評價兩種低溫等離子體對糞腸球菌生物膜作用的體外實驗研究

孫科　楊小慧　葉幗嬪　潘紅　王靜

[摘要] 目的 比較輝光放電和介質(zhì)阻擋放電兩種低溫等離子體裝置產(chǎn)生的大氣壓低溫等離子體對根管內(nèi)糞腸球菌生物膜的殺菌效果。方法 在120顆離體牙的根管內(nèi)部培養(yǎng)糞腸球菌生物膜，培養(yǎng)時間為7 d。將離體牙隨機(jī)分為12個組，其中，10組分別接受介質(zhì)阻擋放電和輝光放電這兩種大氣壓低溫等離子體裝置處理離體牙根管，每種裝置各處理5組，每組處理時間分別為2、4、6、8、10 min；另外2組為兩種不同裝置的單純氣體對照組。采用菌落形成單位計數(shù)法比較兩種裝置對根管內(nèi)生物膜的殺菌效果，通過光譜測量儀分析兩種裝置的等離子體活性成分。結(jié)果 介質(zhì)阻擋放電裝置比輝光放電裝置對根管內(nèi)糞腸球菌生物膜的殺菌效果更好，不同時間段二者存活的細(xì)菌數(shù)量均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），而且隨著處理時間延長優(yōu)勢更加明顯。發(fā)射光譜顯示兩種裝置的低溫等離子體活

性物質(zhì)成分一致，但激發(fā)態(tài)Ar原子的群峰總體上表現(xiàn)為介質(zhì)阻擋放電裝置是輝光放電裝置的2倍。結(jié)論 介質(zhì)阻擋放電裝置產(chǎn)生的低溫等離子體殺滅根管內(nèi)糞腸球菌生物膜更具優(yōu)勢。

[關(guān)鍵詞] 低溫等離子體； 糞腸球菌； 生物膜； 根管； 殺菌

[中圖分類號] R 780.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.020

細(xì)菌感染是頑固性根尖周炎和根管治療失敗最常見的因素，其中最常分離的菌株是糞腸球菌[1]。糞

腸球菌可以通過其分泌的蛋白酶（絲氨酸蛋白酶、白明膠酶、膠原結(jié)合蛋白）的作用來黏附在根管表面并進(jìn)入牙本質(zhì)小管內(nèi)，從而更加耐受臨床上常規(guī)的治療手段[2]。氫氧化鈣作為常規(guī)根管封藥效果確定，但糞腸球菌在這種堿性藥物環(huán)境中仍然可以頑強生存[3]。另外由于根管系統(tǒng)自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，殘存于側(cè)支根管、副根管中的糞腸球菌難以被常規(guī)根管治療中的機(jī)械和化學(xué)方法徹底清除。近年來，大氣壓低溫等離子體在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛，如快速凝血[4]、基因轉(zhuǎn)染[5]、牙齒美白[6]、殺菌[7]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]等。研究顯示其對于根管內(nèi)的細(xì)菌感染也有確

定作用，但多局限于根管內(nèi)游離菌或模擬根管內(nèi)生物膜的研究[9-10]。對于不同發(fā)生裝置的低溫等離子體

根管殺菌效果少有研究。

大氣壓低溫等離子體的發(fā)生裝置及原理有4種，常用的為介質(zhì)阻擋放電和輝光放電。介質(zhì)阻擋放電是將絕緣介質(zhì)插入放電空間的一種氣體中放電，介質(zhì)可以覆蓋在電極上或懸掛在放電空間里，當(dāng)在電極上施加足夠高的交流電壓時，即使在大氣壓下電極間的氣體也會被擊穿而產(chǎn)生放電。輝光放電是在兩電極之間直接激發(fā)氣體放電。輝光放電的電學(xué)特征為單脈沖，而介質(zhì)阻擋放電則為大量細(xì)微的快脈沖放電通道所構(gòu)成的放電。本研究使用這兩種不同的裝置，分別對離體牙根管內(nèi)的糞腸球菌生物膜進(jìn)行處理，觀察其殺菌效果及與時間因素的關(guān)系，并對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料和方法

1.1 糞腸球菌的培養(yǎng)

糞腸球菌菌種（ATCC29212）保存于-80 ℃冰箱，使用接種環(huán)挑取菌液進(jìn)行劃線培養(yǎng)。36 h后挑取單克隆，于1 mL培養(yǎng)基中37 ℃靜置24 h，使得細(xì)菌濃度達(dá)到每毫升1.0×107個菌落形成單位（colony forming

unit，CFU）。

1.2 離體牙預(yù)備

選取根尖發(fā)育完善、根面完整的單根管離體牙共120顆，自釉牙骨質(zhì)界下截除牙冠部分，保證從根尖至斷面的距離為10 mm。拔髓針拔除牙髓，15號銼通暢根管到解剖根尖孔，確定工作長度（自解剖

根尖孔至牙根斷面的長度減去0.5 mm），使用15～40號手用鎳鈦銼（Mani公司，日本）按逐步后退法進(jìn)行根管預(yù)備，預(yù)備過程中每更換1次器械均用5.25%次氯酸鈉（NaClO）2 mL沖洗根管；預(yù)備結(jié)束后17%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）浸泡根管2 min，超聲振蕩；最后5.25%NaClO浸泡根管2 min，超聲振蕩。Clearfill AP-X光固化樹脂（Ku-

raray公司，日本）封閉根尖孔。所有樣本高溫高壓滅菌（121 ℃，20 min）后放入無菌生理鹽水中4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 根管內(nèi)糞腸球菌生物膜的培養(yǎng)

將預(yù)備好的牙根樣本放入含有1 mL新鮮腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基的EP管中，然后加入100 μL含有1.0×107 CFU·mL-1糞腸球菌的菌液，37 ℃厭氧培養(yǎng)，48 h換1 mL新鮮的培養(yǎng)基，共培養(yǎng)7 d。

1.4 大氣壓低溫等離子體裝置處理離體牙根管

將培養(yǎng)7 d的含有糞腸球菌生物膜的120顆離體牙樣本隨機(jī)分為12個組，每組10顆。其中，10組分別接受介質(zhì)阻擋放電和輝光放電這兩種大氣壓低溫等離子體裝置處理離體牙根管，每種裝置各處理5組，每組處理時間分別為2、4、6、8、10 min；另外2組為兩種不同裝置的單純氣體對照組。

介質(zhì)阻擋放電和輝光放電裝置處理離體牙根管的方式見圖1。圖1左為介質(zhì)阻擋放電裝置的示意圖，該裝置包括一個特氟龍管以及在特氟龍管外面包繞的銅箔。該銅箔作為一個單電極，被連接到一個帶有18 kV峰值電壓、10 kHz正旋曲線的電源上。特氟龍管外徑10 mm，內(nèi)徑7 mm，尖端出口處直徑逐漸降到1.5 mm。使用流速為5 L·min-1的98%Ar和2%O2的混合氣體通過特氟龍管。等離子體裝置的功率為32 W，在特氟龍管尖端產(chǎn)生持續(xù)的等離子體，其暴露在空氣中的長度為5 cm。在進(jìn)行根管生物膜處理時，根管口距離等離子體發(fā)出口為5 mm，等離子體在根管口附近的溫度為25～31 ℃。圖1右為輝光放電裝置示意圖。該裝置包含作為電極的兩層銅管，這兩個銅管由一層約0.5 mm厚的絕緣介質(zhì)分開。等離子體射流端口的直徑為0.6 mm。98%Ar和2%O2同樣作為等離子體的發(fā)生氣源，氣體流速為5 L·min-1。該低溫等離子體發(fā)生裝置的維持電壓為500 V，電流為30 mA，功率為15 W。等離子體射流從裝置尖端發(fā)出的長度為5 mm，等離子體發(fā)射的端口距離根管口5 mm，溫度為35～40 ℃。

1.5 兩種裝置對根管內(nèi)生物膜殺菌效果的比較

大氣壓低溫等離子體裝置處理后，向離體牙根管中注入15 μL超純水，插入光滑髓針攪拌1 min，取出光滑髓針，向根管中插入兩個15號的無菌紙尖，將根管內(nèi)的菌液吸出后將紙尖放入1 mL超純水中。上述過程重復(fù)3遍，振蕩1 min，取100 μL菌液進(jìn)行10倍稀釋涂板，37 ℃培養(yǎng)24 h。采用CFU計數(shù)法比較兩種裝置對根管內(nèi)生物膜的殺菌效果[11]。

1.6 兩種裝置在平板上的殺菌范圍的比較

挑取金黃色葡萄球菌（CGMCC1.2465）單菌落于20 mL溶菌肉湯培養(yǎng)基（Luria-Bertani，LB）中，振蕩

器振蕩，速度為180 r·min-1，培養(yǎng)18 h，取100 μL菌液放入20 mL新鮮培養(yǎng)基中振蕩，速度為220 r·min-1，活化1.5 h，使細(xì)菌濃度為1.0×104 CFU·mL-1。分別取100 μL菌液涂布于20個LB培養(yǎng)板，然后使用兩種裝置處理，每種裝置處理10個平板。裝置等離子體發(fā)射口到培養(yǎng)板的距離為1 cm，活動范圍為2 cm×2 cm，處理時間為1 min。過夜培養(yǎng)（37 ℃，12 h），觀察金黃色葡萄球菌菌落生長情況。

1.7 光譜測量儀分析兩種裝置的等離子體活性成分

用多通道發(fā)射光譜測量儀（optical emission spec-troscopy，OES）（AvaSpec-2048-8-USB2型，Avantes公司，荷蘭）標(biāo)定低溫等離子體中產(chǎn)生的活性成分。儀器的輸出功率為24 W，工作溫度為60 ℃。測量250～800 nm波長時活性物質(zhì)的波峰。

1.8 統(tǒng)計分析

采用Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用Games-Howell檢驗法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 兩種裝置對根管內(nèi)生物膜的殺菌效果

兩種裝置對根管內(nèi)生物膜的殺菌效果見圖2。統(tǒng)計分析表明，兩種裝置的單純氣體對照組均沒有殺菌效果，含有的糞腸球菌均為1.0×107 CFU。兩種不同等離子體裝置處理糞腸球菌2、4、6、8、10 min后，各時間段二者存活的細(xì)菌數(shù)量均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。2 min時，介質(zhì)阻擋放電裝置已使CFU的log值減少超過了0.5，而輝光放電裝置并無殺菌效果；6 min時，兩種裝置CFU的log值分別下降至3.5和6；10 min時，兩種裝置CFU的log值分別下降至0.5和4.5。這說明介質(zhì)阻擋放電裝置比輝光放電裝置對根管內(nèi)糞腸球菌生物膜的殺菌效果更好，而且隨著處理時間的延長，優(yōu)勢更加明顯。

2.2 兩種裝置在平板上的殺菌范圍

在處理1 min后，兩種裝置的殺菌范圍見圖3。與輝光放電裝置相比，介質(zhì)阻擋放電裝置對處理區(qū)域和未處理區(qū)域的殺菌效果都很明顯，殺菌范圍更廣，穿透力更強。這與其對根管內(nèi)生物膜的殺菌效果一致。

2.3 兩種裝置的等離子體活性成分

兩種裝置的等離子體活性成分光譜分析見圖4。從圖4可見，雖然兩種裝置的低溫等離子體活性物質(zhì)成分一致，激發(fā)態(tài)氧原子、羥自由基等活性成分的含量接近，但是激發(fā)態(tài)Ar原子的群峰總體上表現(xiàn)為介質(zhì)阻擋放電裝置是輝光放電裝置的2倍。原子發(fā)射光譜大部分都是激發(fā)態(tài)的Ar，同時還檢測到很多活性成分，如OH、O等。

3 討論

糞腸球菌由于其生理特點[3]，在根管內(nèi)形成生物

膜后具有更強抵御常用根管治療藥物的能力，所以常見于慢性頑固性根尖周炎和根管治療失敗的病例。如何消除復(fù)雜的根管系統(tǒng)內(nèi)殘余的糞腸球菌及其他微生物是臨床上的難題。臨床上根管治療中廣泛使用的根管沖洗液NaClO對糞腸球菌有一定的殺菌效果[12]。氯己定凝膠和沖洗液對糞腸球菌也有良好的

殺菌效果，但由于凝膠和液體流動性的限制，很難進(jìn)入細(xì)小根管分支和牙本質(zhì)小管[13]。氫氧化鈣是常

用的根管封藥材料，通過改變根管內(nèi)pH值等物理環(huán)境來改變適應(yīng)細(xì)菌生長的環(huán)境，但是單獨使用對糞腸球菌生物膜無法達(dá)到高效的殺菌效果[14]。

低溫等離子體的特點是高效殺菌，使用方便快捷，活性物質(zhì)易擴(kuò)散[15]，由于這種特點，將其應(yīng)用

于復(fù)雜根管系統(tǒng)中時，氣化的活性成分可以擴(kuò)散到根管系統(tǒng)中不規(guī)則的末端結(jié)構(gòu)，彌補了根管治療傳統(tǒng)方法的不足。

本研究建立了7 d糞腸球菌感染根管的模型，其能夠形成結(jié)構(gòu)致密的糞腸球菌生物膜，可以模擬臨床上長期根管感染久治不愈的感染狀態(tài)，這比以往研究中的體外模型更接近臨床實際情況。通過使用兩種不同低溫等離子體裝置對根管系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行梯度時間處理，發(fā)現(xiàn)生物膜隨著處理時間的延長，糞腸球菌的數(shù)量逐漸降低，進(jìn)一步對兩種裝置的殺菌效果進(jìn)行量化比較，發(fā)現(xiàn)介質(zhì)阻擋放電裝置對根管內(nèi)糞腸球菌生物膜具有更高效的殺菌效果。

本研究中還使用兩種裝置處理了根管外培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌，目的是為了直觀地反映不同等離子體的滲透作用和殺菌范圍。結(jié)果顯示介質(zhì)阻擋放電裝置比輝光放電裝置具有更大的殺菌范圍，滲透性更強。這一結(jié)果為兩種裝置對根管內(nèi)糞腸球菌殺滅效果的差異提供了間接證據(jù)，等離子體的滲透性越好，在根管系統(tǒng)中的殺菌優(yōu)勢越明顯。

光譜分析是對低溫等離子體活性成分分析最常用的手段，本研究顯示兩種裝置產(chǎn)生的低溫等離子體的活性物質(zhì)成分基本一致，活性氧、羥自由基等的含量相近，但介質(zhì)阻擋放電裝置使用的是交流電，激發(fā)電壓及電壓峰值較高，且功率要比輝光放電裝置高1倍，能量更充足。在相同氣體、相同流量的情況下，介質(zhì)阻擋裝置產(chǎn)生的電離化氣體的帶電粒子更充分，在可見的等離子體射流周圍有更廣泛的離子化氣體和自由基的存在區(qū)。這表明，活性物質(zhì)和電子都是低溫等離子體裝置不可或缺的殺菌因素。

低溫等離子體由于其低溫、高效、滲透性強、作用范圍廣等特點，在對根管內(nèi)糞腸球菌生物膜的殺滅中具有傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢，為根管消毒方法提供了全新的思路，其中介質(zhì)阻擋放電裝置產(chǎn)生的等離子體殺菌效果更好。等離子體中活性成分破壞生物膜的機(jī)制和對正常組織可能的影響還有待進(jìn)一步的研究。