實(shí)驗(yàn)性單側(cè)前牙反⌒薷刺宥源笫篦鐐蝗砉侵屑鬃磁韻偌に叵喙氐鞍綴蚉TH/PTHrP受體—1表達(dá)的影響

郭敏　張婧　鹿蕾　王艷麗　張勉　王美青

[摘要] 目的 探討實(shí)驗(yàn)性單側(cè)前牙反修復(fù)體對(duì)大鼠髁突軟骨中甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）及PTH/PTHrP受體-1（PTH1R）表達(dá)的影響。方法 在6周齡SD大鼠左側(cè)上、下切牙粘接金屬不良修復(fù)體，使其呈反關(guān)系，2、

4、8周后取顳下頜關(guān)節(jié)（TMJ），蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)PTHrP、PTH1R的表達(dá)情況。結(jié)果 8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨出現(xiàn)明顯退行性變，PTHrP陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組顯著增多（P<0.01），PTH1R陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少（P<0.01）；實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨PTHrP mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.01），而PTH1R mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01）。結(jié)論 髁突軟骨PTHrP的高表達(dá)因PTH1R的低表達(dá)不能有效發(fā)揮作用，可能是髁突軟骨骨關(guān)節(jié)病樣變的重要分子機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 咬合； 顳下頜關(guān)節(jié)； 骨關(guān)節(jié)病； 軟骨； 甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白； PTH/PTHrP受體-1

[中圖分類(lèi)號(hào)] Q 26 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.003

顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）髁

突軟骨具有終身改建的能力，改建涉及軟骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過(guò)程，有許多信號(hào)分子參與其調(diào)控[1]。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（parathyroid hormone-related peptide，PTHrP）是調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)成骨過(guò)程的一個(gè)重要生長(zhǎng)因子，在機(jī)體正常組織中廣泛表達(dá)，具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、抑制其分化及凋亡的功能[2-4]。

PTH/PTHrP受體-1（parathyroid hormone receptor-1，

PTH1R）是目前發(fā)現(xiàn)的PTHrP的唯一受體，屬于G蛋

白偶聯(lián)受體家族，兩者結(jié)合后能產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)[5]。顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)?。╰emporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病最常見(jiàn)類(lèi)型之一，以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨重建及滑膜炎癥為主要病理特征[6-7]。目前，TMJOA發(fā)生的分子機(jī)制尚不明確，研究表明：膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)?。╫steoarth-

ritis，OA）關(guān)節(jié)軟骨中PTHrP/PTH1R表達(dá)異常與其病理進(jìn)展密切相關(guān)[8-11]。本實(shí)驗(yàn)首次建立單側(cè)前牙反不良修復(fù)體咬合紊亂的大鼠模型，觀察TMJ髁突軟骨受此異常咬合力刺激后的組織學(xué)改變及PTHrP/PTH1R的表達(dá)變化情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組

選取由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的6周齡雌性SD大鼠60只為研究對(duì)象，體重140～160 g。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)、等量分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行單側(cè)前牙粘接反不良修復(fù)體的操作，對(duì)照組不做任何處理，同樣條件下飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2 單側(cè)前牙反不良修復(fù)體咬合紊亂大鼠模型的

建立

實(shí)驗(yàn)組大鼠左側(cè)上下前牙粘接統(tǒng)一規(guī)格的金屬不良修復(fù)體，造成左側(cè)前牙反的異常咬合（圖1）。上前牙不良修復(fù)體的制作方法為：將25號(hào)通乳針切割成2.5 mm長(zhǎng)的金屬套筒；下前牙不良修復(fù)體的制作方法為：將20號(hào)注射器針頭一端3.5 mm處用鉗子鉗扁，彎制成與長(zhǎng)軸成45°的導(dǎo)板，在長(zhǎng)軸上4.5 mm處切割，作為下前牙金屬套筒冠。在麻醉、隔濕條件下粘接不良修復(fù)體，每天檢查，確保其不脫落（整個(gè)觀察期內(nèi)無(wú)脫落現(xiàn)象），直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 標(biāo)本的制備

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠雙側(cè)TMJ石蠟切片蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色未見(jiàn)明顯組織形態(tài)學(xué)差異，故分別于模型建立后2、4、8 周，脫頸法處死實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠各10只，整體取出左側(cè)TMJ，4%多聚甲醛固定1 d，10%乙二胺四乙酸（ethy-lenediamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣液脫鈣3周，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚約5 μm），行HE染色

和免疫組織化學(xué)染色。取各組動(dòng)物右側(cè)TMJ髁突軟骨凍存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

切片常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫作用10 min，復(fù)合消化液作用10 min，抗原修復(fù)液修復(fù)10 min，正常血清37 ℃封閉30 min，PTHrP多克隆抗體（1∶100）或PTH1R多克隆抗體（1∶50）（sc-9680、sc-20749，Santa Cruz公司，美國(guó)）4 ℃孵育過(guò)夜，次日37 ℃復(fù)溫30 min后，經(jīng)生物素化二抗工作液37 ℃孵育30 min，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（北京中杉金橋生物技術(shù)

有限公司）37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reac-

tion，PCR）檢測(cè)

根據(jù)Genbank中大鼠PTHrP及PTH1R核酸序列設(shè)計(jì)合成PCR引物。將髁突軟骨標(biāo)本置于液氮中速凍，取出后迅速搗碎，Trizol法提取RNA，定量，按照試劑盒步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用Takara公司的SYBR[R] Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒及ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，循環(huán)40次。

1.6 數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)分析

在Leica DM 2500顯微鏡下，應(yīng)用Leica Qwin軟件采集圖像，于100倍鏡視野下對(duì)TMJ髁突軟骨前、中、后部分別采圖。在Photoshop 8.0環(huán)境下選取髁突軟骨中1/3處前后向均衡分布的3個(gè)450 px×450 px測(cè)量框，測(cè)量框包括增殖層、肥大淺層和肥大層，計(jì)數(shù)所選測(cè)量框中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目百分比，取平均值作統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析比較各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組PTHrP、PTH1R陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目百分比及PTHrP mRNA、PTH1R mRNA的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

對(duì)照組髁突軟骨各層細(xì)胞排列整齊，界限清晰。8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨出現(xiàn)顯著退變，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目減少，排列稀疏；10個(gè)關(guān)節(jié)中有3個(gè)出現(xiàn)明顯無(wú)細(xì)胞區(qū)樣改變，病變區(qū)軟骨細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死，胞核固縮，核染色質(zhì)濃縮，局部出現(xiàn)嗜均質(zhì)染色（圖2）。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

PTHrP主要分布于髁突軟骨肥大淺層與肥大層。對(duì)照組8周與4周相比，PTHrP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目相當(dāng)，但8周時(shí)髁突軟骨明顯變薄，細(xì)胞總數(shù)減少，陽(yáng)性細(xì)胞率較4周組增加。與對(duì)照組相比，2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨中PTHrP陽(yáng)性細(xì)胞率明顯降低（P<0.05）；4、8

周時(shí)髁突軟骨中PTHrP陽(yáng)性細(xì)胞率增加（P<0.05，P<0.01）（圖3、4）。

PTH1R主要表達(dá)于髁突軟骨肥大淺層。對(duì)照組8周時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞率較4周時(shí)升高。與對(duì)照組相比，2、4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組PTH1R表達(dá)沒(méi)有明顯變化（均為P>0.05），8周時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少（P<0.01）（圖5、6）。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組PTHrP mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯下降（P<0.01），4、8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組PTHrP mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）。2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組PTH1R mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），4、8周時(shí)實(shí)

驗(yàn)組PTH1R mRNA表達(dá)明顯下降（均為P<0.01）（圖

7、8）。

3 討論

3.1 髁突軟骨OA樣變大鼠模型的建立

建立動(dòng)物模型是研究TMJOA的重要途徑。到目前為止，有多種方法建立TMJOA模型，如外科手術(shù)[12]、間歇性強(qiáng)制開(kāi)口的異常機(jī)械力[13]及基因缺陷小鼠的

自發(fā)性O(shè)A模型[11]等。自發(fā)性O(shè)A模型動(dòng)物來(lái)源受限且

疾病進(jìn)展緩慢；外科方法則需關(guān)節(jié)腔的開(kāi)放性手術(shù)。因此，上述方法均不能較好地模擬臨床TMJOA的發(fā)生過(guò)程[14]。由于TMJ的特殊受力方式及咬合因素在

TMJOA發(fā)生中的重要作用，筆者嘗試通過(guò)改變大鼠的正常咬合關(guān)系建立TMJOA模型，并成功建立了漸進(jìn)性咬合紊亂導(dǎo)致恒河猴、新西蘭大白兔以及SD大鼠髁突軟骨退行性變的動(dòng)物模型[15-17]。由于漸進(jìn)性

咬合紊亂大鼠模型建立的過(guò)程中，分牙皮筋及間隙充填的自凝材料脫落較為頻繁，因此設(shè)計(jì)了單側(cè)前牙反的大鼠模型，結(jié)果表明，大鼠單側(cè)前牙反8周后，雙側(cè)髁突軟骨出現(xiàn)了明顯的OA樣變，軟骨中PTHrP表達(dá)增加，其受體PTH1R表達(dá)則降低。

3.2 OA關(guān)節(jié)軟骨中PTHrP和PTH1R的表達(dá)

Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)：在出現(xiàn)明顯TMJOA表現(xiàn)之

前，髁突軟骨中PTHrP的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組。本研究中2周時(shí)髁突軟骨內(nèi)PTHrP的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，OA早期PTHrP表達(dá)的降低可能是晚期增殖軟骨細(xì)胞減少、成熟軟骨細(xì)胞增加的原因。本研究中4、8周時(shí)PTHrP的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，PTHrP的高表達(dá)可能是機(jī)體的一種代償性反應(yīng)，這與其他研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)：兔膝關(guān)節(jié)OA關(guān)節(jié)軟骨中PTHrP的表達(dá)升高且主要定位于增殖區(qū)域的軟骨細(xì)胞[18]。使用膝關(guān)節(jié)制動(dòng)法誘導(dǎo)兔膝關(guān)節(jié)OA，實(shí)驗(yàn)8周后關(guān)節(jié)軟骨中PTHrP的表達(dá)顯著高于正常組[9]。

Becher等[10] 研究發(fā)現(xiàn)：OA樣變關(guān)節(jié)軟骨中PTH1R陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少，且與OA形態(tài)及組織學(xué)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。Sanchez等[19]將OA的軟骨細(xì)胞與來(lái)源于正常和硬化區(qū)的軟骨下骨成骨細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，硬化區(qū)來(lái)源的成骨細(xì)胞可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞PTH1R基因的表達(dá)顯著降低。本研究中2、4周時(shí)PTH1R表達(dá)的變化不明顯，而8周時(shí)髁突軟骨中PTH1R mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組，因此PTH1R表達(dá)的降低可能是TMJOA病變程度加劇的一個(gè)重要表現(xiàn)。

PTHrP可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞肥大分化，OA時(shí)異?；罨梢匝泳徿浌羌?xì)胞丟失，是機(jī)體對(duì)退變病損的一種保護(hù)性反應(yīng)，具有促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用[9]。軟骨細(xì)胞通過(guò)凋亡或壞死而死

亡，是OA軟骨退變的重要病理特征，也是OA進(jìn)展的主要原因。Henderson等[4]研究發(fā)現(xiàn)：PTHrP有抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用。然而OA關(guān)節(jié)軟骨中PTH1R的表達(dá)明顯減少，PTHrP的作用不能充分發(fā)揮。

綜上所述，單側(cè)前牙反不良修復(fù)體可導(dǎo)致TMJ髁突軟骨出現(xiàn)退行性變，PTHrP的表達(dá)升高和PTH1R的表達(dá)降低。高表達(dá)的PTHrP未能與足夠的PTH1R相結(jié)合，不能有效地發(fā)揮作用，這可能是髁突軟骨OA樣變的重要分子機(jī)制之一。因?yàn)轭A(yù)實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)雙側(cè)關(guān)節(jié)明顯組織形態(tài)學(xué)差異，本實(shí)驗(yàn)將左右側(cè)關(guān)節(jié)分開(kāi)，一側(cè)用于免疫組化染色，另一側(cè)用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩側(cè)結(jié)果較吻合。然而，單側(cè)前牙反的異常咀嚼造成兩側(cè)TMJ的運(yùn)動(dòng)方式不一致，兩側(cè)關(guān)節(jié)OA樣變或許還有不同，仍需進(jìn)一步研究。

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（本文采編 陳謙明）