小麥粉及其制品中偶氮甲酰胺檢測(cè)方法研究進(jìn)展

田林雙，顧鵬程，吳存兵，徐 澳，豆雪梅，史鳳珍，陳 飛*

（1.江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院糧食與食品藥品學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023）

偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，ADA）是橡膠、泡沫塑料制作中常用的發(fā)泡劑[1]，在食品行業(yè)中，ADA是小麥粉常用的食品添加劑，最大容許添加量為45 mg/kg[2]。ADA能夠氧化小麥粉中的巰基 （—SH）形成二硫鍵（S—S），使蛋白質(zhì)鏈相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而改善面團(tuán)成型能力，提高烘焙食品的靈活性和韌性。ADA還可以氧化小麥粉中的天然色素，提高小麥粉白度[3]。在中國(guó)、美國(guó)、加拿大、巴西等國(guó)家，ADA被用作小麥粉增白劑、面筋強(qiáng)化劑和面團(tuán)調(diào)節(jié)劑[4]。

圖1[5]為ADA在小麥粉儲(chǔ)存和加工過程中的化學(xué)變化。ADA在干小麥粉中性質(zhì)穩(wěn)定，當(dāng)小麥粉與水混合后，ADA迅速轉(zhuǎn)化為聯(lián)二脲（biurea，BIU），BIU在常溫環(huán)境下性質(zhì)穩(wěn)定[6]，但在面制品加工過程中，蒸煮、焙烤、油炸等高溫環(huán)境會(huì)促使BIU部分降解為氨基脲（semicarbazide，SEM）[5,7-8]。ADA及其分解產(chǎn)物有潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，人吸入ADA可能會(huì)導(dǎo)致過敏和 哮喘[9-10]。SEM是獸藥呋喃西林的代謝物[11-12]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明SEM能夠致癌、致畸、致突變，可干擾神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)[13-15]。目前，歐盟和澳大利亞、新西蘭、新加坡、日本等地區(qū)和國(guó)家禁止在食品中添加ADA。

圖 1 ADA在小麥粉儲(chǔ)存和加工過程中的化學(xué)變化[5]Fig. 1 Chemical changes of ADA in wheat flour during storage and processing[5]

小麥粉及其制品中ADA的檢測(cè)方法可分為直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法[16]。直接檢測(cè)法以ADA為目標(biāo)檢測(cè)物，間接檢測(cè)法以ADA分解產(chǎn)物BIU和SEM為目標(biāo)檢測(cè)物。ADA在濕熱環(huán)境下很快轉(zhuǎn)化為BIU[5]，導(dǎo)致小麥粉制品中很難檢出ADA，因此ADA直接檢測(cè)法不能準(zhǔn)確反映小麥粉中ADA的初始添加量，需要結(jié)合ADA間接檢測(cè)法進(jìn)行判斷。

近年來，為了簡(jiǎn)化分析步驟、縮短分析時(shí)間、減少大型分析儀器使用、促進(jìn)檢測(cè)方法在不同條件實(shí)驗(yàn)室的普及并滿足快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要，出現(xiàn)了許多ADA檢測(cè)新方法[14,16-24]，本文綜述了小麥粉及其制品中ADA檢測(cè)研究進(jìn)展，分析了當(dāng)前我國(guó)現(xiàn)行ADA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)存在的問題，展望了ADA分析檢測(cè)研究的發(fā)展趨勢(shì)，為ADA分析檢測(cè)研究與實(shí)踐提供參考。

1 偶氮甲酰胺直接檢測(cè)法

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法發(fā)展于20世紀(jì)60年代，適用于多種有機(jī)化合物的分析檢測(cè)，在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，目前儀器普及度較高，該法是檢測(cè)小麥粉及其制品中ADA最常用的方法[25]，我國(guó)出入境 檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4677—2016《出口食品中偶氮甲酰胺的測(cè)定方法 高效液相色譜法》[26]也采用此方法，該標(biāo)準(zhǔn)采用丙酮作為提取溶劑，使用氰基（—CN）色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，定量限為1 mg/kg，回收率為76%～103.8%。由于ADA性質(zhì)不穩(wěn)定，SN/T 4677—2016要求ADA標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液的測(cè)定應(yīng)在4 h內(nèi)完成。關(guān)于HPLC法檢測(cè)小麥粉及其制品中ADA的研究已有多篇文獻(xiàn)[27-29]報(bào)道，各方法主要在ADA提取與凈化、分離條件選擇、ADA柱前衍生化3 個(gè)方面有所區(qū)別。

ADA提取溶劑主要有丙酮[28,30-31]、乙腈[32]、N,N-二甲基甲酰胺[33]和二甲基亞砜[34]。丙酮具有易揮發(fā)、毒性低、黏度小等優(yōu)點(diǎn)，大部分研究者選擇丙酮作為提取溶劑。ADA在N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的溶解度較高，但與丙酮相比，提取溶劑N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜不易從樣品中分離，殘留的提取溶劑對(duì)ADA色譜柱分離和紫外檢測(cè)都會(huì)產(chǎn)生較大干擾[35]。

適用于ADA分離的色譜柱主要有C18色譜柱[8,36]、 —CN色譜柱[37-38]和硅膠色譜柱[28]。ADA極性較大，在C18反相色譜柱中保留時(shí)間較短[39]，而在—CN色譜柱中更利于分離。ADA最大紫外吸收波長(zhǎng)為245 nm，其次為275 nm，大部分研究者選擇245 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)[28,40]，但245 nm波長(zhǎng)處提取溶劑N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜會(huì)產(chǎn)生紫外吸收干擾，因此一些研究者會(huì)選擇275 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)[34]。

為了進(jìn)一步提高檢測(cè)方法的靈敏度，Yasui等[29]采用三苯基膦衍生化ADA，衍生化產(chǎn)物（ADA-三苯基膦）紫外吸收強(qiáng)，色譜柱分離效果好，小麥粉中ADA在0.25～100 mg/kg范圍內(nèi)，與紫外吸收信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9999，ADA回收率為86.9%～101.0%，定量限為0.25 mg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.9%～3.4%。

1.2 熒光比色法

與HPLC法相比，熒光比色法具有操作簡(jiǎn)便、直觀、成本低、靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)。Chen Junyang等[19]合成基于硅納米顆粒（silicon nanoparticle，SiNPs）和量子點(diǎn)（quantum dot，QDs）的熒光探針（SiNPs@QDs）（圖2），該探針在445 nm和632 nm波長(zhǎng)處分別有兩個(gè)分辨率良好的發(fā)射峰。632 nm波長(zhǎng)處的熒光峰可被汞離子（Hg2+）猝滅，而在還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）存在的情況下，GSH的—SH與Hg2+親和力更強(qiáng)，632 nm波長(zhǎng)處的熒光峰又被恢復(fù)。添加ADA后，GSH的巰基被氧化成S—S，生成氧化型GSH（glutathione oxidized，GSSG），Hg2+重新釋放出來，引起632 nm波長(zhǎng)處的熒光再次猝滅，而SiNPs@QDs在445 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度始終不變。該方法的ADA濃度在0.05～4 μmol/L 范圍內(nèi)，與熒光強(qiáng)度比（F632nm/F445nm）存在良好的 線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.995。該法檢測(cè)小麥粉中ADA的檢出限為1.86 μg/kg，回收率為96.3%～104%，RSD為4.6%～8.3%。

圖 2 熒光探針SiNPs@QDs制備過程與ADA檢測(cè)原理[19]Fig. 2 Schematic diagram displaying the preparation of SiNPs@QDs probe and the mechanism for ADA detection[19]

1.3 分光光度法

分光光度計(jì)價(jià)格便宜，是各級(jí)實(shí)驗(yàn)室常用的分析儀器?；谠撛O(shè)備，Chen Zhiqiang等[16]開發(fā)了一種基于肉眼觀察或者可見光分光光度計(jì)定量小麥粉中ADA濃度的方法（圖3）。GSH與金納米顆粒（gold nanoparticle，AuNPs）通過Au—SH共價(jià)交聯(lián)，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，引起AuNPs聚合而產(chǎn)生顏色變化。ADA與GSH反應(yīng)，使GSH失去—SH基團(tuán)，從而降低AuNPs的聚合度，導(dǎo)致AuNPs分散。該法檢測(cè)時(shí)間僅為2 h，當(dāng)ADA濃度大于0.33 μmol/L 時(shí)，肉眼即可明顯觀察到顏色變化。借助可見光分光光度計(jì)，ADA檢出限可低至0.23 μmol/L。該法用丙酮超聲提取小麥粉中ADA，氮吹濃縮，過膜檢測(cè)，僅依靠肉眼觀察，小麥粉中ADA檢出限為5.86 μg/g，借助分光光度計(jì)，ADA檢出限為3.5 μg/g，回收率為91%～104%，RSD為4%～6%[16]。綜上，分光光度法使用儀器少、成本低、速度快，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

圖 3 AuNPs分光光度法檢測(cè)ADAFig. 3 Visual detection of ADA based on ADA-induced anti-aggregation of gold nanoparticles[16]

1.4 紅外光譜法

紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）技術(shù)具有樣品前處理簡(jiǎn)單、樣品破壞少、對(duì)環(huán)境友好、一次分析可獲得樣品中多個(gè)組分信息等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于多種物質(zhì)的定量、定性分析。早在1983年，Osborne[41]同時(shí)測(cè)定了小麥粉中抗壞血酸、ADA和半胱氨酸含量。Gao Shang等[42]用近紅外光譜結(jié)合徑向基函數(shù)法對(duì)小麥粉中的ADA進(jìn)行定量分析，對(duì)ADA含量較低的樣品進(jìn)行二次建模，顯著提高了預(yù)測(cè)精度。Che Wenkai等[23]對(duì)101 個(gè)不同ADA含量的小麥粉樣品進(jìn)行光譜掃描，得到400～2498 nm波長(zhǎng)范圍的光譜數(shù)據(jù)，選取4 個(gè)波段（400～438、1480～1852、1896～1938、2048～2380 nm）作為特征波段，采用徑向基函數(shù)建立預(yù)測(cè)模型，小麥粉中ADA檢出限為3.2 mg/kg，相關(guān)系數(shù)、均方根誤差、模型性能指數(shù)分別達(dá)到0.99996、0.5467、116.5858。

1.5 高光譜成像法

高光譜成像技術(shù)融合了光譜技術(shù)和機(jī)器視覺技術(shù)，采集的高光譜圖像包含物質(zhì)的光譜信息和圖像信息，能夠?qū)崿F(xiàn)樣品內(nèi)外部物質(zhì)成分的定性分析、定量分析和可視化表達(dá)[43]。關(guān)于小麥粉中ADA高光譜成像技術(shù)檢測(cè)，王曉彬等[20]找出了小麥粉中ADA的4 個(gè)特征吸收波段，分別為1574.38、2038.55、2166.88 nm和2269.91 nm，采用光譜相似性分析對(duì)單像素點(diǎn)光譜進(jìn)行計(jì)算，該法可以對(duì)不同ADA添加量的小麥粉進(jìn)行分類。其還采用二值圖像重構(gòu)算法，對(duì)不同ADA添加量的小麥粉進(jìn)行識(shí)別，ADA像素與ADA含量呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9845，ADA檢出限為0.2 g/kg。

1.6 太赫茲時(shí)域光譜法

太赫茲（terahertz，THz）波是指波長(zhǎng)為3000～30 μm范圍內(nèi)的電磁波，在長(zhǎng)波段與毫米波相重合，在短波段與紅外光重合，太赫茲時(shí)域光譜（terahertz time-domain spectroscopy，THz-TDS）法能夠獲取物質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分等重要信息。THz-TDS法輻射能量小，不會(huì)對(duì)被測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生破壞，適用于樣品無損檢測(cè)[44]。 方虹霞等[45]比較分析了純ADA、純小麥粉以及混有ADA小麥粉的THz-TDS，發(fā)現(xiàn)ADA在1.93 THz處有一個(gè)明顯的特征吸收峰，選擇偏最小二乘法定量分析小麥粉中ADA，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9999，標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.06%，小麥粉中ADA檢出限為1.1 g/kg。GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]規(guī)定ADA在小麥粉中的最大容許添加量為 45 mg/kg，目前該法靈敏度較低，還需要對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。

1.7 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

與IR信號(hào)相比，大多數(shù)樣品的拉曼光譜信號(hào)較弱，這客觀上限制了拉曼光譜的應(yīng)用和發(fā)展。但當(dāng)樣品吸附于具有納米量級(jí)粗糙度的金、銀等金屬結(jié)構(gòu)表面時(shí)，樣品分子的拉曼光譜信號(hào)將得到極大的增強(qiáng)。 自20世紀(jì)70年代表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhancement Raman spectroscopy，SERS）法被首次報(bào)道以來，其應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注。SERS法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、無熒光等特性[46]，在食品安全、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[47]。Li Menghua等[48]合成具有強(qiáng)等離子體共振的銀包金納米粒子（Au@AgNPs）（圖4），Au@AgNPs對(duì)含NH2的ADA有較強(qiáng)的吸附作用，ADA的拉曼光譜信號(hào)因此獲得顯著增強(qiáng)，即使ADA的濃度低至1×10-7mol/L，也能產(chǎn)生較為明顯的拉曼光譜信號(hào)，其建立了一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、廉價(jià)、無標(biāo)記的ADA檢測(cè)方法，水、小麥粉、饅頭樣品中ADA的檢出限分別為11.6 μg/kg、1.16 mg/kg和2.32 mg/kg，回收率在81%～95%之間。

圖 4 Au@AgNPs SERS法檢測(cè)ADA[48]Fig. 4 Surface enhancement Raman spectroscopic detection of ADA using Au@AgNPs as Raman amplifier[48]

1.8 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法基于電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，借助電化學(xué)分析系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的分析檢測(cè)。相對(duì)于色譜、光譜、質(zhì)譜等儀器，電化學(xué)分析法儀器操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉。趙常志等[22]利用ADA在Nafion膜電極上的伏安響應(yīng)，用差分脈沖伏安法測(cè)定小麥粉中ADA質(zhì)量濃度。ADA質(zhì)量濃度在0.93～10.5 μg/L之間，與Nafion膜電極的電流響應(yīng)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9992，ADA檢出限為0.58 μg/L。該法檢測(cè)小麥粉中ADA的檢出限為5.8 μg/kg，回收率為95.8%～104%，RSD小于5.9%。

2 基于聯(lián)二脲檢測(cè)的偶氮甲酰胺間接檢測(cè)法

與ADA相比，BIU少了一個(gè)生色基團(tuán)C＝C，因此，BIU的紫外吸收性能降低，熒光吸收與發(fā)射靈敏度減弱，配備紫外、熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）的液相色譜（liquid chromatography，LC）難以用于BIU分析檢測(cè)。目前對(duì)于小麥粉及其制品中BIU的檢測(cè)研究報(bào)道較少，已報(bào)道的文獻(xiàn)中均使用液相色譜-質(zhì)譜 （LC-mass spectrometer，LC-MS）聯(lián)用儀（表1），電離源選用電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）或大氣壓化學(xué)電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI），質(zhì)譜質(zhì)量分析器選用四極桿質(zhì)量分析器。根據(jù)是否對(duì)BIU進(jìn)行衍生化，分為BIU直接測(cè)定和BIU衍生后測(cè)定。

BIU在常見的C18色譜柱中分離效果差，大部分研究者選用氨基色譜柱，Mulder等[49]采用TSK酰胺類柱，用13C,15N2-SEM和13C-氰化鉀合成了內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物13C,15N2-BIU， LC-MS法測(cè)定包裹小麥粉的禽肉和海產(chǎn)品中BIU，檢出限為10 μg/kg。Lim等[50]測(cè)定小麥粉和焙烤食品中的BIU，比較了質(zhì)譜儀ESI正離子和負(fù)離子兩種電離模式，結(jié)果表明BIU對(duì)ESI正離子模式敏感度更高，樣品中BIU檢出限為3 μg/kg。袁麗紅等[51]建立了小麥粉和饅頭中BIU的檢測(cè)方法，采用固相萃取凈化BIU提取溶液，去除溶液中雜質(zhì)，減弱了離子抑制，因此該法不需要價(jià)格昂貴的同位素內(nèi)標(biāo)，BIU的線性范圍為0.5～20 μg/kg，相關(guān)系數(shù)為0.9992，檢出限為0.1 μg/kg。阮莎莎[52]測(cè)定小麥粉、饅頭、面包、油條和面條中BIU，采用純水直接提取樣品中BIU，對(duì)于油條等油脂含量較高的樣品，用乙腈飽和的正己烷脫脂，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，BIU質(zhì)量濃度在0.2～100 μg/L范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999，BIU檢出限為5 μg/kg。趙悠悠等[53]認(rèn)為普遍采用的ESI對(duì)BIU的電離效果沒有APCI效果好，其采用HPLC-APCI-MS測(cè)定面包中BIU。該法比較了水、甲醇、乙腈、5% DMF-水溶液4 種溶劑對(duì)面包中BIU的提取效果，結(jié)果表明80 ℃熱水超聲提取效果最佳。面包中BIU在0.2～10.0 mg/kg范圍內(nèi)，線性良好，檢出限為 0.15 mg/kg，回收率為82%～110%，RSD為3.3%～4.1%。

為了進(jìn)一步提高BIU在質(zhì)譜檢測(cè)器中的響應(yīng)，王雅等[54]用高錳酸鉀把BIU氧化為ADA，再用甲苯亞磺酸鈉對(duì)ADA進(jìn)行衍生化，LC-MS法測(cè)定衍生化產(chǎn)物，用該法檢測(cè)小麥粉、饅頭、面包、油條、方便面中BIU，樣品中BIU在1～20000 μg/kg之間，線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9999，BIU檢出限低至0.15 μg/kg，回收率為78.3%～108.0%，RSD小于5.73%。

表 1 LC-MS法檢測(cè)小麥粉及其制品中ADA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物BIUTable 1 Determination of ADA decomposition product BIU in wheat flour and its products by liquid chromatography-mass spectroscopy

3 基于氨基脲檢測(cè)的ADA間接檢測(cè)法

3.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法儀器靈敏度高，適用于痕量物質(zhì)定性與定量分析，用該法檢測(cè)SEM，檢出限一般低于1 μg/kg，是食品中SEM檢測(cè)的首選方法[55]。SEM以游離和結(jié)合兩種形式存在于食品基質(zhì)中，酸法提取可以釋放食品基質(zhì)中全部的SEM[8,56]。SEM的相對(duì)分子質(zhì)量為75，ESI基體干擾大、靈敏度較低，用2-硝基苯甲醛過夜衍生化后，衍生物電離效率和在反相色譜柱中的保留能力均有提升[8]。HPLC-三重四極桿質(zhì)譜是 LC-MS/MS法檢測(cè)小麥粉及其制品中SEM常用的儀器，該法首先將小麥粉及其制品中的ADA進(jìn)行濕熱處理，使ADA轉(zhuǎn)化為SEM，然后用2-硝基苯甲醛衍生化SEM，最后通過測(cè)定SEM衍生化產(chǎn)物的量來間接計(jì)算ADA含量[8,56-58]。 為了進(jìn)一步提高方法的靈敏度，黎娟等[59]用HPLC-四極桿/離子阱質(zhì)譜測(cè)定小麥粉及其制品中SEM，檢出限低至0.1 μg/kg。雖然LC-MS/MS法高度靈敏，但也存在繁瑣、耗時(shí)、儀器昂貴等缺點(diǎn)，不利于方法的普及。

3.2 高效液相色譜法

HPLC法檢測(cè)小麥粉及其制品中ADA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物SEM，常用紫外檢測(cè)器（ultraviolet detector，UVD）或FLD（表2）。SEM紫外響應(yīng)和熒光響應(yīng)均較差，需要對(duì)SEM進(jìn)行衍生化，在SEM上引入紫外發(fā)色基團(tuán)或熒光敏感的化學(xué)基團(tuán)。Wei Tianfu等[60]以4-硝基苯甲酰氯為衍生化試劑，室溫下1 min內(nèi)即可完成SEM衍生化反應(yīng)，與 LC-MS/MS法常用的衍生化試劑2-硝基苯甲醛（衍生化SEM需要16 h）相比[8]，4-硝基苯甲酰氯衍生化SEM的效率提高了數(shù)百倍。衍生化產(chǎn)物在C18柱上的保留能力和紫外吸收均有較大幅度提升，SEM質(zhì)量濃度在0.01～2.0 mg/L 范圍內(nèi)，與紫外吸收信號(hào)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9991，SEM檢出限為1.8 μg/kg，可應(yīng)用于小麥粉及其制品中痕量SEM的快速測(cè)定。HPLC中FLD靈敏度一般比UVD靈敏度高1～3 個(gè)數(shù)量級(jí)[55]，Kong Xiaojian等[18]以2-甲?；脚鹚釣檠苌噭?，應(yīng)用于面包、方便面、蝦等食品中SEM的測(cè)定，SEM檢測(cè)限為0.18 μg/kg。 Li Guoliang等[61]以2-(11-氫-苯并[a]咔唑)-乙基氯甲酸酯）為衍生劑，SEM檢出限為0.4 μg/kg。Wang Yinan等[62]以芴甲氧羰酰氯為衍生化試劑，SEM檢出限為0.15 μg/kg， 該方法與常見LC-MS/MS檢出限（0.1～0.8 μg/kg）相當(dāng)。章建輝等[63]測(cè)定小麥粉中ADA，小麥粉濕熱處理后，丹磺酰氯衍生化ADA分解產(chǎn)物SEM，采用 HPLC-FLD測(cè)定，小麥粉中ADA檢出限為30 μg/kg。

表 2 HPLC法檢測(cè)小麥粉及其制品中ADA轉(zhuǎn)化產(chǎn)物SEMTable 2 Determination of ADA decomposition product SEM in wheat flour and its products by high performance liquid chromatography

3.3 電化學(xué)法

電化學(xué)法儀器價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單，隨著便攜式電化學(xué)工作站的普及，該法在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面有較大應(yīng)用潛力。Zhu Yudan等[17]采用微分脈沖伏安法測(cè)定小麥粉中SEM，2-硝基苯甲醛衍生化SEM，用微分脈沖伏安法對(duì)衍生化產(chǎn)物進(jìn)行定量，SEM質(zhì)量濃度在0～100 μg/L范圍內(nèi)，與峰值電流呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999，小麥粉中SEM檢測(cè)限為3 μg/kg，回收率為92%～99%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.3%。與HPLC、LC-MS/MS法相比，該法具有有機(jī)溶劑消耗少、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)。

4 偶氮甲酰胺及其分解產(chǎn)物同時(shí)檢測(cè)

Xie Yunfei等[64]采用SERS法對(duì)小麥粉中ADA、BIU和SEM 3 種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)限為10 μg/g，該方法可以用于小麥粉及其制品中ADA和BIU分析檢測(cè)。SEM在小麥粉及其制品中的含量一般低于1 μg/g，因此SERS法不適用于小麥粉及其制品中SEM檢測(cè)。Chen Li等[14]采用毛細(xì)管電泳同時(shí)分析小麥粉中ADA和SEM，并對(duì)毛細(xì)管電泳分離條件、萃取劑和衍生化條件進(jìn)行了研究。在四硼酸鈉、β-環(huán)糊精、異丙醇、十二烷基硫酸鈉緩沖液中，25 min內(nèi)ADA和SEM即可分離，ADA 和SEM的線性范圍分別為8.3×10—4～6.6×10—2mmol/L和1.9×10—3～3.4×10—2mmol/L，小麥粉中ADA和SEM的檢出限分別為0.15 mg/kg和0.045 mg/kg。該方法成功地應(yīng)用于5 個(gè)小麥粉樣品中ADA和SEM的同時(shí)檢測(cè)。ADA的回收率為88.0%～93.0%，RSD為0.8%～3.0%。SEM的回收率為98.0%～106.0%，RSD為3.1%～9.1%。該法分離性能與HPLC法相當(dāng)，可作為HPLC法的替代方法。

5 結(jié) 語

我國(guó)現(xiàn)行小麥粉及其制品中ADA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)需要進(jìn)一步完善。GB 1886.108—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 偶氮甲酰胺》[65]采用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定方法檢測(cè)ADA食品添加劑中高含量的ADA，對(duì)于小麥粉及其制品中ADA添加量的檢測(cè)，目前還沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。SN/T 4677—2016[26]采用HPLC法直接測(cè)定小麥粉及其制品中ADA。小麥粉長(zhǎng)期存放和面制品制作過程中，ADA遇水快速轉(zhuǎn)化為BIU。甚至在ADA提取、分析檢測(cè)過程中，也同時(shí)伴隨ADA的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，ADA直接檢測(cè)法不能準(zhǔn)確反映小麥粉中ADA的初始添加量。SN/T 4677—2016[26]要求ADA標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的測(cè)定必須在4 h內(nèi)完成，用該方法檢測(cè)ADA標(biāo)準(zhǔn)添加量為1 mg/kg的小麥粉，回收率較差，這可能與分析檢測(cè)過程中ADA的轉(zhuǎn)化有關(guān)?？梢栽O(shè)想，ADA標(biāo)準(zhǔn)添加量為1 mg/kg的小麥粉長(zhǎng)時(shí)間放置后，回收率會(huì)更低。ADA遇水轉(zhuǎn)化為BIU后，BIU性質(zhì)穩(wěn)定，只有極少部分轉(zhuǎn)化為SEM，BIU可作為小麥粉及其制品中是否添加ADA的標(biāo)記物質(zhì)。目前關(guān)于小麥粉及其制品中BIU檢測(cè)研究報(bào)道較少，對(duì)該領(lǐng)域的研究值得研究者關(guān)注。

基于SEM衍生的HPLC法具有較大的推廣應(yīng)用價(jià)值。SEM在小麥粉及其制品中含量極低，HPLC-MS/MS因?yàn)槠涓哽`敏度特點(diǎn)，目前是SEM檢測(cè)的主要設(shè)備。HPLC-MS/MS 法檢測(cè)小麥粉及其制品中SEM，首先提取樣品中的SEM，再進(jìn)行過夜衍生反應(yīng)，用同位素SEM內(nèi)標(biāo)定量，最后采用HPLC-MS/MS法檢測(cè)，該過程耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。4-硝基苯甲酰氯[60]和芴甲氧羰酰氯[62]能夠快速衍生化SEM，分別用更為普及的HPLC-UVD和HPLC-FLP進(jìn)行檢測(cè)，SEM檢出限與HPLC-MS/MS基本相當(dāng)?；赟EM衍生化的HPLC-UVD和HPLC-FLP具有較大的研究空間，高靈敏度、快速穩(wěn)定的衍生化試劑開發(fā)是該研究的核心內(nèi)容。

光譜學(xué)方法是快速、無損、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)小麥粉及其制品中ADA的有效手段。與HPLC-MS/MS、HPLC等化學(xué)分析法相比，光譜學(xué)方法具有快速、無損、低廉等諸多優(yōu)勢(shì)。此外，光譜學(xué)方法能同時(shí)獲得多個(gè)物質(zhì)組分信息，實(shí)現(xiàn)ADA、BIU和SEM的同時(shí)檢測(cè)。目前IR、 THz-TDS、SERS等光譜學(xué)方法已經(jīng)用于小麥粉及其制品中ADA的檢測(cè)，但普遍存在預(yù)測(cè)精度和靈敏度不足等問題，需要在光譜數(shù)據(jù)收集與分析、方法建模等方面進(jìn)一步深入研究。