輔酶Q10經(jīng)蛋白激酶A/胞漿型磷脂酶A2信號(hào)通路抑制血小板血栓素A2的生成

牙甫禮，張春梅，陳彬林，谷仕艷，賈小娥

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所，云南 大理 671000；2.河口海關(guān)，云南 河口 661300；3.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院營(yíng)養(yǎng)科，廣西 南寧 530000）

心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已經(jīng)成為威脅我國(guó)人民健康的主要問題和突出的公共衛(wèi)生問題，動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成是心血管疾病共同的病理變化[1]。誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。╝therosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）的危險(xiǎn)因素很多，主要包括年齡、血脂紊亂、肥胖、糖尿病等。近年來大量報(bào)道證明血小板在ASCVD病程中具有重要作用[2-3]。

血小板是成熟巨核細(xì)胞上脫落下來的細(xì)胞質(zhì)碎片，是循環(huán)血液中的一種有形細(xì)胞，其主要生理功能是參與止血和凝血[4]。然而，當(dāng)血小板受到病理性刺激時(shí)，尤其在心血管疾病中，血小板可發(fā)生激活、聚集以及釋放炎癥因子等參與動(dòng)脈粥樣硬化和血栓的發(fā)生和發(fā)展過程，進(jìn)而在ASCVD病程中發(fā)揮重要作用[5-6]。在血小板發(fā)生活化的過程中，其生成的血栓素A2（thromboxane A2，TxA2）被認(rèn)為是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成的重要物質(zhì)，抑制血小板TxA2生成對(duì)于防治心血管疾病中血栓的形成至關(guān)重要[7-8]。在冠心病、糖尿病和高脂血癥等疾病中，血小板受到血液中可溶性激動(dòng)劑如凝血酶和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）等刺激時(shí)，胞內(nèi)眾多復(fù)雜的信號(hào)通路被激活，最終可促進(jìn)TxA2生成[7]。TxA2半衰期很短（約30 s）且極不穩(wěn)定，其生成后在半衰期內(nèi)可通過自分泌和旁分泌的方式作用于鄰近血小板、白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面的凝血惡烷前列腺素類（thromboxane prostanoid，TP）受體，進(jìn)而介導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，如激活血小板、對(duì)血小板聚集和炎癥因子的釋放發(fā)揮放大效應(yīng)，進(jìn)而參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程[8-9]。隨后，TxA2立即被代謝生成穩(wěn)定形式的血栓素B2（thromboxane B2，TxB2），TxB2從血小板釋放出后可進(jìn)一步作用于其鄰近的細(xì)胞，參與動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成[7]。由于TxB2較為穩(wěn)定，血小板釋放的TxB2水平常可用來反映胞內(nèi)TxA2生成情況[10-11]。血小板中TxA2生成受多種信號(hào)蛋白分子的調(diào)控，血小板激動(dòng)劑如凝血酶、ADP和膠原等通過激活血小板表面相應(yīng)的受體，進(jìn)而激活胞內(nèi)一系列的信號(hào)通路，導(dǎo)致胞漿型磷脂酶A2（cytosolic phospholipase A2，cPLA2）發(fā)生磷酸化，使得花生四烯酸從細(xì)胞膜磷脂釋放出，最終在環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）和過氧化酶作用下生成TxA2；因此，cPLA2的活化在調(diào)控TxA2生成的過程中起關(guān)鍵作用[7]。

cPLA2的活化受多種信號(hào)通路的調(diào)控，其中蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）介導(dǎo)的信號(hào)通路在其中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12-13]。研究表明，PKA信號(hào)通路對(duì)于負(fù)性調(diào)控血小板功能發(fā)揮著重要作用，激活該信號(hào)通路可使血小板血管擴(kuò)張刺激磷蛋白酶發(fā)生磷酸化，進(jìn)而抑制cPLA2磷酸化、血小板TxA2生成和顆粒物的釋放等，從而抑制血小板聚集、活化和血栓形成[14]。 另外，PKA也可通過抑制鈣離子動(dòng)員和MAPKs信號(hào)通路（包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2、c-Jun氮端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）1/2和p38 MAPK）發(fā)揮抑制cPLA2磷酸化和TxA2生成的作用[7,13]。

營(yíng)養(yǎng)膳食干預(yù)在心血管疾病，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化和血栓性疾病的早期防治中起著重要的作用[15]。輔酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）是一種類似于維生素的脂溶性苯醌，在動(dòng)物臟器（心臟、肝臟、腎臟）、牛肉、豆油、花生等食物中含量相對(duì)較高[16]。大量的流行病學(xué)、臨床實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，CoQ10具有抑制心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、線粒體疾病等的作用，其機(jī)制主要包括抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂和改善內(nèi)皮細(xì)胞等[17]。關(guān)于CoQ10對(duì)血小板功能調(diào)控作用的研究較少，僅有部分研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射外源性CoQ10能顯著降低小腸缺血性再灌注動(dòng)物模型的血小板活化與聚集[18]；健康成人每天服用100 mg CoQ10可以顯著減小外周血中血小板體積，并能顯著降低血小板整合素αVβ3受體的表達(dá)[19]。本課題組前期進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人群干預(yù)研究結(jié)果表明，CoQ10可抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的人和小鼠血小板聚集和活化以及血栓形成，其中的機(jī)制可能是CoQ10抑制血小板整合素αIIbβ3介導(dǎo)的信號(hào)通路和上調(diào)cAMP/PKA信號(hào)通路[20-22]。但目前CoQ10是否影響血小板TxA2的生成尚鮮見報(bào)道，因此本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討CoQ10對(duì)血小板TxA2生成的影響及其調(diào)控機(jī)制，為CoQ10防治心血管疾病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CoQ10粉末（純度≥98%）、凝血酶（活 力≥2000 NIH units/mg）、PKA特異性抑制劑H89 美國(guó) Sigma-Aldrich公司；膠原 美國(guó)Chrono-log公司；Convulxin、苯乙酮 德國(guó)Cayman Chemical公司；一抗phospho-cPLA2（Ser505）、β-actin以及二抗羊抗兔 美國(guó)Cell Signaling Technology公司；TxB2檢測(cè)試劑盒 美國(guó)Enzo Life Sciences公司；雙辛丁酸（bicinchonic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒 中國(guó)Beyotime 公司。其他試劑均為色譜級(jí)（純度≥95%），實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

21號(hào)一次性采血針、真空負(fù)壓采血管和一次性注射器 湖南瀏陽(yáng)市醫(yī)用儀器廠；低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；小型高速離心機(jī) 美國(guó)Grant-Bio公司；多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)BMG LabTech公司；低溫冰箱 青島 海爾有限公司；萬分之一分析天平 瑞士Swiss公司。

1.3 方法

1.3.1 研究對(duì)象的篩選

從大理大學(xué)校內(nèi)招募15 名健康成年志愿者（年齡25～40 歲），志愿者要求在至少2 周內(nèi)未服用任何抗血小板的藥物（包括臨床上常用于治療血栓性疾病的藥物，如阿司匹林、P2Y12受體拮抗劑、αIIbβ3受體抑制劑和磷酸二酯酶抑制劑等），至少近4 周內(nèi)無每天飲用茶、咖啡和紅酒，且近半年內(nèi)未補(bǔ)充CoQ10、維生素等膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充產(chǎn)品；無吸煙（指每天吸卷煙≥1 支，且持續(xù)或累計(jì)6 個(gè)月）、酗酒（指成年男性每日飲酒量超過25 g，女性超過15 g）等不良生活習(xí)慣。志愿者出現(xiàn)以下至少1 種情況將予以排除，包括現(xiàn)在或既往患有冠心病、中風(fēng)、糖尿病、高血壓、高血脂、免疫缺陷病、惡性腫瘤、血小板功能障礙等血液系統(tǒng)疾病等病史；或者濫用藥物、酗酒、吸煙半年以上；或現(xiàn)正服用或半年內(nèi)服用任何影響血小板功能的藥物等。該研究實(shí)施前，每個(gè)志愿者均已簽署知情同意書，且該研究已通過大理大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并完全按照赫爾辛基宣言和體制準(zhǔn)則進(jìn)行。

1.3.2 健康人血樣及純化血小板的制備

健康志愿者在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，采用21號(hào)一次性采血針，抽取肘靜脈血15 mL，注入含枸櫞酸鈉的真空抗凝管中（V（血樣）∶V（抗凝劑）＝9∶1），輕輕混勻，室溫下靜置15 min后離心（300×g、7 min、22 ℃），為避免吸到白細(xì)胞層和紅細(xì)胞層，小心吸取上層3/4體積的上清液即可得到富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），剩余血樣離心（10000×g、15 min、22 ℃），小心吸取上清液得到貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP），PRP和PPP放入37 ℃恒溫孵育箱中備用。純化血小板的制備過程采用本實(shí)驗(yàn)室成熟的純化血小板分離方法[21-23]，通過Sepharose CL-2B凝膠系統(tǒng)純化PRP進(jìn)行純化血小板的制備。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

本研究涉及的實(shí)驗(yàn)組別有：靜息組：既不經(jīng)激動(dòng)劑（如凝血酶、膠原和Convulxin）激活，也不經(jīng)二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）處理；DMSO組：即溶劑對(duì)照組，在血小板懸液中加入體積分?jǐn)?shù)0.05%的DMSO；CoQ10組：分別經(jīng)1、10 μmol/L和100 μmol/L CoQ10處理；苯乙酮組：血小板經(jīng)1 μmol/L的苯乙酮處理；CoQ10+苯乙酮組：血小板經(jīng)100 μmol/L CoQ10和1 μmol/L的苯乙酮聯(lián)合處理；H89組：血小板經(jīng)10 μmol/L的H89處理；CoQ10+H89組：血小板經(jīng)100 μmol/L CoQ10和10 μmol/L的H89聯(lián)合處理。除了靜息組外，其他各組血小板均經(jīng)激動(dòng)劑誘導(dǎo)激活。

1.3.4 血小板TxB2釋放水平的檢測(cè)

血小板TxB2釋放水平的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)。用不同濃度（1、10、100 μmol/L）的CoQ10或溶劑對(duì)照與健康成人純化血小板（1×108個(gè)/mL）在體外共同孵育50 min，然后加入1 mmol/L的CaCl2溶液，用0.5 U/mL 的凝血酶或2 μg/mL的膠原或50 ng/mL的Convulxin激活血小板5 min后，放于冰上終止反應(yīng)，然后離心（10000×g、15 min、4 ℃），收集上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于檢測(cè)血小板釋放TxB2水平。

進(jìn)一步在cPLA2特異性抑制劑苯乙酮或者PKA特異性抑制劑H89存在的條件下，考察CoQ10對(duì)TxA2生成水平的調(diào)控作用。1 μmol/L苯乙酮或10 μmol/L H89提前與血小板共同孵育30 min，然后用100 μmol/L CoQ10或溶劑對(duì)照與血小板共同孵育50 min，并加入1 mmol/L CaCl2溶液，用0.5 U/mL凝血酶或者2 μg/mL膠原激活血小板5 min后，放于冰上終止反應(yīng)，然后離心（10000×g、15 min、4 ℃），收集上清液，檢測(cè)血小板釋放的TxB2水平。

1.3.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

用不同濃度（1、10、100 μmol/L）的CoQ10或者溶劑對(duì)照與健康成人純化血小板（2.5×108個(gè)/mL）在體外共同孵育50 min，然后加入1 mmol/L CaCl2溶液，用0.5 U/mL的凝血酶或2 μg/mL的膠原激活血小板5 min后，放于冰上終止反應(yīng)，然后離心（10000×g、15 min、4 ℃），棄上清液。向血小板沉淀中加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，然后置于冰上裂解30 min，離心（12000×g、15 min、4 ℃），收集上清液得到血小板蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后分別加入一抗（phospho-cPLA2、β-actin）和二抗，然后用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶曝光，并用Quantity One軟件分析條帶灰度，計(jì)算蛋白表達(dá)相對(duì)表達(dá)量[21-23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用Bonferroni Post-hoc Analysis法進(jìn)行組間兩兩比較，雙側(cè)P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CoQ10對(duì)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成的影響

圖 1 CoQ10對(duì)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成的影響Fig. 1 Effect of CoQ10 on agonist-induced platelet TxA2 generation

由于激動(dòng)劑激活血小板生成的TxA2不穩(wěn)定，極易被代謝生成穩(wěn)定的代謝物TxB2，因此通常檢測(cè)TxB2的水平，用TxB2質(zhì)量濃度反映血小板TxA2的生成情況[10-11]。如圖1A～C所示，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與靜息組相比，DMSO組TxB2質(zhì)量濃度高度顯著升高（P＜0.001）， 表明血小板激動(dòng)劑凝血酶、膠原和糖蛋白VI激動(dòng)劑Convulxin激活后血小板TxA2生成水平顯著提高。經(jīng)不同濃度CoQ10預(yù)處理后，與DMSO組相比，雖然1 μmol/L CoQ10對(duì)凝血酶和膠原誘導(dǎo)的血小板TxA2生成水平?jīng)]有顯著影響（P＞0.05），但是10 μmol/L和100 μmol/L的CoQ10可顯著降低血小板TxA2生成水平（P＜0.05、P＜0.01）。 在Convulxin刺激下，僅100 μmol/L的CoQ10可極顯著抑制血小板TxA2生成水平（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，CoQ10可顯著抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成。

2.2 CoQ10對(duì)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板cPLA2活化的影響

圖 2 CoQ10對(duì)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板cPLA2磷酸化的影響Fig. 2 Effect of CoQ10 on agonist-induced platelet cPLA2 phosphorylation

大量研究表明，cPLA2蛋白酶活化對(duì)于調(diào)控血小板TxA2的生成起關(guān)鍵作用，當(dāng)cPLA2活化時(shí)，表現(xiàn)為其Ser505位點(diǎn)發(fā)生磷酸化[7]。如圖2A、B所示，與靜息組相比，當(dāng)血小板與DMSO共同孵育后，受到激動(dòng)劑凝血酶和膠原的刺激時(shí)cPLA2（Ser505）磷酸化水平高度顯著升高（P＜0.001）。當(dāng)CoQ10與血小板共同孵育后，100 μmol/L的CoQ10可顯著下調(diào)凝血酶誘導(dǎo)的血小板cPLA2（Ser505）磷酸化水平，與DMSO組相比差異高度顯著（P＜0.001）；然而較低濃度（1 μmol/L和10 μmol/L）的CoQ10則不能抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板cPLA2（Ser505）發(fā)生磷酸化（P＞0.05）。與DMSO組相比，1、10 μmol/L和100 μmol/L的CoQ10均可高度顯著降低膠原誘導(dǎo)的血小板cPLA2（Ser505）磷酸化水平 （P＜0.001）。以上結(jié)果表明，CoQ10可顯著抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板cPLA2活化。

2.3 cPLA2活化在CoQ10抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成中的作用

前期研究已發(fā)現(xiàn)，CoQ10可顯著抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成以及cPLA2活化，但是CoQ10抑制TxA2生成是否通過其下調(diào)cPLA2磷酸化水平尚不清楚。由 圖3A、B可知，與DMSO組相比，cPLA2的特異性抑制劑苯乙酮可極顯著抑制凝血酶和膠原誘導(dǎo)的血小板TxA2生成（P＜0.01）；此外，1 μmol/L苯乙酮和100 μmol/L CoQ10聯(lián)合處理組與單獨(dú)的1 μmol/L苯乙酮處理、100 μmol/L CoQ10處理組相比，對(duì)TxA2生成的影響無顯著差異 （P＞0.05），表明1 μmol/L苯乙酮和100 μmol/L CoQ10聯(lián)合使用時(shí)對(duì)TxA2生成的抑制作用無相加或協(xié)同作用。以上結(jié)果說明，CoQ10抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成主要通過抑制cPLA2活化來實(shí)現(xiàn)。

圖 3 cPLA2活化在CoQ10抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成中的作用Fig. 3 Roles of cPLA2 activation in CoQ10-inhibited platelet TxA2 generation induced by agonists

2.4 PKA介導(dǎo)的信號(hào)通路在CoQ10調(diào)控激動(dòng)劑誘導(dǎo)的 血小板cPLA2活化和TxA2生成中的作用

圖 4 PKA信號(hào)通路在CoQ10抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板cPLA2活化（A）和TxA2生成（B）中的作用Fig. 4 Roles of PKA signaling pathway in the inhibitory effect of CoQ10 to platelet cPLA2 activation (A) and TxA2 generation (B) induced by thrombin

CoQ10通過激活環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/PKA介導(dǎo)的信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮抑制血小板激活、聚集和血栓形成的作用[21]。因此，進(jìn)一步探討CoQ10抑制血小板cPLA2活化和TxA2生成是否受其激活cAMP/PKA信號(hào)通路所調(diào)控。由圖4A可知，PKA特異性抑制劑H89對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板cPLA2磷酸化的影響與DMSO組相比無顯著差異（P＞0.05），表明凝血酶誘導(dǎo)的cPLA2磷酸化水平可能已達(dá)到最大值；10 μmol/L H89與100 μmol/L CoQ10聯(lián)合處理組與DMSO組相比無顯著差異（P＞0.05），表明10 μmol/L H89幾乎可完全逆轉(zhuǎn)100 μmol/L CoQ10對(duì)凝血酶誘導(dǎo)cPLA2磷酸化的抑制作用。H89對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板TxA2生成的影響與cPLA2磷酸化類似（圖4B）。以上結(jié)果表明，CoQ10抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板cPLA2活化和TxA2生成主要通過激活PKA介導(dǎo)的信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)?？傊狙芯拷Y(jié)果表明，CoQ10抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成的主要機(jī)制是調(diào)控PKA/cPLA2介導(dǎo)的信號(hào)通路。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化性和血栓性心血管疾病，如中風(fēng)、冠心病等，已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)的重要疾病，血小板TxA2的異常生成和分泌在心血管疾病發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。抑制血小板TxA2的生成及其介導(dǎo)的信號(hào)通路已經(jīng)成為防治動(dòng)脈粥樣硬化和血栓性心血管疾病的重要靶標(biāo)之一。開發(fā)研究抑制調(diào)控TxA2合成通路中的關(guān)鍵酶（包括COX和cPLA2等）以及抑制TxA2受體（如TP受體）對(duì)于抑制TxA2介導(dǎo)的血栓形成至關(guān)重要[7]。目前，市面上已出現(xiàn)的一些抗血小板藥物可通過抑制TxA2信號(hào)通路發(fā)揮有效抑制血栓形成的作用，其中最重要的是阿司匹林，其作用機(jī)制主要是抑制COX[24]。此外，奧扎格雷可抑制血栓素合成酶的活性，利多格雷可作為TP受體的拮抗劑[7]。但是這些藥物發(fā)揮抗血栓形成作用的過程中往往伴有嚴(yán)重的副反應(yīng)，其中最嚴(yán)重的是易導(dǎo)致出血以及藥物性抵抗等，因此在心血管疾病尤其是血栓性疾病的早期治療中受到很大的限制[25]。臨床干預(yù)研究證實(shí)，CoQ10是一種較為安全的膳食補(bǔ)充劑，可長(zhǎng)期使用以防治心血管疾病，而且鮮有出血副反應(yīng)的報(bào)道[26]。本研究通過使用體外實(shí)驗(yàn)的方法闡明CoQ10可顯著抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成，這為膳食補(bǔ)充CoQ10防治血栓性疾病提供新的理論依據(jù)。

調(diào)控血小板TxA2生成的機(jī)制復(fù)雜，cPLA2的活化在其中起關(guān)鍵作用[7]。當(dāng)血小板受到血液中可溶性激動(dòng)劑如凝血酶、ADP等或者損傷血管內(nèi)皮暴露的膠原蛋白刺激時(shí)，可促發(fā)胞內(nèi)一系列信號(hào)傳導(dǎo)事件，如激活糖蛋白VI信號(hào)通路、G蛋白偶聯(lián)受體和鈣離子動(dòng)員等，最終導(dǎo)致血小板cPLA2磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)TxA2的生成[9]。CoQ10抑制凝血酶和膠原誘導(dǎo)血小板TxA2生成的主要機(jī)制是抑制cPLA2活化，因?yàn)閏PLA2的特異性抑制劑苯乙酮與CoQ10聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)TxA2生成的抑制作用無相加或協(xié)同作用。其他信號(hào)通路也可能在CoQ10調(diào)控血小板TxA2生成的過程中起調(diào)控作用，這需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。此外，前期研究結(jié)果表明cAMP/PKA信號(hào)通路在CoQ10抑制血小板活化、聚集和血栓形成中具有重要作用[14]， 本研究發(fā)現(xiàn)CoQ10抑制cPLA2活化和TxA2生成受其激活PKA信號(hào)通路的調(diào)控作用，因?yàn)镻KA抑制劑H89可完全逆轉(zhuǎn)CoQ10的作用。因此可以推斷，CoQ10可能通過激活cAMP/PKA信號(hào)通路抑制cPLA2活化和TxA2生成，進(jìn)而抑制血小板整合素αIIbβ3活化，從而發(fā)揮抑制血小板化、聚集和血栓形成的作用。

前期的人群干預(yù)研究結(jié)果表明，膳食補(bǔ)充CoQ10顯著抑制血脂紊亂人群血小板聚集和顆粒物的釋放，但是值得注意的是，經(jīng)過24 周的CoQ10（120 mg/d）干預(yù)后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者血漿CoQ10濃度約為2 μmol/L[21]。而本研究的體外實(shí)驗(yàn)中所用CoQ10劑量為1、10 μmol/L和 100 μmol/L，與其他體外實(shí)驗(yàn)研究所用的劑量一致[27-28]，并且發(fā)現(xiàn)對(duì)血小板功能具有顯著抑制作用的劑量主要為10 μmol/L和100 μmol/L，這遠(yuǎn)高于人群干預(yù)研究中能抑制血小板功能的血漿CoQ10濃度（約2 μmol/L），原因可能是在體外實(shí)驗(yàn)中短時(shí)間（50 min）作用于血小板需要更高的劑量才能有效地抑制血小板功能，而在人群干預(yù)研究中通過24 周的長(zhǎng)期膳食干預(yù)，血液中即使較低濃度的CoQ10也可以顯著抑制血小板聚集和活化等。研究發(fā)現(xiàn)膳食補(bǔ)充CoQ10具有較高的安全性，健康人攝入CoQ10劑量高達(dá)2400 mg/d時(shí)未見顯著的毒副作用[26]。在其他臨床干預(yù)研究中，如對(duì)高脂血癥、糖尿病、心力衰竭和帕金森疾病等患者使用劑量不等（50～1500 mg/d）的CoQ10進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)患者對(duì)該劑量范圍的CoQ10耐受性良好，血液中CoQ10濃度可高達(dá)10.2 μmol/L[26]。因此， 在本研究的體外實(shí)驗(yàn)中CoQ10產(chǎn)生效應(yīng)的濃度在人群血液中是可以達(dá)到的。

綜上，CoQ10具有顯著抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板TxA2生成的作用，其機(jī)制主要是調(diào)控PKA/cPLA2介導(dǎo)的信號(hào)通路。本研究從營(yíng)養(yǎng)膳食或從功能食品途徑為CoQ10防治血栓性心血管疾病提供了一定的理論依據(jù)。