金屬蛋白酶組織抑制劑對(duì)涎腺腺樣囊性癌表達(dá)β—肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖的影響

郝艷梅 馬佳 司晨晨 徐佳 景捷

[摘要] 目的 研究涎腺腺樣囊性癌（SACC）中β-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖（β-DG）的表達(dá)情況，探討金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）對(duì)SACC細(xì)胞表達(dá)β-DG的影響。方法 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)經(jīng)不同濃度（10、15、20、25 μmol·L-1）TIMPs作用后SACC肺高轉(zhuǎn)移株ACC-M和肺低轉(zhuǎn)移株ACC-2中β-DG的表達(dá)情況，以未經(jīng)TIMPs作用的ACC-M和ACC-2細(xì)胞作為對(duì)照。收集7例SACC患者的腫瘤組織樣本，以10例正常涎腺組織作為對(duì)照，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)β-DG的表達(dá)情況。結(jié)果 未經(jīng)TIMPs作用前，ACC-2和ACC-M細(xì)胞均未見β-DG表達(dá)，經(jīng)不同濃度TIMPs作用后，ACC-2和ACC-M細(xì)胞β-DG表達(dá)均為陽性。10例正常涎腺組織中，β-DG主要表達(dá)于腺泡的基膜上；SACC組織的癌巢周圍及癌細(xì)胞中β-DG表達(dá)陰性。結(jié)論 SACC細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架連接處的β-DG發(fā)生了斷裂，可能使其更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，而TIMPs能夠逆轉(zhuǎn)β-DG的表達(dá)，為治療SACC提供了新思路。

[關(guān)鍵詞] 金屬蛋白酶組織抑制劑； 涎腺腺樣囊性癌； β-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖

[中圖分類號(hào)] R 739.87 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.002

β-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖（β-dystroglycan，β-DG）是一種跨膜蛋白，是連接細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)骨架的重要結(jié)構(gòu)，對(duì)維持細(xì)胞膜的完整性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著關(guān)鍵性作用[1]。人類宮頸癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前

列腺癌患者會(huì)出現(xiàn)β-DG異常，舌鱗狀細(xì)胞癌患者有β-DG斷裂的現(xiàn)象[2]。涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，侵襲性較強(qiáng)。目前有關(guān)SACC中β-DG的研究尚不多見。本研究通過觀察細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)這一連接體是否發(fā)生斷裂，從抑制SACC基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)降解的角度出發(fā)，檢測(cè)金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）調(diào)控SACC肺高轉(zhuǎn)移株ACC-M和SACC肺低轉(zhuǎn)移株ACC-2表達(dá)β-DG的情況，探討SACC侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為治療SACC提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

人SACC肺高轉(zhuǎn)移株ACC-M和人SACC肺低轉(zhuǎn)移株ACC-2購至武漢大學(xué)保藏中心。主要試劑：GM6001（屬于TIMPs的一種，美國Enzo Life Sciences Interna-tional公司產(chǎn)品），胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液（HyClone公司，美國），含0.02%乙二胺四乙酸（ethylenedia-

mine tetraacetic acid，EDTA）的0.25%胰蛋白酶（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），一抗Beta-Dystro-glycan mouse monoclonal antibody（Novocastra Labo-ratories Ltd.，英國），SP9002（生物素標(biāo)記山羊抗小

鼠IgG）HistostainTM-PlusKits免疫組織化學(xué)染色試劑盒、ZLI-9018DABKit/DAB濃縮型DAB試劑盒（北京

中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。主要實(shí)驗(yàn)儀器：CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)，冰凍切片機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將ACC-M和ACC-2用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 GM6001儲(chǔ)存液制備 將1 mg GM6001粉末溶于100 μL二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）后配制成25 μmol·L-1的儲(chǔ)存母液，過濾除菌后，置于

-20 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。使用時(shí)稀釋，使GM6001濃度分別為25、20、15、10 μmol·L-1。

1.2.3 細(xì)胞爬片制備 使用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定活細(xì)胞數(shù)達(dá)到全部細(xì)胞的95%以上，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞（密度為每毫升5×104個(gè)），接種于經(jīng)滅菌處理的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)液，按照實(shí)驗(yàn)分組在適宜的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組加含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h；實(shí)驗(yàn)組分別加入含GM6001濃度為10、15、20、25 μmol·L-1的培養(yǎng)液，于同樣條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)ACC-M和ACC-2中β-DG的表達(dá) 將細(xì)胞爬片置于冰面上，用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗片3次，每次5 min；將細(xì)胞爬片浸入過氧化氫/甲醇溶液（150 μL 30%過氧化氫溶于50 mL甲醇液）中，室溫浸泡30 min，再用PBS液洗片3次，每次5 min；滴加山羊血清封閉液，室溫下作用30 min，甩去多余液體，不洗。實(shí)驗(yàn)組加一抗（一抗與無菌三蒸水的體積比為1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS洗片；對(duì)照組不加一抗，以PBS液孵育，4 ℃過夜后，PBS洗片。上述步驟完成后，滴加二抗，于37 ℃孵育60 min，PBS洗片；然后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素親和素復(fù)合物于切片上，作用30 min，PBS洗片；最后DAB顯色，自來水洗滌，蘇木精復(fù)染15 s，脫水，透明，封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，數(shù)碼顯微攝影系統(tǒng)成像。結(jié)果判定：細(xì)胞核為藍(lán)色，β-DG陽性表達(dá)者呈棕黃色。

1.2.6 臨床標(biāo)本中β-DG的表達(dá) 選擇2010年12月—2012年6月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔頜面外科住院治療的7例SACC患者采集標(biāo)本?；颊咝g(shù)前未經(jīng)任何治療，所有病例均經(jīng)病理診斷后確診，所有患者均行手術(shù)治療。7例患者中，男4例，女3例；年齡42～68歲，平均55歲；病史1～6個(gè)月，平均3.5個(gè)月；原發(fā)部位在左側(cè)者2例，右側(cè)者5例。另外取10例涎腺組織作為對(duì)照，其中5例取自舌下腺囊腫的正常舌下腺組織，3例取自腮腺多形性腺瘤瘤旁正常組織（切緣在腮腺下極距病灶約1 cm處），2例取自腮腺腺淋巴瘤瘤旁正常組織。所有標(biāo)本均于術(shù)中切取，大小約1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm，立即放入凍存管并投入液氮中保存?zhèn)溆?。在制作冰凍切片的過程中，切片機(jī)的溫度要維持在-20 ℃。切片完成后在冰面上用冷丙酮和甲醇固定4 min，PBS反復(fù)沖洗，再將冰凍切片浸入3%過氧化氫溶液中，室溫浸泡30 min以滅活內(nèi)源性酶，PBS液洗片，滴加山羊抗小鼠血清封閉液，室溫下作用60 min，甩去多余液體，不洗，后續(xù)步驟同1.2.5。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Image Pro-Plus 6.0病理細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，將各組免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果進(jìn)行圖像分析，每張切片至少選取5個(gè)高倍（40×10倍）視野，

計(jì)算出平均光密度值。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，不同濃度的GM6001分別干預(yù)ACC-M和ACC-2細(xì)胞24 h后β-DG表達(dá)變化的比較采用單因素方差分析，ACC-M和ACC-2兩種細(xì)胞株β-DG表達(dá)變化的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 加入GM6001后對(duì)ACC-M和ACC-2細(xì)胞株β-DG

表達(dá)的影響

加入不同濃度GM6001后，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)ACC-M和ACC-2細(xì)胞株中β-DG的表達(dá)，結(jié)果見表1：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組β-DG表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ACC-M：F=60.247，P<0.05；ACC-2：F=34.453，P<0.05）；GM6001濃度為20 μmol·L-1時(shí)，ACC-M和ACC-2中β-DG表達(dá)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），

其余3種濃度下，ACC-M和ACC-2中β-DG表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

加入GM6001前后ACC-M和ACC-2細(xì)胞株中β-DG表達(dá)的情況見圖1～4：加入GM6001前（對(duì)照組），

ACC-M和ACC-2細(xì)胞株中均無β-DG表達(dá)；加入GM6001后，2種細(xì)胞株中β-DG表達(dá)均為陽性。

2.2 臨床標(biāo)本中β-DG的表達(dá)

2.2.1 正常涎腺組織β-DG的表達(dá) 正常涎腺組織中β-DG主要位于腺泡基膜上。圖5為正常舌下腺組織，可見舌下腺腺泡的外周有一層基膜包繞，基膜β-DG染色為陽性。

2.2.2 SACC組織β-DG的表達(dá) 7例SACC臨床標(biāo)本中，癌巢周圍及癌細(xì)胞中β-DG表達(dá)均為陰性。圖6

中SACC組織呈管狀型，腫瘤細(xì)胞排列呈小管狀或條索狀結(jié)構(gòu)，管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)層襯有導(dǎo)管細(xì)胞，外層為腫瘤肌上皮細(xì)胞，均未見β-DG陽性染色。

3 討論

β-DG是廣泛表達(dá)于各種組織的跨膜糖蛋白，其功能很復(fù)雜，與細(xì)胞和基底膜的連接有關(guān)，而細(xì)胞與基底膜的連接對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重

要[3]。在胃癌的研究[4]中，β-DG是一種功能性蛋白，在原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中表達(dá)降低。在SACC中的表達(dá)情況，目前尚不明確。

SACC約占涎腺腫瘤的10%，易沿神經(jīng)擴(kuò)散發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚，對(duì)其預(yù)防和治療尚無有效的方法。DeAngelis等[5]對(duì)24例SACC患者進(jìn)行了長達(dá)22年的臨床回訪，發(fā)現(xiàn)患者5、10、20年的生存率分別為92%、72%、54%。對(duì)于SACC治療方式的選擇和預(yù)后的評(píng)估可能需要結(jié)合一些實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)。

β-DG是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotei-

nase，MMPs）的靶點(diǎn)。β-DG被MMPs降解后，造成

β-DG復(fù)合體斷裂， 使上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的連接出現(xiàn)斷裂[6-7]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)臨床組織標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常涎腺組織表達(dá)β-DG，提示β-DG對(duì)維持正常涎腺的結(jié)構(gòu)和功能有重要作用；7例SACC組織中β-DG表達(dá)缺失，提示細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接發(fā)生了斷裂，意味著癌細(xì)胞失去了自限性，獲得向鄰近正常組織侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。應(yīng)用ACC-M和ACC-2兩種細(xì)胞株進(jìn)行體外研究，β-DG的表達(dá)情況與組織學(xué)的研究結(jié)果一致。

TIMPs是MMPs的天然抑制劑，正常情況下在組織細(xì)胞中MMPs和TIMPs處于一種相對(duì)平衡的狀態(tài)[8]，如果這種平衡被打破，細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)病理學(xué)表現(xiàn)。有研究[9]表明，TIMP-1會(huì)干擾由某些因子的受體復(fù)合

物介導(dǎo)的凋亡作用，并能阻止病變發(fā)展和促進(jìn)組織修復(fù)。由此可以推測(cè)，通過TIMPs調(diào)控MMPs有可能逆轉(zhuǎn)β-DG的異常表達(dá)，從而影響SACC的侵襲和轉(zhuǎn)移，這為治療SACC提供了新思路。本研究中，ACC-M和ACC-2兩種細(xì)胞株的β-DG表達(dá)均為陰性，經(jīng)GM6001干預(yù)后，ACC-M和ACC-2的細(xì)胞膜均出現(xiàn)了棕黃色的β-DG表達(dá)區(qū)域，這說明GM6001能夠抑制SACC中β-DG的斷裂，而且對(duì)β-DG的調(diào)控是通過抑制MMPs對(duì)基底膜的降解實(shí)現(xiàn)的。本研究還比較了不同濃度的GM6001干預(yù)ACC-2和ACC-M細(xì)胞株24 h后β-DG表達(dá)的變化，結(jié)果提示，低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC-2在10、15、25 μmol·L-1的GM6001調(diào)控下，β-DG表達(dá)較高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株ACC-M為高，說明GM6001對(duì)ACC-2中異常β-DG的調(diào)控作用比ACC-M明顯，其機(jī)理還需后續(xù)的研究來證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)分別從細(xì)胞和組織水平展開研究，檢測(cè)到SACC中β-DG表達(dá)缺失，通過GM6001的調(diào)控，ACC-M和ACC-2兩種細(xì)胞株均可恢復(fù)β-DG的表達(dá)。本研究證實(shí)了GM6001能夠逆轉(zhuǎn)SACC中β-DG的表達(dá)，為治療SACC提供了參考，但其機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

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（本文采編 周學(xué)東）