TRAIL與kallistatin聯(lián)合表達(dá)載體的構(gòu)建及抗腫瘤活性分析

王曉， 黃曉平， 刁勇

(1. 華僑大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 福建 泉州 362021； 2. 華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 福建 泉州 362021)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是一種內(nèi)源性分泌肽，在外源細(xì)胞凋亡途徑中與跨膜死亡配體受體DR4，DR5結(jié)合，激活DR4，DR5分子胞漿的死亡結(jié)構(gòu)域，并通過(guò)激活胱天蛋白酶(caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡.級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的Fasl和TNF-α都有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，但Fasl會(huì)導(dǎo)致致命的肝損傷，而TNF-α可能會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[1-2].TRAIL特異性地誘導(dǎo)肺癌、乳腺癌等多種癌細(xì)胞凋亡，且不會(huì)誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡.臨床數(shù)據(jù)顯示,TRAIL產(chǎn)生耐藥性與蛋白激酶和受體有關(guān)[3-4].聯(lián)合用藥既可以增強(qiáng)抗腫瘤活性又可以避免產(chǎn)生耐藥性，成為TRAIL用于腫瘤治療的研究方向.

組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白(kallistatin)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，具有抗腫瘤作用[5-6].將kallistatin與TRAIL聯(lián)合使用是否會(huì)增強(qiáng)TRAIL的抗腫瘤活性，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道.因此，本文設(shè)計(jì)pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL重組載體，通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)同時(shí)表達(dá)TRAIL與kallistatin，經(jīng)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TRAIL與kallistatin聯(lián)合使用的抗腫瘤活性.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

菌種、細(xì)胞株和質(zhì)粒E.coilDH5α，pAM-CAG，pIRES-eGFP，pCDNA3.1-Kal，pCDNA3.1-TRAIL 為本實(shí)驗(yàn)室保存；A549，LO-2，NCI-H446和Hela細(xì)胞株購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù).

HindⅢ,EcoRⅠ,SpeⅠ,BamHⅠ等限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶、Taq DNA聚合酶(大連寶生物工程有限公司)；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒(北京天根生物科技有限公司)；兔抗kallistatin、鼠抗TRAIL單克隆抗體，羊抗兔、羊抗鼠二抗(英國(guó)Abcam公司)；kallistatin，TRAIL酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA，美國(guó)R&D公司)；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司).

表1 擴(kuò)增目的基因的PCR引物Tab.1 PCR primers for amplifying target gene

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 報(bào)道的TRAIL,IRES,kallistatin基因序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)，分別從pIRES-eGFP，pCDNA3.1-TRAIL，pCDNA3.1-Kal質(zhì)粒中擴(kuò)增得到IRES，TRAIL和kallistatin目的基因.

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 1) pAM-CAG-TRAIL的構(gòu)建.通過(guò)PCR方法從pCDNA3.1-TRAIL中擴(kuò)增TRAIL目的基因，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并對(duì)目的基因回收，回收的目的基因通過(guò)HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切回收，利用T4 DNA連接酶將目的基因TRAIL定向克隆至pAM-CAG質(zhì)粒的HindⅢ/EcoRⅠ酶切位點(diǎn).

2) pAM-CAG-Kal的構(gòu)建.采用PCR方法從pCDNA3.1-Kal中擴(kuò)增Kal目的基因，通過(guò)瓊脂糖凝聚電泳鑒定并對(duì)目的基因回收，目的基因通過(guò)BamHⅠ/SpeⅠ雙酶切回收，利用T4 DNA連接酶將目的基因Kal定向克隆至pAM-CAG質(zhì)粒的BamHⅠ/SpeⅠ酶切位點(diǎn).

3) pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL的構(gòu)建.采用PCR方法從pIRES-eGFP質(zhì)粒中擴(kuò)增IRES目的基因，將其克隆至pAM-CAG-Kal質(zhì)粒的SpeⅠ/EcoRⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成pAM-CAG-Kal-IRES重組質(zhì)粒，再將TRAIL目的基因克隆至pAM-CAG-Kal-IRES質(zhì)粒的HindⅢ/EcoRⅠ位點(diǎn)之間，形成pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL重組質(zhì)粒.

1.2.3 重組表達(dá)載體的表達(dá)與鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒pAM-CAG-TRAIL，pAM-CAG-Kal，pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶鑒定，再經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序分析正確后，將提取的質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000混合后轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中，培養(yǎng)一定時(shí)間后收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞，利用ELISA和western blotting方法鑒定TRAIL與kallistatin的表達(dá)情況.

1.2.4 TRAIL與kallistatin聯(lián)合表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力的影響 A549,LO-2,NCI-H446,Hela細(xì)胞分別以5 000個(gè)·孔-1的密度接種至96孔板，37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染pAM-CAG-eGFP,pAM-CAG-TRAIL,pAM-CAG-Kal,pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72 h，每孔加入10 μL 5 mg·mL-1噻唑藍(lán)(MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄培養(yǎng)基，加入200 μL 二甲基亞砜(DMSO)溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm時(shí)的吸光值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力.

1.2.5 TRAIL與kallistatin對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549,LO-2,NCI-H446,Hela細(xì)胞，6孔板每孔接種50 000個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)12 h，用脂質(zhì)體2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)36 h，胰酶消化并收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，磷酸鹽緩沖液清洗2次；去上清并用緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)·mL-1，取100 μL細(xì)胞懸液至5 mL離心管中，加入5 μL 碘化丙啶(PI)染液和5 μL Annexin-FITC染液，混勻后避光，室溫染色15 min，加入400 μL 結(jié)合緩沖液混勻后,進(jìn)行流式細(xì)胞分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的鑒定

pAM-CAG-TRAIL,pAM-CAG-Kal,pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL的酶切鑒定結(jié)果，如圖1所示.pAM-CAG-TRAIL通過(guò)HindⅢ，EcoRⅠ單酶切未見(jiàn)特異性的條帶，但經(jīng)HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切后，在500 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶(圖1(a))，與目的基因TRAIL的大小相符(516 bp)；pAM-CAG-Kal通過(guò)BamHⅠ/SpeⅠ雙酶切后，在1 200 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與目的基因kallistatin的大小一致(圖1(b))；pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL分別經(jīng)過(guò)HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切和BamHⅠ/SpeⅠ雙酶切后，在500,1 200 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖1(c))，說(shuō)明目的基因kallistatin與TRAIL已經(jīng)克隆至pAM-CAG載體中.構(gòu)建的3種重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序分析結(jié)果顯示，插入目的基因序列完全正確.

(a) pAM-CAG-TRAIL (b) pAM-CAG-Kal (c) pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL 圖1 pAM-CAG-TRAIL, pAM-CAG-Kal, pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of pAM-CAG-TRAIL, pAM-CAG-Kal, and pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL by restriction endonuclease

2.2 TRAIL與kallistatin的表達(dá)與鑒定

TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡需要與死亡受體結(jié)合才能啟動(dòng)凋亡信號(hào)，而可溶性的TRAIL位于胞外區(qū)，必須在細(xì)胞外才能與受體結(jié)合.采用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基中TRAIL的質(zhì)量濃度(ρ(TRAIL))，結(jié)果如圖2(a)所示.由圖2(a)可知：轉(zhuǎn)染pAM-CAG-TRAIL質(zhì)粒組的TRAIL的質(zhì)量濃度為(1.85±0.18) μg·mL-1，轉(zhuǎn)染pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL質(zhì)粒組的TRAIL的質(zhì)量濃度為(1.65±0.24) μg·mL-1，兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而轉(zhuǎn)染pAM-CAG-Kal，pAM-CAG-eGFP質(zhì)粒組沒(méi)有檢測(cè)到TRAIL的表達(dá).

(a) TRAIL (b) kallistatin圖2 培養(yǎng)上清中TRAIL與kallistatin的表達(dá)量Fig.2 Expression of TRAIL and kallistatin in culture supernatant

kallistatin具有信號(hào)肽，是一種分泌性蛋白，培養(yǎng)基中kallistatin的質(zhì)量濃度(ρ(kallistatin))，如圖2(b)所示.由圖2(b)可知：轉(zhuǎn)染pAM-CAG-Kal質(zhì)粒組kallistatin的質(zhì)量濃度為(12.08±0.21) μg·mL-1，轉(zhuǎn)染pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL質(zhì)粒組kallistatin的質(zhì)量濃度為(11.73±0.37) μg·mL-1，兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

此外，利用western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TRAIL和kallistatin的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知：轉(zhuǎn)染pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL和pAM-CAG-TRAIL質(zhì)粒組細(xì)胞內(nèi)都有TRAIL的表達(dá);轉(zhuǎn)染pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL和pAM-CAG-Kal質(zhì)粒組細(xì)胞內(nèi)都有kallistatin的表達(dá).

(a) TRAIL (b) kallistatin圖3 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TRAIL與kallistatin表達(dá)Fig.3 Expression of trail and kalistatin in cells by western blotting

2.3 TRAIL與kallistatin聯(lián)合表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力的影響

TRAIL與kallistatin對(duì)細(xì)胞活力的影響,如圖4所示.圖4中：η為細(xì)胞存活率；*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.由圖4可知：分別轉(zhuǎn)染pAM-CAG-Kal，pAM-CAG-TRAIL，pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL質(zhì)粒后，LO-2細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;分別轉(zhuǎn)染pAM-CAG-Kal，pAM-CAG-TRAIL，pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL質(zhì)粒后，A549細(xì)胞存活率為78.3%±4.3%，67.4%±3.5%，53.7%±4.1%，pAM-CAG-Kal,pAM-CAG-TRAIL組與pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明聯(lián)合表達(dá)TRAIL和kallistatin能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞的抗腫瘤活性;Hela細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pAM-CAG-Kal,pAM-CAG-TRAIL,pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL組的細(xì)胞存活率明顯下降，分別為76.4%±5.3%，66.4%±4.3%，52.7%±3.5%，與轉(zhuǎn)染pAM-CAG-eGFP組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且TRAIL，kallistatin雙表達(dá)組的細(xì)胞存活率與pAM-CAG-TRAIL，pAM-CAG-Kal組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明聯(lián)合表達(dá)促進(jìn)TRAIL的抗腫瘤活性;NCI-H446細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，聯(lián)合表達(dá)TRAIL與kallistatin能夠顯著增強(qiáng)其抗腫瘤活性；Hela，A549和NCI-H446細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRAIL與kallistatin聯(lián)合表達(dá)后腫瘤細(xì)胞活力接近半數(shù)抑制濃度IC50.

(a) LO-2細(xì)胞 (b) A549細(xì)胞

(c) Hela細(xì)胞 (d) NCI-H446細(xì)胞圖4 TRAIL與kallistatin對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effects of TRAIL and kallistatin on cells activity

2.4 TRAIL與kallistatin聯(lián)合表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

TRAIL與kallistatin對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，如圖5所示.圖5中：δ為細(xì)胞凋亡率.由圖5可知：TRAIL與kallistatin對(duì)LO-2細(xì)胞凋亡沒(méi)有影響，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而TRAIL與kallistatin能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率分別為5.22%±0.34%，8.02%±0.45%，聯(lián)合表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率為10.98%±0.84%，與對(duì)照組相比，差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Hela細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，pAM-CAG-Kal與pAM-CAG-TRAIL組的細(xì)胞都有不同程度的凋亡，細(xì)胞凋亡率分別為5.81%±0.56%，8.62%±0.49%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率達(dá)為12.00%±0.65%；TRAIL與kallistatin誘導(dǎo)NCI-H446細(xì)胞凋亡率分別為4.95%±0.43%，7.95%±0.51%，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率為11.24%±0.85%.凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TRAIL與kallistatin能夠誘導(dǎo)A549,Hela和NCI-H446細(xì)胞凋亡，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率與TRAIL和kallistatin組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明TRAIL與kallistatin聯(lián)合使用增強(qiáng)了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能.

(a) LO-2細(xì)胞 (b) A549細(xì)胞

(c) Hela細(xì)胞 (d) NCI-H446細(xì)胞圖5 TRAIL與kallistatin對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effects of TRAIL and kallistatin on cells apoptosis

3 討論

腫瘤形成及發(fā)展是由多基因、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，只進(jìn)行單一的基因治療容易忽略腫瘤變化過(guò)程中眾多相對(duì)獨(dú)立突變間的相互關(guān)系.自從1986年Seno等[7]成功地從大腸桿菌聯(lián)合表達(dá)IFN-γ/IL-2后，越來(lái)越多基因聯(lián)合治療腫瘤的研究被報(bào)道.腫瘤的多基因聯(lián)合治療可以是同一治療方法的兩種不同目的基因的聯(lián)合, 也可以是不同方案基因之間的聯(lián)合，要求清楚明確各個(gè)基因的治療作用機(jī)理，重點(diǎn)是兩個(gè)甚至多個(gè)具有協(xié)同作用治療基因的選擇[8].對(duì)于大多數(shù)來(lái)自骨髓、前列腺、乳腺的惡性腫瘤細(xì)胞，TRAIL具有細(xì)胞毒性和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，且TRAIL對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有凋亡的誘導(dǎo)作用.以往研究表明，TRAIL可誘導(dǎo)人神經(jīng)蝕質(zhì)瘤細(xì)胞株(CRT2MG,U872MG)凋亡[9]，消退乳腺癌組織，并且可以劑量依賴性地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和腫瘤的清除[10].與TRAIL相關(guān)的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行,如Geng等[11]將TRAIL應(yīng)用于骨髓瘤的治療.當(dāng)TRAIL與受體TRAILR1和TRAILR2結(jié)合后，誘發(fā)受體在細(xì)胞膜上發(fā)生三聚化并活化caspase-8，啟動(dòng)兩條信號(hào)通路傳遞凋亡信號(hào)，進(jìn)而激活下游效應(yīng)蛋白caspase-3，caspase-6或caspase-7，caspase-9，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12].kallistatin是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑.研究發(fā)現(xiàn),kallistatin可以抑制NF-κB，PI3K-AKT，nucleolin等信號(hào)通路的激活[13-15]，這可能為kallistain與TRAIL聯(lián)合用藥增強(qiáng)其抗腫瘤活性提供依據(jù).

文中構(gòu)建的雙表達(dá)載體pAG-CAG-Kal-IRES-TRAIL在Hela細(xì)胞中檢測(cè)到TRAIL與kallistatin的表達(dá)，IRES串聯(lián)的下游基因的翻譯并沒(méi)有受到影響，TRAIL表達(dá)量與pAG-CAG-TRAIL相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，研究結(jié)果與Ponnazhagan等[16]一致.細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，TRAIL與kallistatin聯(lián)合用藥可以發(fā)揮各基因的特點(diǎn)，明顯增強(qiáng)TRAIL和kallistatin的抗腫瘤活性，這預(yù)示著聯(lián)合用藥可能是TRAIL治療腫瘤的一個(gè)方向.