性菌株與高致齲性菌株同理。綜合分析變異鏈球菌臨床分離株黏附、合成水不溶性細(xì)胞外多糖、產(chǎn)酸和耐酸的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)：12、17和33號變異鏈球菌臨床分離株的體外致齲能力均較強(qiáng)，4、5和9號臨床分離株的體外致齲能力均較弱，提示12、17和33號可能為高致齲性臨床分離株，4、5和9號可能為低致齲性臨床分離株。

3 討論

研究[1，9-10]表明：來源于同一患者口腔中的不同

基因型以及不同患者口腔來源的變異鏈球菌臨床分離株的致齲能力存在顯著差異。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：從臨床上分離鑒定的41株變異鏈球菌臨床分離株的黏附能力、合成水不溶性細(xì)胞外多糖能力、產(chǎn)酸能力和耐酸能力存在較大的差異，12、17和33號臨床分離株的體外致齲能力均較強(qiáng)，4、5和9號分離株的體外致齲能力均較弱。根據(jù)該結(jié)果可以推測，從41株變異鏈球菌臨床分離株中可能篩選出了3株高致齲性菌株和3株低致齲性菌株。

對牙面的黏附能力是變異鏈球菌重要的致齲特性之一。全唾液包被羥磷灰石模型是檢測黏附能力的經(jīng)典方法[4]，其優(yōu)勢在于：全唾液可在羥磷灰石顆

粒表面形成與體內(nèi)唾液獲得性薄膜相似的實(shí)驗(yàn)性薄膜，更能準(zhǔn)確地模擬口腔內(nèi)的情況。本實(shí)驗(yàn)采用洗脫培養(yǎng)法來測量各菌株的黏附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：41株變異鏈球菌臨床分離株的黏附量不同，絕大部分菌株的黏附量為1.5×105～3.5×105 CFU·mL-1，國際參考菌株Ingbritt的黏附量也位于此范圍內(nèi)，僅38、16、33、17和12號菌株的黏附量較高，高于此范圍，3、1、5、4和9號菌株的黏附量較低，低于此范圍。

研究[11]證實(shí)：變異鏈球菌主要含有3種葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，GTF），即合成水不溶性葡聚糖的GTF-I和GTF-SI及僅合成水溶性葡聚糖的GTF-S。由于變異鏈球菌需要合成一定量的葡聚糖才能維持較高的黏附力，因此GTF對于介導(dǎo)該菌的黏附十分重要。能夠利用蔗糖合成細(xì)胞外多糖被視為變異鏈球菌致齲的重要因素，而GTF的表達(dá)則是其基本要素[12-13]。細(xì)胞外多糖在菌斑致病過程中的作用是雙重性的，水溶性細(xì)胞外多糖主要作為細(xì)胞外能源儲(chǔ)備形式，有潛在產(chǎn)酸作用；而水不溶性細(xì)胞外多糖的抗水解能力和凝集黏附細(xì)菌作用都很強(qiáng)，不僅能促進(jìn)菌斑的形成，還能作為菌斑的結(jié)構(gòu)成分起作用，并限制了有機(jī)酸的擴(kuò)散，降低了菌斑的pH值。

本實(shí)驗(yàn)采用蒽酮-硫酸法測定水不溶性葡聚糖。糖在強(qiáng)酸溶液中加熱、脫水生成羥醛，再變成呋喃衍生物。此衍生物可與各種試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)，用分光光度計(jì)測得吸光度值計(jì)算出糖含量[12]。本實(shí)

驗(yàn)結(jié)果顯示：41株變異鏈球菌臨床分離株合成水不溶性葡聚糖能力不同，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]，絕大部分菌株合成水不溶性葡聚糖的量位于0.010～0.020 g·L-1之間，國際參考菌株Ingbritt的合成量也位于此范圍內(nèi)，僅17、33、12、2和11號菌株的合成量高于此范圍，5、20、9、4、16、28、37、40和7號菌株的合成量低于此范圍。

牙菌斑中的變異鏈球菌通過酵解局部微環(huán)境中的多種碳水化合物產(chǎn)酸，并能在酸性環(huán)境中生長代謝，避開唾液的緩沖作用，在菌斑微環(huán)境中長時(shí)間維持低pH值，致牙體硬組織脫礦，產(chǎn)生齲損。變異鏈球菌的產(chǎn)酸和耐酸性是致齲的直接原因，是其主要的致齲毒力因子之一。

pH值是細(xì)菌生長和代謝活動(dòng)的重要影響因素。生長環(huán)境的酸化會(huì)使變異鏈球菌細(xì)胞內(nèi)的pH值降低，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性及DNA分子，而糖酵解途徑的酶也對酸敏感。雖然本實(shí)驗(yàn)只確定了培養(yǎng)基的初始pH值，而隨著細(xì)菌的生長代謝，培養(yǎng)基的pH值是不恒定的，即都降至酸性pH，但是有學(xué)者[14]認(rèn)為，初始pH值決定了變異鏈球菌對葡萄糖的利用率以及酸性終產(chǎn)物的形成；因此，本實(shí)驗(yàn)將變異鏈球菌菌株接種至不同初始pH值的培養(yǎng)基中，借以比較各菌株的產(chǎn)酸和耐酸能力；在接種增菌液之前，用無菌中性PBS緩沖液洗菌，排除了增菌培養(yǎng)基酸性環(huán)境對實(shí)驗(yàn)的影響。

產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在不同pH值條件下，各菌株的產(chǎn)酸能力明顯不同，隨著pH值的降低，各菌株的產(chǎn)酸能力均下降。當(dāng)pH≤4.5時(shí)，各菌株均不再產(chǎn)酸，與Khoo等[7]的研究結(jié)果一致。41株臨床分離株中

絕大部分菌株pH值變化的平均值為1.6～1.8，國際參考菌株Ingbritt的pH值變化也位于此范圍內(nèi)，僅14、12、33、17和29號菌株的pH值變化高于此范圍，10、4、9、19、5、27和15號菌株的pH值變化低于此范圍。

耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在不同pH值條件下，各菌株的生長能力明顯不同，隨著pH值的降低，各菌株的生長能力均下降。41株變異鏈球菌臨床分離株中，絕大部分菌株OD600平均值位于0.70～0.85之間，國際參考菌株Ingbritt OD600平均值也位于此范圍內(nèi)，僅8、12、1、33、17、2和23號菌株高于此范圍，29、5、21、4、9和26號菌株低于此范圍。

綜合4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)：同一菌株黏附、合成細(xì)胞外多糖、產(chǎn)酸和耐酸能力有差異；在本實(shí)驗(yàn)條件下，同一菌株的某一項(xiàng)或某幾項(xiàng)能力較高或較低；高齲患者口腔中存在低毒力株，無齲者口腔中不僅能夠分離出變異鏈球菌，有些菌株的某一項(xiàng)致齲能力還比較高，這與Yamashita等[15]的研究結(jié)果一致。41株臨床分離株中，12、17和33號可能為高致齲性變異鏈球菌臨床分離株，而4、5和9號可能為低致齲性變異鏈球菌臨床分離株；深入研究這些致齲能力不同的變異鏈球菌株，對認(rèn)識齲病的病因和發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。

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（本文編輯 吳愛華）