拮抗黃芪根腐病菌的根際促生菌的室內(nèi)篩選與鑒定

高芬　郝銳　秦雪梅　雷振宏　王玉龍　王夢亮

[摘要] 該文以黃芪根腐病菌Fusarium solani為靶標(biāo)，采用平板對峙和牛津杯法對被篩菌株進行了抑菌活性評價，并測定了抑菌效果顯著且穩(wěn)定性良好菌株的促生性能，結(jié)果顯示：菌株G10的活體和發(fā)酵液均表現(xiàn)出了明顯且穩(wěn)定的抑菌效果；同時，還具有溶磷能力、固氮能力、淀粉酶活性、產(chǎn)IAA和產(chǎn)HCN等5項促生長特性。形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測定、16S rDNA序列同源性分析、以及BBL CrystalTM細菌鑒定儀鑒定結(jié)果均表明：菌株G10為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。綜上，枯草芽孢桿菌G10具備了多功能菌株的基本特征，是開發(fā)黃芪根腐病專用微生物農(nóng)藥的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 黃芪根腐?。?植物根際促生菌； 篩選； 鑒定

In vitro screening and identification of plant growthpromoting

rhizobacteria against pathogen causing Astragalus root rot

GAO Fen1， HAO Rui2， QIN Xuemei3， LEI Zhenhong4， WANG Yulong4， WANG Mengliang1*

（1.Institute of Applied Chemistry， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

2.Institute of Biotechnology， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

3.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， Shanxi University， Taiyuan 030006， China；

4.Shanxi Zhendong Geoherbals Development Co.， Ltd.， Changzhi 047100， China）

[Abstract] The antagonistic effect of Bacillus spp. against Fusarium solani was evaluated by living body dual culture and Oxford cup method. The plant growth promoting properties of those strains that had obvious and stable antifungal activity were then tested. The results showed that the living body and bacteriafree fermentation filtrate of strain G10 both had obvious and stable antifungal effect to F. solani. Besides， the strain possessed such growth promoting properties as phosphate solubilization， nitrogen fixation， and production of IAA， amylase and HCN. Strain G10 was classified and identified as B. subtilis by a combination of morphological， physiological and biochemical tests， 16 SrDNA gene sequence analysis and the BBL CrystalTM bacteria identification. In conclusion， B. subtilis G10 has the basic characteristics of multifunctional strains and could be one of the microbiological resources for developing special biocontrol agent against Astragalus root rot.

[Key words] Astragalus root rot； plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）； screening； identification

doi：10.4268/cjcmm20162217

植物根際土壤中的根際促生菌（PGPR）指生存于植物根際、根表，能直接或間接地促進植物生長，增加作物產(chǎn)量，并能抑制有害微生物的有益菌[1]。PGPR主要通過產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長的信號物質(zhì)，如吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素和乙烯、非共生固氮、溶解磷礦物及其他養(yǎng)分等機制促進植物生長，同時也能產(chǎn)生嗜鐵素和氫氰酸等抵抗病原菌[2]。芽孢桿菌作為一類重要的PGPR菌[3]，具有很強的環(huán)境適應(yīng)性和友好性，在大田及蔬菜等的土傳病害防治中顯示出了巨大的潛力[46]。利用芽孢桿菌防治藥用植物土傳病害也有一些報道，例如：李忠等[7]分離獲得的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis DY產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對何首烏根腐病菌具有良好的拮抗作用；姜云等[8]從人參植株體內(nèi)分離出的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B. methylotrophicus NJ13對人參灰霉病、黑斑病、立枯病等具有廣譜抗性；關(guān)一鳴等[9]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B. subtilis B11能強烈抑制人參根腐病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)。但上述這些拮抗菌的篩選，大部分局限于關(guān)注芽孢桿菌的抗菌特性，而未對其促生性能進行研究。

黃芪素有“十藥八芪”之稱，居于常用中藥前列，近年來因需求量及種植面積的增加，根腐病逐年嚴(yán)重，在山西、甘肅、內(nèi)蒙古等主產(chǎn)區(qū)均已普遍發(fā)生[10]，目前主要采用的化學(xué)和農(nóng)業(yè)防治措施遠遠不能滿足黃芪生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展和綠色環(huán)保的要求，因此，開發(fā)兼具防病效果和促生性能的高效PGPR多功能制劑，對促進黃芪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極的推動意義。截止目前，利用芽孢桿菌對黃芪根腐病進行防治僅見辛中堯等[11]的個別報道，且未見后續(xù)產(chǎn)業(yè)化制劑形成。

基于上述原因，本課題組前期以山西黃芪根腐病優(yōu)勢病原菌腐皮鐮刀菌Fusarium solani和銳頂鐮刀菌F. acuminatum為靶標(biāo)，初篩獲得了30株具有抑菌作用的拮抗菌株，本研究擬通過綜合評價這些菌株的抑菌活性及促生性能，篩選獲得兼具抑菌促生作用的多功能菌株，并明確其分類地位，為開發(fā)針對黃芪根腐病的多效生防制劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 待測拮抗菌 由本實驗室2013年7—10月分離自山西黃芪主產(chǎn)區(qū)健康植株根際土壤，并篩選獲得。

1.1.2 靶標(biāo)病原菌 黃芪根腐病優(yōu)勢病原菌F. solani，由本實驗室分離、鑒定并保存。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 馬鈴薯20%，葡萄糖1.5%，NaCl 0.1%，KH2PO4 0.1%，其余為水。

1.1.4 促生性能測定培養(yǎng)基 Pikovaskaia′s培養(yǎng)基；硅酸鹽培養(yǎng)基；無氮培養(yǎng)基（Nfb）；LB培養(yǎng)基；NB牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 待測菌株的體外抑菌活性測定

1.2.1 病原菌培養(yǎng) 菌塊制備：挑取靶標(biāo)菌F. solani接入PDA平板中央，25 ℃培養(yǎng)72～120 h，待菌落長滿平皿后，打取直徑5 mm的菌塊，待用。孢子懸液制備：將菌塊5塊接入裝有50 mL PD培養(yǎng)液的 250 mL三角瓶中，28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)（180 r·min-1）72 h，雙層無菌紗布過濾，獲得無菌絲的孢子懸液，加無菌水稀釋至20～30個孢子/視野（10×15倍），置4 ℃冰箱備用。

1.2.2 拮抗菌培養(yǎng) 拮抗菌懸液制備：待測菌株28 ℃活化48 h后，制備菌懸液，使其終濃度為1.5×107～2.0×108 cfu·mL-1。無菌發(fā)酵濾液制備：菌懸液按體積比4%接種至50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶），28～30 ℃搖床振蕩（180 r·min-1）培養(yǎng)48 h后，8 000 r·min-1離心20 min，取上清液，用細菌過濾器（=0.22 μm）過濾菌體，得無菌發(fā)酵濾液，置4 ℃冰箱備用。

1.2.3 活體抑菌活性的測定 平板對峙法：將病原菌菌餅接于PDA平板中央，再將活化后的待測菌株呈十字交叉點接在距菌餅2 cm處的4個角上，25 ℃恒溫培養(yǎng)；72 h后測量抑菌帶寬度并計算菌落生長抑制率。菌落生長抑制率=（對照菌落凈生長半徑-處理菌落凈生長半徑）/對照菌落凈生長半徑×100%。

1.2.4 發(fā)酵液抑菌活性的測定 牛津杯法：將病原菌孢子懸液加入熔融態(tài)PDA培養(yǎng)基中（每500 mL PDA中加入400 μL），迅速混勻并制成平板（20 mL/皿）。在混菌平板上等距離放置無菌牛津杯3個，加入200 μL無菌發(fā)酵濾液，25 ℃培養(yǎng)48 h后，十字交叉法測量抑菌圈直徑。上述試驗均以無菌水為對照，3次重復(fù)。

1.3 待測菌株的促生性能測定

經(jīng)上述抑菌活性測定，抑菌效果顯著且穩(wěn)定性良好的菌株進入促生性能測定。

1.3.1 溶磷性能測試 菌株點接于Pikovaskaia′s培養(yǎng)基中，每皿接種4點，每1菌株3皿，30 ℃培養(yǎng)120 h，觀察接種菌株周圍有無溶磷圈形成，判斷該菌株有無溶磷性[12]。

1.3.2 解鉀能力測定 菌株點接于硅酸鹽培養(yǎng)基中，每皿接種4點，每1菌株3皿，30 ℃培養(yǎng)24～72 h，觀察菌落形態(tài)和溶鉀圈大小[13]。

1.3.3 固氮性能測定 菌株穿刺接種于含有0.5%蔗糖的無氮NFb半固體培養(yǎng)基試管中，30 ℃靜置培養(yǎng)72 h，觀察是否有菌環(huán)或菌膜生成，以未接種的空白培養(yǎng)基為對照[14]。

1.3.4 淀粉酶活性測定 菌株接種于含有0.2%可溶性淀粉的NB牛肉膏蛋白胨固體平板上，30 ℃靜置培養(yǎng)72 h，形成明顯菌落后，在平板上滴加碘液，觀察菌落周圍變色情況并測量酶解圈大小[15]。

1.3.5 分泌IAA能力的測定 菌株接種于含有 L色氨酸（100 mg·L-1）的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)（180 r·min-1）24 h后，取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入等體積Salkowski比色液（50 mL 35% HClO4 + 1 mL 0.5 mol·L-1 FeCl3），將白色陶瓷板于室溫避光放置 30 min 后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌IAA。以加入50 μL未接菌的 LB 液體培養(yǎng)基與等體積比色液的混合溶液為對照[16]。

1.3.6 產(chǎn)HCN鑒定 在NB培養(yǎng)基中添加4.4 g·L-1甘氨酸，將菌株劃線接種于該平板上，另將浸過2%碳酸鈉，0.5%苦味酸溶液（2，4，6三硝基苯酚）的Whatman 1號濾紙置于培養(yǎng)基上，密封，（30±2） ℃培養(yǎng)96 h，濾紙顏色由橘黃色轉(zhuǎn)為紅色的說明有 HCN產(chǎn)生[17]。

1.4 多功能菌株G10的多相分類鑒定

1.4.1 菌株形態(tài)、生理生化特征觀察 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[18]，觀察并測定菌株G10的生長情況、菌落形態(tài)與顏色、革蘭氏染色和芽孢染色等形態(tài)與生理生化特征。

1.4.2 菌株G10 的16S rDNA序列測定與分析 采用CTAB法提取基因組DNA并作為模板，利用細菌16S rDNA 基因通用引物27F（5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′）和1495R（5′CTACGGCTACCTTGTTACGA3′）進行擴增[19]。PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，引物（25 pmol·L-1）各 1 μL，dNTP Mixture 2.5 μL，Taq DNA Polymerase（5 U·μL-1）0.5 μL，ddH2O 15.5 μL，DNA 模板 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 4 min，95 ℃變性 l min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；然后72 ℃保持7 min[20]。擴增產(chǎn)物由上海生工測序，測得的基因序列與GenBank中已知的 16S rDNA序列進行同源性比對，采用 MEGA 5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3 采用BBL Crystal細菌鑒定儀驗證菌株G10鑒定結(jié)果 將培養(yǎng)好的菌株G10用無菌棉簽挑取適量配制成0.5～0.6 McFarland的菌懸液，并倒入盛液盒兩端，左右傾斜使菌液沿軌道均勻充滿每個孔，然后將試劑板與盛液盒合上，并做標(biāo)記。將接種完成的鑒定板標(biāo)簽朝下置于35～37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后，將培養(yǎng)完成的鑒定板取出，在AutoReader上判讀鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果和分析

2.1 拮抗菌的體外抑菌效果

30株菌的平板對峙測定結(jié)果表明，有16株菌抑菌效果明顯，抑菌帶寬度在2～6.67 mm，菌落生長抑制率在13.96%～40.85%，重復(fù)測定后效果穩(wěn)定（表1）。其中，菌株R102與G10的抑菌帶及抑制率數(shù)值雖然較小，但二者的抑菌帶邊緣整齊、清晰、靶標(biāo)菌菌落整體生長較小，因此選擇上述16株菌進入下步發(fā)酵液抑菌活性測定。

芽胞桿菌制劑一般為發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵液所能達到的抑菌效果和活菌含量是決定微生物農(nóng)藥藥效的重要因素。菌株的發(fā)酵液抑菌活性測定結(jié)果表明，有8株菌的抑菌效果較好，抑菌圈直徑在10.58～19.33 mm，且重復(fù)發(fā)酵后效果穩(wěn)定。經(jīng)方差分析表明，G2，R43，G14，G16，G10發(fā)酵液的抑菌圈最大，且五者之間無顯著差異（P<0.05）；R53與G3次之，二者之間也無顯著差異（P<0.05）；R35的抑菌圈最?。ū?）?？梢娺@8株菌滿足后續(xù)制劑生產(chǎn)的需求，可進入促生能力測定，進而從中篩選兼具抑菌和促生功能的高效菌株。

2.2 拮抗菌的促生性能測定

若使拮抗菌在田間更好的發(fā)揮作用，在測定指標(biāo)中具有多項促生能力是選擇的前提。本試驗結(jié)果顯示，供試拮抗菌均具有2項以上促生能力（表3）；其中，菌株G10具有5種促生能力，分別為溶磷能力、固氮能力、淀粉酶活性、產(chǎn)IAA能力與產(chǎn)HCN能力。同時，該菌發(fā)酵液的抑菌活性在8株菌中，與活性最好的G2，R43，G14，G16相當(dāng)。據(jù)此，選擇菌株G10作為后續(xù)研究的目標(biāo)菌株，并對其進行鑒定。

2.3 菌株G10的多相分類鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)及生理生化特征 菌株G10在 PDA 平板表面生長的菌落為圓形至近圓形，灰紅色，邊緣鋸齒狀，濕潤，不透明；菌體形態(tài)為桿狀，大小為（0.62～0.90）μm×（2.71～3.37）μm，革蘭氏染色為陽性，芽孢一般在菌體中間。測定生理生化特性（表4），參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》的檢索表檢索可知，拮抗菌G10為枯草芽孢桿菌B. subtilis。

2.3.2 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 以基因組DNA為模板，利用特異引物擴增并測序，測得菌株G10 16S rDNA的核苷酸序列長度為1 459 bp，將該序列提交到GenBank（登錄號KX427026），并與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行核苷酸序列的同源性比對，同時運用軟件MEGA 5.05建立系統(tǒng)發(fā)育樹Test Neighborjoining Tree（圖1），結(jié)果表明，菌株G10與B. subtilis的 16S rDNA基因同源性最高，達97%。結(jié)合菌體形態(tài)、生理生化試驗結(jié)果，將菌株G10鑒定為枯草芽孢桿菌B. subtilis。

2.3.3 利用BBL Crystal細菌鑒定儀驗證鑒定結(jié)果 細菌鑒定儀對菌株G10再次鑒定的結(jié)果表明：菌株G10為枯草芽孢桿菌B. subtilis，該結(jié)果與形態(tài)、生理生化試驗和16S rDNA序列分析的鑒定結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

根際促生菌（PGPR）對植物的有益作用主要表現(xiàn)在防病和促生2個方面[21]，PGPR中的PGPB在藥用植物上的應(yīng)用前提就是從道地藥材土壤或內(nèi)生細菌中分離出具有促生特征的菌株[22]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，來源于黃芪根際土壤的菌株G10不僅對黃芪根腐病優(yōu)勢病原菌F. solani有良好的抑菌作用，且兼具多項促生功能。氮是黃芪地上部分及旺盛生長時期最主要的營養(yǎng)元素[23]，同時也是植物體內(nèi)葉綠素、蛋白質(zhì)等許多重要化合物的組分[24]；磷的缺乏則可導(dǎo)致黃芪生長緩慢，植株瘦小，使葉片呈現(xiàn)不正常的顏色[24]，而菌株G10不僅可以在無氮培養(yǎng)基中生長，具有自身固氮作用，而且有較好的溶磷作用，在根際施用時，不僅可提高黃芪對氮源的利用率，同時也能提高難溶性磷酸鹽的溶解性，改善磷素營養(yǎng)，供黃芪吸收利用。IAA在植物體內(nèi)參與細胞伸長生長、形成層細胞分裂、維管組織分化等許多生理生化過程的調(diào)節(jié)與控制，并對植物的頂端優(yōu)勢、向性、同化物的運輸?shù)纫灿姓{(diào)節(jié)作用[25]，菌株G10可以產(chǎn)生IAA的特性，說明其也可促進黃芪生長，增加產(chǎn)量。另外，黃芪種子外皮堅實而厚，吸水能力差，在正常溫、濕度條件下約有80%的種子不能萌發(fā)[26]，基于解淀粉酶可促進種子萌發(fā)的作用，菌株G10也可通過產(chǎn)生解淀粉酶來促進黃芪種子的萌發(fā)，更好地保障出苗率。由此可以看出，菌株G10的促生性能很好地符合了黃芪的生長特性，更利于根腐病的防治和黃芪的生長。

多相分類鑒定結(jié)果表明，菌株G10為B. subtilis。B. subtilis作為芽孢桿菌屬的重要成員，其在植病生防方面的潛能已被發(fā)掘，且針對各類土傳病害開發(fā)出了在生產(chǎn)上廣泛使用的制劑，獲得了良好的經(jīng)濟和社會效益[2728]。由此說明，本課題獲得的B. subtilis G10可作為黃芪根腐病多功能生防制劑開發(fā)的良好微生物資源，具有較大的開發(fā)潛能。

但是，對于在室內(nèi)平板上表現(xiàn)出良好抑菌促生作用的菌株，還需進行盆栽或小區(qū)實驗來最終確定其實際應(yīng)用效果。由于黃芪生長對環(huán)境有著特殊的需求[29]，在現(xiàn)有溫室和露天盆栽條件下，多次進行人工直播和移栽，均出現(xiàn)出苗率低、后期生長不良、生長十分緩慢等現(xiàn)象，無法滿足盆栽實驗的條件，因此考慮在完成發(fā)酵條件優(yōu)化后，在黃芪種植基地進行小區(qū)實驗，來最終明確其實際的抑菌促生效果。同時，促生作用目前也只進行了是否具有促生功能的研究，而各項能力的大小，還有待進一步明確。

另外，拮抗枯草芽孢桿菌有多種抑菌機制[27]，且防病效果往往是多種機制共同作用的結(jié)果。本文僅明確了G10能通過產(chǎn)HCN拮抗病原菌，該菌是否還有其他抑菌防病機制仍待研究。

綜上可知，G10已經(jīng)具備了多功能菌株的基本特征，若能開發(fā)為微生物農(nóng)藥或肥料應(yīng)用于生產(chǎn)，可以一定程度上緩解黃芪根腐病的發(fā)生，促進黃芪的增產(chǎn)增收，但還需進行后續(xù)深入研究為制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]