雙因子誘導(dǎo)軸型支架血管化的組織形態(tài)學(xué)研究

李受益　蔡慶義　陳剛　朱曉虹　鐘曉敏　彭德瑞

[摘要] 目的 以血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）復(fù)合同軸雙層聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）支架并包裹股動(dòng)靜脈血管束，觀察血管再生與成熟及支架早期血管化的動(dòng)態(tài)變化。方法 將18只3月齡成年

雄性新西蘭大耳兔隨機(jī)分為3組：實(shí)驗(yàn)組（8只）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（8只）和空白對(duì)照組（2只）。解剖分離兔的股動(dòng)靜脈血管束，將其包裹于溶液澆鑄-顆粒瀝取法制備的同軸雙層PLGA支架中央。實(shí)驗(yàn)組支架的外層加注PDGF，內(nèi)層加注VEGF；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組支架的外層為空白，內(nèi)層加注VEGF；空白對(duì)照組不予特殊處理。實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組于支架植入術(shù)后第7、10、14、21天觀察新生血管的形態(tài)特征，空白對(duì)照組于支架植入術(shù)后第7、10天觀察作為對(duì)照。結(jié)果 術(shù)后第7天，實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組股動(dòng)靜脈血管束可見少量呈放射狀分布的血管芽；術(shù)后第10天，兩組大量的新生血管芽沿支架孔隙空間向內(nèi)層支架放射狀生長并貫通支架全層，密度由內(nèi)向外梯度遞減；術(shù)后第14天，實(shí)驗(yàn)組血管壁較厚，呈分層結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組以單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里的幼稚血管為主；術(shù)后第21天，實(shí)驗(yàn)組支架內(nèi)以成熟血管為主，而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組血管數(shù)量明顯減少?？瞻讓?duì)照組始終未見明顯血管結(jié)構(gòu)。結(jié)論 同軸雙層PLGA支架復(fù)合VEGF/PDGF可有效促進(jìn)早期血管化。

[關(guān)鍵詞] 骨組織工程； 血管化； 動(dòng)靜脈血管束； 血管新生

[中圖分類號(hào)] Q 81 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.022

組織工程骨因具有無抗原性、來源不受限制、可預(yù)先設(shè)計(jì)塑形和具有生物功能等獨(dú)特優(yōu)勢，而具有廣闊的發(fā)展前景。但如何提高并確保骨組織工程的早期血管化，迄今仍是影響其規(guī)?；皩?shí)用性的瓶頸之一[1-3]。組織工程血管化的關(guān)鍵是功能血管的數(shù)量及其營養(yǎng)能力，而不是僅僅在于成功誘導(dǎo)新生血管的總量。真正有實(shí)際價(jià)值的早期血管化過程，應(yīng)既能誘導(dǎo)新生血管在支架空間結(jié)構(gòu)內(nèi)大量增殖，又能在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步促進(jìn)其結(jié)構(gòu)成熟以形成穩(wěn)定有效的血循系統(tǒng)[4]。本研究設(shè)計(jì)同軸雙層聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]支

架，將血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）分別復(fù)合于內(nèi)外層支架形成空間差異分布方式，并將股動(dòng)靜脈血管束包裹于支架中央，觀察支架內(nèi)部早期誘導(dǎo)血管化的效能及其時(shí)間-空間動(dòng)態(tài)變化與轉(zhuǎn)歸。

1 材料和方法

1.1 同軸雙層PLGA支架的制備

將PLGA（聚乳酸∶聚羥基乙酸為50∶50，相對(duì)分子

量50×103，固有黏度0.24 dL·g-1，山東醫(yī)療器械研究所）及粒徑150～300 μm的氯化鈉顆?；靹蛉苡诼确?，澆鑄于軸型模具[5]內(nèi)，按溶液澆鑄-顆粒瀝取法[6]制備大小兩套中空管狀支架各18套，套迭形成雙層結(jié)構(gòu)。Co60 25 kGy輻照滅菌，-20 ℃保存。

1.2 股動(dòng)靜脈血管束分離及支架植入

將18只3月齡成年雄性新西蘭大耳兔（天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重2.0～2.5 kg）隨機(jī)分為3組：實(shí)驗(yàn)組（8只）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（8只）和空白對(duì)照組（2只）。全身麻醉下于兔左側(cè)大腿內(nèi)側(cè)中份縱行解剖游離股動(dòng)靜脈血管束，結(jié)扎分支，顯露約2.5 cm，包裹于植入體內(nèi)的同軸雙層PLGA支架的中央管腔內(nèi)。根據(jù)分組，實(shí)驗(yàn)組雙層軸型PLGA支架的外層用微量注射器加注含PDGF 0.5 ng的溶液50 μL，內(nèi)層加注含VEGF 0.5 ng的溶液50 μL；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的支架外層為空白，僅在內(nèi)層加注含VEGF 0.5 ng的溶液50 μL；空白對(duì)照組植入支架不予特殊處理。將支架與毗鄰肌肉縫合固定，分層嚴(yán)密縫合。

1.3 標(biāo)本取材及檢測

實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組分別于支架植入后第7、10、14、21天各取2只動(dòng)物處死，切取包含支架周緣5 mm肌肉組織在內(nèi)的完整組織塊。-20 ℃直接冰凍包埋后行7 μm切片及蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色，觀察新生血管的形態(tài)特征?？瞻讓?duì)照組于支架植入術(shù)后第7、10天各取1只動(dòng)物，進(jìn)行對(duì)比觀察。

2 結(jié)果

術(shù)后第7天，實(shí)驗(yàn)組（圖1A）與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（圖1B）表現(xiàn)相近，均可見VEGF誘導(dǎo)下，股動(dòng)靜脈血管外壁向內(nèi)層支架多孔間隙內(nèi)呈放射分布方式，長入條索狀新生組織，周圍植床組織亦可見少量纖維樣組織長入外層支架孔隙，新生組織分布以內(nèi)、外層支架表淺區(qū)域?yàn)橹?。高倍鏡下股動(dòng)靜脈血管束可見少量由單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里的幼稚血管芽。空白對(duì)照組（圖1C）僅見少量纖維組織，未見明顯血管結(jié)構(gòu)。

術(shù)后第10天，實(shí)驗(yàn)組（圖2A、B）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組

（圖2C、D）標(biāo)本可見大量新生血管芽廣泛長入支架

內(nèi)部，沿支架孔隙空間向內(nèi)層支架放射狀生長，走行呈迂曲狀，貫穿支架內(nèi)外全層，血管外周的纖維結(jié)締組織基質(zhì)豐富，新生血管密度由內(nèi)層支架表面向外梯度遞減。兩組對(duì)比可見，實(shí)驗(yàn)組近外層支架

（PDGF）區(qū)域內(nèi)新生血管的管徑較粗且管壁較厚，腔

內(nèi)聚集血細(xì)胞，近內(nèi)層支架（VEGF）區(qū)域內(nèi)的血管則以單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里的幼稚血管結(jié)構(gòu)為主，內(nèi)含少量血細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組仍多為單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里的幼稚血管。空白對(duì)照組（圖2E）僅見少量纖維組織，未見明顯血管結(jié)構(gòu)。

術(shù)后第14天，實(shí)驗(yàn)組（圖3A、B）標(biāo)本可見雙層支架腔隙內(nèi)廣泛分布新生血管網(wǎng)絡(luò)并貫穿全層，其管壁較厚且結(jié)構(gòu)較成熟圓潤，清晰可見逐步過渡的內(nèi)、中、外膜分層，同時(shí)可見少量幼稚血管。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（圖3C、D）則以單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里、形狀

較不規(guī)則的幼稚血管為主，成熟血管相對(duì)較少。

術(shù)后第21天，實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組血管密度均降低，實(shí)驗(yàn)組支架內(nèi)以成熟血管為主（圖4A），沿新生血管軸的縱剖面尚可見血管芽（圖4B）或豐富分支架構(gòu)，管腔內(nèi)含有大量的血細(xì)胞，支架內(nèi)可見少量血細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（圖4C、D）管徑較粗的血管數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組明顯減少，支架內(nèi)可見大量散逸的血細(xì)胞。

3 討論

皮膚、軟骨及角膜等少數(shù)組織細(xì)胞可通過周圍血管的擴(kuò)散而得到充分的氧氣和養(yǎng)分[3]。但這種擴(kuò)散

能力僅限于血管周圍200 μm范圍之內(nèi)。對(duì)于骨、肌肉等較大工程組織的成功應(yīng)用，血管化問題尚待進(jìn)一步解決[7]。當(dāng)組織工程支架植入體內(nèi)時(shí)，雖因手術(shù)

創(chuàng)傷引起的炎癥反應(yīng)和支架內(nèi)部種子細(xì)胞在缺氧條件下釋放的成血管因子可共同誘導(dǎo)支架血管化，但此方式形成血管的速度較慢，無法轉(zhuǎn)運(yùn)充分的氧氣和養(yǎng)分至支架內(nèi)部的種子細(xì)胞。因此學(xué)者[4]通過改變

支架構(gòu)型設(shè)計(jì)、復(fù)合誘導(dǎo)血管再生細(xì)胞因子、體內(nèi)外預(yù)血管化等方式促進(jìn)工程組織的血管化進(jìn)程。

誘導(dǎo)骨組織工程血管化的關(guān)鍵是要形成結(jié)構(gòu)成熟、功能穩(wěn)定、能夠長期提供血運(yùn)的循環(huán)系統(tǒng)，因此，血管新生應(yīng)包括兩方面：內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙、增殖及周細(xì)胞維持新生血管芽的穩(wěn)定[8]。只有依靠早期

形成的有效血循網(wǎng)絡(luò)，方可在組織工程支架內(nèi)，為受控的組織細(xì)胞分化增殖及最終形成具有預(yù)期形態(tài)及功能的組織/器官提供有效的供氧/供養(yǎng)功效。

Richardson等[9]認(rèn)為VEGF在血管化早期促進(jìn)血

管新生，PDGF在血管化后期誘導(dǎo)血管成熟，聯(lián)合應(yīng)用這兩種因子將能更好地促進(jìn)血管的再生與成熟。在組織工程領(lǐng)域，構(gòu)建一個(gè)具有復(fù)雜功能的組織，其關(guān)鍵是要精確地協(xié)調(diào)好干細(xì)胞所處微循環(huán)環(huán)境的時(shí)間及空間變化。本研究中，將股動(dòng)靜脈血管束包裹于構(gòu)建的同軸雙層PLGA支架中央作為軸型血供來源，通過在其外層復(fù)合PDGF、內(nèi)層復(fù)合VEGF的設(shè)計(jì)方式，使兩種分別作用在血管形成不同時(shí)期的誘導(dǎo)因子利用空間分布的差異方式，形成對(duì)血管組織誘導(dǎo)再生的時(shí)間差異效應(yīng)。VEGF接近股動(dòng)靜脈，利于早期誘導(dǎo)大量血管芽生及幼稚血管生成。PDGF位居外層，利于促進(jìn)后期放射狀向外生長，并促進(jìn)最終與周圍組織血循溝通的新生血管結(jié)構(gòu)的成熟與穩(wěn)定。事實(shí)上，這種后期的血管成熟與穩(wěn)定，才是真正有意義的支架血管化的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。與此同時(shí)，在外層管壁支架上的PDGF，還依賴滲透方式逐步作用于較靠內(nèi)的新生血管叢，使之最終穩(wěn)定下來。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組第10天時(shí)，隨著兩種因子在雙層支架內(nèi)部逐漸形成的不同濃度梯度，由外層支架到內(nèi)層支架可見新生血管由成熟到幼稚。第21天時(shí)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組新生血管密度較前明顯降低。動(dòng)靜脈血管束早期在VEGF的誘導(dǎo)下，支架內(nèi)部形成大量的幼稚血管，這些幼稚血管成熟之前在VEGF的持續(xù)作用下可以避免退化及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。但隨著VEGF的逐步降解，新生的幼稚血管急劇退化而大量血細(xì)胞殘存于支架內(nèi)部。實(shí)驗(yàn)組早期在VEGF誘導(dǎo)下大量新生幼稚血管伴隨纖維組織貫穿雙層支架，后期在PDGF作用下，幼稚血管逐漸改建成熟，雖然VEGF和PDGF不斷降解，但僅少部分未成熟的新生血管逐漸退化，最終形成貫通雙層支架內(nèi)部的成熟穩(wěn)定的循環(huán)網(wǎng)絡(luò)。

在VEGF及其他成血管因子的誘導(dǎo)下，內(nèi)皮細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶降解周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖并向高濃度因子部位遷徙[10]，內(nèi)皮細(xì)胞遷

徙至降解后形成的腔隙最終形成新生血管。其過程受黏附蛋白、生長因子、連接分子、內(nèi)源性抑制分子等的聯(lián)合作用[11]。新生血管進(jìn)一步改建為成熟血

管則需要多種功能不同因子之間的相互作用[10]，但

是Greenberg等[12]發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)組織工程血管化過程中

聯(lián)合應(yīng)用VEGF和PDGF并不能獲得持久的血管效應(yīng)，認(rèn)為VEGF受體2抑制PDGF受體β信號(hào)通路，進(jìn)而干擾血管平滑肌功能及血管成熟。關(guān)于不同因子之間的協(xié)調(diào)機(jī)制，尚須從分子層面及細(xì)胞信號(hào)通路方面等進(jìn)一步研究。

本研究表明：同軸雙層PLGA支架構(gòu)建方式可顯著改善組織工程支架內(nèi)部的早期血運(yùn)環(huán)境，提高氧氣和養(yǎng)分的輸送效能。

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（本文編輯 李彩）