海洋魚源抗菌肽的研究進展及其在食品 安全中的應用前景

陳 選，陳 旭，韓金志，汪少蕓,*

（1.福州大學石油化工學院，福建 福州 350108；2.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

抗生素的過度使用會導致許多病原微生物對幾乎所有的藥物都產(chǎn)生不同程度的耐藥性，這成為我國畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及食品工業(yè)領域可持續(xù)發(fā)展的桎梏[1-2]。因此，發(fā)展新型的“抗生素替代物”勢在必行?？咕谋蛔u為“天然抗生素”，是生物體內普遍存在并具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其在防御病原微生物中發(fā)揮著重要作用[3-5]。同時，抗菌肽被證實不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、病毒及腫瘤細胞等有抑制或殺滅作用，而且具有良好的免疫調節(jié)生物學功能[6-7]。海洋擁有地球上大約80%的生物資源，生態(tài)環(huán)境復雜，魚類作為低等脊椎動物，當其受到損傷或者病原微生物入侵時，將會迅速分泌抗菌肽以作為防御和殺傷入侵物質的非特異性免疫因子[8-10]。因此，從海洋魚類中發(fā)現(xiàn)更多活性豐富的抗菌肽，并探索其在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及食品工業(yè)等領域的應用已成為國內外學者關注的焦點。

本文綜述了海洋魚源抗菌肽的結構、生物活性及作用機制的研究進展，展望了其在食品安全領域的應用前景，以期為海洋魚源抗菌肽的進一步研究利用提供依據(jù)。

1 海洋魚源抗菌肽的結構

抗菌肽作為海洋魚類重要的非特異性免疫因子，當魚類受到損傷或者病原微生物入侵時，其將會被迅速分泌以抵御和殺傷入侵物質[8-9]。通過分析現(xiàn)有魚源抗菌肽間氨基酸序列的一級結構可知，它們彼此間并未表現(xiàn)出高度的同源性，但存在一些共同特征（如富含較多的疏水性氨基酸，使分子在疏水性環(huán)境中折疊成疏水或兩親性的α-螺旋結構；富含賴氨酸或精氨酸而使分子整體帶正電荷等[11-12]）。根據(jù)海洋魚源抗菌肽的一級結構和在細胞膜相互作用過程中形成的二級結構特征，主要將其分為3 類[13]：1）不含半胱氨酸但可以折疊成疏水或兩親性的α-螺旋結構（圖1A）。此類抗菌肽因為富含某種堿性氨基酸和具有α-螺旋結構，有利于通過在細菌細胞膜中形成穿孔以直接發(fā)揮抗菌活性，主要包括Piscidins[14]、Gaduscidins[15]、Moronecidins[16]、Pleurocidin[17-18]、Chrysophsin[19]、Pardaxins[20]及Epinecidin[21]等。2）富含半胱氨酸且能夠通過二硫鍵形成β-折疊結構（圖1B），主要包括Cathelicidin[22]、Defensins[23]、Hepcidin[24]等。 3）富含某種特定氨基酸的無規(guī)則結構肽，如環(huán)狀結構抗菌肽（圖1C）和伸展類抗菌肽（圖1D），主要包括 HPL-1[25]、Parasin I[26]、Oncorhyncin II[27]及Hipposin[28]等組蛋白衍生抗菌肽，此類抗菌肽的一級結構與組蛋白H1、H2A及H2B相似（表1）。近幾年，海洋魚類中富含天冬氨酸和谷氨酸的非陽離子抗菌肽也相繼被發(fā)現(xiàn)[29-31]，主要包括鰹魚的SHbAP、大西洋鱈魚的Piscidin-2、大黃魚的Lc-NK-lysin等。就抗菌肽結構整體而言，海洋魚源與陸生動物及兩棲動物間不存在明顯的差異，因此，相應的抗菌肽結構分類標準同樣適用于海洋魚源。但是，海洋魚源抗菌肽也存在一些特有的家族結構，如富含組氨酸的Piscidins[14]，其獨特的結構信息可為新型“抗生素替代物”的發(fā)展提供更多選擇。

圖 1 海洋魚源抗菌肽的主要結構[13]Fig. 1 Structures of antimicrobial peptides derived from marine fish[13]

表 1 海洋魚源主要抗菌肽Table 1 Major antimicrobial peptides derived from marine fish

2 海洋魚源抗菌肽的生物活性

2.1 抗微生物

海洋魚源抗菌肽具有抗微生物功能，不僅對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、尼氏鏈球菌、加氏乳球菌、大蒜乳桿菌等革蘭氏陽性菌，以及沙門氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌、大腸桿菌、幽門螺桿菌等革蘭氏陰性菌在內的細菌有作用，而且對真菌、病毒和寄生原蟲等生物性病原物也有一定的抑制或殺滅作用[9-13,32]。如Bo Jun等[33]通過肝臟轉錄組學技術從石斑魚中得到了6 種抗菌肽，包括Hepcidin 1、肝表達抗菌肽2（liver expressed antimicrobial peptide 2，LEAP-2）、Piscidin、Moronecidin、NK-lysin和β-Defensin，通過最低抑菌濃度測定發(fā)現(xiàn)，這些合成抗菌肽均具有抗菌活性，其中LEAP-2和Moronecidin的抗菌能力較強，且在5～40 μmol/L范圍內無細胞毒性；Raju等[34]從生魚的Piscidin蛋白中得到了兩個抗菌肽CsLC11和CsRG12，并發(fā)現(xiàn)它們不僅可以抑制金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌的生長，而且能很好地抑制其生物膜的形成； Joseph等[35]從抗菌肽的最大數(shù)據(jù)庫APD中篩選出6 個對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有較強抑制作用的抗菌肽，其中包括海洋魚源特有的抗菌肽Piscidins，并將其作為抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的候選化合物。從生物進化的角度看，相較于暴露在各種陸生環(huán)境中的病原體，海洋魚類被水生病原體所包圍，其形成了專門的防御機制以應對棲息環(huán)境所遇到的特定微生物。因此，從海洋魚源抗菌肽中開發(fā)適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的新型“抗生素替代物”將具有良好的前景[9-10]。

2.2 免疫調節(jié)

海洋魚源抗菌肽在體外具有良好的抗微生物功能，但在血清、鹽離子及陰性大分子（如糖胺聚糖）等體內復雜的環(huán)境影響下，其抗微生物功能或將受到抑制，此時，抗菌肽可能通過調節(jié)宿主的免疫反應來發(fā)揮抗微生物功能[36]。以富含抗菌肽的魚類皮膚為例，當海洋中的魚類遭受到來自細菌、病毒或其他病原體的化學或機械損傷時，其上皮細胞將開始釋放白細胞介素（interleukin，IL）-1β 等細胞因子，嗜中性粒細胞和T細胞聚集至表皮淺層[36-37]。 同時，黏液杯狀細胞開始分泌富含多種抗菌肽的黏液，其中Hepcidins等抗菌肽通過免疫調節(jié)功能間接發(fā)揮對細菌的抵抗作用，而像Piscidins、Pleurocidin、Cathelicidin等抗菌肽則直接發(fā)揮抑制細菌的作用[37-38]（圖2）。因此，海洋魚源抗菌肽具有重要的免疫調節(jié)功能。

圖 2 海洋魚源抗菌肽的免疫調節(jié)機制[38]Fig. 2 Immunomodulatory mechanism of antimicrobial peptides derived from marine fish[38]

2.3 其他生物活性

隨著對海洋魚源抗菌肽研究的逐漸深入，在其抗微生物和免疫調節(jié)功能的基礎上，發(fā)現(xiàn)了其更多的生物學功能。如Chen Wufu等[39]發(fā)現(xiàn)在RAW264.7細胞和BV2細胞中，Piscidin-1能夠顯著抑制促炎蛋白誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達上調，具有作為止痛藥使用補充治療的潛力；Ting等[40]發(fā)現(xiàn)來自羅非魚的Piscidin-4能夠在線粒體上破壞鈣穩(wěn)態(tài)并激活蛋白FosB，F(xiàn)osB的過表達導致了三陰性乳腺癌細胞的死亡，因此Piscidin-4具有抗乳腺癌的潛力；Talandashti等[41]系統(tǒng)地研究了抗菌肽Pleurocidin對不同生物膜的作用特點，及其細菌產(chǎn)生抗性的原因，以期開發(fā)出以Pleurocidin為模板對多藥耐藥菌具有抑制作用的高效抗生素。此外，海洋魚源抗菌肽還可作為營養(yǎng)活性物質應用于特殊醫(yī)學用途配方食品。如Mary等[42]發(fā)現(xiàn)帶正電荷的Piscidin-1能夠與初乳或牛奶中帶負電荷的酪蛋白分子強烈結合，這種結合使Piscidin-1不被酶降解，并可能在腸道微生物的作用下釋放，發(fā)揮免疫調節(jié)功效。

3 海洋魚源抗菌肽的作用機制及其特點

3.1 作用機制

海洋魚源抗菌肽的廣譜殺菌作用是目前研究的重點，但是關于其作用機制仍存在爭議。有研究表明，抗菌肽是通過與細菌細胞膜發(fā)生作用而導致其破壞或 裂解[43]；還有研究表明，抗菌肽與傳統(tǒng)的抗生素一樣，穿過細胞膜后，通過作用于細菌細胞內的一些物質來阻礙蛋白質及DNA、RNA的合成，破壞折疊結構，導致蛋白質變性[44]；另有研究表明，抗菌肽在亞最低抑菌濃度時，通過與細菌DNA的結合，破壞了細菌的正常生物功能，而超過最小抑菌濃度時，則直接與細胞膜發(fā)生作用，導致細菌的破壞或裂解[45]。因此，盡管海洋魚源抗菌肽的抗菌作用機制存在爭議，但其對細胞膜的作用靶標是明確的，且隨著顯微鏡技術、熒光染色技術、離子通道技術、X射線衍射技術和固相核磁共振技術等的成熟及分子動力學等相關理論的完善，抗菌肽以細胞膜為靶標的直接或間接抗菌機制逐漸清晰[46-47]。

3.2 細胞膜作用模型

桶-板模型、地毯模型和曲面-孔道模型是目前研究較多的抗菌肽以細胞膜為靶標的抗菌機制（圖3）。

圖 3 抗菌肽以細胞膜為靶標的抗菌機制[48]Fig. 3 Mechanism of action of antimicrobial peptides targeting cell membrane[48]

在桶-板模型中，抗菌肽插入細胞膜中，和膜表面呈垂直方式排列，分別形成木桶的側板及孔道，其中抗菌肽分子中的疏水基團直接由磷脂膜中間插入，親水部分則面對孔道空腔。該過程是一個動態(tài)過程，在第一階段，抗菌肽以單體形式與膜結合，隨著抗菌肽的插入和疏水成分的增加，抗菌肽濃度達到臨界值；在第二階段，抗菌肽的疏水部分與細胞膜的疏水核心互相作用，緩慢進入疏水核心，孔道結構發(fā)生改變，失去多肽單體的動力學結構[47-48]。

在地毯模型中，抗菌肽的疏水部分與磷脂雙分子層表面平行且并不插入細胞膜中，而是像地毯一樣覆蓋于膜表面?？咕耐ㄟ^靜電作用吸附到眾多的陰離子磷酸基團上，改變細胞膜的表面張力，當抗菌肽濃度累積到一定值時，細胞膜表面出現(xiàn)裂孔，導致細胞質外滲，形成微團，抗菌肽滲入[48-50]。如一種魚膠原蛋白的抗菌肽Collagencin被證明可在疏水性環(huán)境中通過二硫鍵形成β-折疊結構，并通過與脂類形成多個氫鍵停留在膜-水界面，遵循地毯模型的抗菌機制[51]。需要說明的是，在地毯模型中，細胞膜的崩解并不會導致孔道的形成，在磷脂雙層曲率混亂后，細胞膜破裂并形成微團，因此也可將其稱為微團模型[52]。

在曲面-孔道模型中，與桶-板模型類似，抗菌肽以垂直于膜的方向插入細胞膜中，形成親水孔道。同時，肽的疏水區(qū)域與脂質核心相結合，親水面和磷脂頭部相結合，脂膜向內彎曲，磷脂頭部傾斜，肽的親水區(qū)域與膜層之間疏水區(qū)域結合形成孔道表面的墊層，通過螺旋狀環(huán)由上至下形成連續(xù)彎曲的形狀[52-53]。具有疏水或兩親性α-螺旋結構的Piscidins家族屬于海洋魚類抗菌肽中典型的曲面-孔道模型作用方式。有研究將具有同源性的Piscidin-1和Piscidin-3（分別在PC/PG和PE/PG的模擬膜環(huán)境中）進行動力學計算后發(fā)現(xiàn)：Piscidin-1具有更強的殺菌能力可能是通過兩個關鍵氨基酸殘基實現(xiàn)的，位于肽N末端2位的苯丙氨酸增強了固定能力和螺旋穩(wěn)定性，而非極性部分17位的組氨酸則增強了膜變形和變薄能力 （圖4）；此外，Piscidin-1對細胞膜的插入更深，與其在完全水合狀態(tài)下的行為相關，即具有更強的傾斜能力，通過掩埋組氨酸和C末端，導致細胞膜變薄和缺陷，并改變細胞膜的電導率和黏彈性[54-55]。這一發(fā)現(xiàn)不僅較清晰地解釋了海洋魚源特有抗菌肽Piscidins的結構與其抗菌機制間的關系，而且也為理解脊椎動物在天然宿主防御機制中的進化提供依據(jù)。因為從整體而言，海洋魚源特有抗菌肽在一定程度上代表了一個進化上較保守的家族[38,48]。

圖 4 Piscidin-1和Piscidin-3在不同膜環(huán)境中的分子動力學模擬[54]Fig. 4 Molecular dynamics simulation of piscidin-1 and piscidin-3 in different membrane environments[54]

需要說明的是，桶-板模型、地毯模型和曲面-孔道模型并不是絕對割裂的，在抗菌肽對細胞膜的作用過程中可能存在多種作用模型。如Pleurocidin對細胞膜通透性的作用機制可能是通過形成環(huán)狀孔的“地毯”機制來實現(xiàn)的，即曲面-孔道模型與地毯模型互補[41]；根據(jù)作用對象細胞膜成分的不同，作用模型可以是桶-板模型也可以是地毯模型，因為膽固醇的存在能顯著降低其C末端兩親性螺旋的骨架運動和傾斜角[56]。同時，將抗菌肽和抗生素聯(lián)合使用可以實現(xiàn)協(xié)同增效，如魚源抗菌肽Pleurocidin和紅霉素聯(lián)合使用，能夠通過羥自由基的形成增加細菌細胞膜的通透性[57]。

3.3 細胞膜的作用特點

抗菌肽對不同生物的細胞膜有選擇性差異[58-59]（圖5）。對于不同類型的細胞膜，其分子組成是不同的，細菌等原核生物的雙層膜結構主要由PE和PG組成，而真核生物——哺乳動物的細胞膜主要由PC和PE等兩親性磷脂組成，而且哺乳動物的細胞膜中還富含膽固醇[60]。 不僅革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌的細胞膜組分不同，而且與真核細胞的膜成分也不同，導致海洋魚源抗菌肽對原核生物、真核生物有選擇性差異[61]。因此，根據(jù)抗菌肽對原核細胞膜與真核細胞膜的作用機理差異，可以通過氨基突變的方式調整抗菌肽的帶電性、疏水性及兩親性等參數(shù)來改變抗菌肽對原核細胞膜與真核細胞膜的選擇性，在保證對原核細胞膜破壞的同時，降低對真核生物的毒性。如對于魚源Piscidins家族的抗菌肽，以一個或兩個賴氨酸殘基替換疏水面中心的不同位置。這一簡單的修飾不僅保持或提高了其對革蘭氏陰性桿菌——鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性，而且顯著降低了對人紅細胞的溶血活性[62]。

圖 5 抗菌肽對不同生物細胞膜的選擇性[59]Fig. 5 Selectivity of antimicrobial peptides tocell membranes of different organisms[59]

此外，與抗生素通過干擾細菌的DNA、RNA和蛋白質的合成等機制不同，抗菌肽是直接以細胞膜為靶標，極大地降低細菌產(chǎn)生耐藥性的可能。相較于抗生素的抗菌機制，病原體僅需改變一個或少量的基因便可產(chǎn)生耐藥性，而對于抗菌肽的抗菌機制，病原體必須改變大量的基因才能實現(xiàn)其耐藥性，而大量基因的改變對于病原體基本上是不可能發(fā)生的[63]。綜上所述，利用海洋魚源抗菌肽對不同生物細胞膜的選擇性差異，可實現(xiàn)其靶向抗菌潛能。更重要的是，相較于傳統(tǒng)的抗生素，海洋魚源抗菌肽還能夠極大程度地降低細菌產(chǎn)生耐藥性的機率。

4 海洋魚源抗菌肽在食品安全中的應用

4.1 食物鏈和食品原料安全

食品產(chǎn)業(yè)由農(nóng)田到餐桌的整個鏈條上，涉及到的如種植和養(yǎng)殖、生產(chǎn)加工、包裝和儲藏保鮮及市場流通等各環(huán)節(jié)都存在食品安全風險因素，各環(huán)節(jié)的食品安全風險都有可能導致食品安全問題的產(chǎn)生。而傳統(tǒng)抗生素在飼料業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中的濫用，已導致了細菌抗藥性、藥物殘留等嚴峻食品安全問題[64-65]。其中，食品中的耐藥菌不僅可以直接對人類的公共健康構成威脅，而且其所具有的耐藥基因可能通過食物鏈的傳播[66]間接地危害人類健康。耐藥菌或耐藥菌基因主要通過3 種途徑出現(xiàn)在食物鏈中（圖6）：1）傳統(tǒng)抗生素在農(nóng)業(yè)、飼料業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)中的濫用導致食品原料中出現(xiàn)耐藥菌；2）食品加工過程中添加的發(fā)酵劑及噬菌體等可能存在耐藥基因；3）食品加工過程中存在耐藥菌交叉污染[67-68]。因此，日益嚴重的細菌耐藥性威脅已成為制約食品工業(yè)可持續(xù) 發(fā)展的障礙，研發(fā)綠色高效的飼料添加劑以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗生素己成為共識?？咕莫毺氐目刮⑸锘钚约懊庖哒{節(jié)活性，讓其成為新型綠色飼料添加劑的潛在選擇。如Huang Hanning等[69]將重組表達的羅非魚抗菌肽Piscidin-4制成顆粒并以0、1%、3%及5%（以正常飼料質量計）的添加量作為補充劑添加至正常飼料中，喂食28 日齡的金目鱸，結果發(fā)現(xiàn)喂食3%和5% Piscidin-4的金目鱸在增體質量、存活率和肝指數(shù)等方面均有顯著提高。Chen等[70]則對飼料中添加的石斑魚抗菌肽Piscidins進行毒理學實驗，通過6 項毒性實驗發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Piscidins對實驗動物既沒有急性毒性反應，也未表現(xiàn)出致突變性，可作為安全的家禽、?；蛩鷦游锏娘暳咸砑觿?。

圖 6 食物鏈中的抗生素耐藥性[68]Fig. 6 Antimicrobial resistance in the food chain[68]

4.2 食品包裝及儲藏保鮮

食源性疾病是指通過攝食進入人體內的各種致病因子引起的，通常具有感染性質或中毒性質的一類疾病[71]。 致病因子以細菌、病毒、真菌和原生動物等生物性病原物種類為主，引起的相關疾病也最為常見，其中細菌是重要誘因，相關的病原菌主要包括沙門氏菌、大腸埃希菌、葡萄球菌、變形桿菌和副溶血性弧菌等[72]。先進的食品包裝及儲藏保鮮技術是保證食品安全、預防食源性疾病的關鍵[73-74]。抗菌肽具有高效的抑菌作用及獨特的抗菌機制，因此被視為生物保鮮劑和食品包材的重要原料。其中，微生物來源的抗菌肽乳酸鏈球菌素（nisin）、片球菌抗菌肽及鏈霉菌抗菌肽等已在食品工業(yè)中被廣泛應用，如純天然的食品防腐劑——乳酸鏈球菌素被直接或作為包材涂料應用于乳制品、罐藏食品、農(nóng)產(chǎn)品、發(fā)酵飲品及肉制品的防腐保鮮中[75-76]。相較于微生物來源的抗菌肽，海洋魚源抗菌肽具有相似或對某種微生物更高效的抑制效果，因此其在食品的包裝及儲藏保鮮方面具有廣闊的應用前景。

5 結 語

由農(nóng)田到餐桌的整個食品產(chǎn)業(yè)鏈條上，涉及種植及養(yǎng)殖、生產(chǎn)加工、包裝和儲藏保鮮及市場流通等 各個環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都存在食品安全風險，其中又以因細菌、病毒及真菌等病原微生物引起的食品安全問題最為常見。同時，傳統(tǒng)抗生素的過度使用，已經(jīng)導致了許多病原微生物對幾乎所有的藥物都產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。因此，發(fā)現(xiàn)天然的“抗生素替代物”并探索其在畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及食品工業(yè)等“菜籃子”領域的安全應用已成為國內外學者持續(xù)關注的焦點。海洋魚源抗菌肽不僅具有對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、病毒及腫瘤細胞等的抑制或殺滅作用，而且具有良好的免疫調節(jié)功能，因此發(fā)現(xiàn)更多活性豐富的海洋魚源抗菌肽，并探索其在食品原料安全、食品包裝及儲藏保鮮等食品安全領域的應用將具有廣闊的前景。值得注意的是，一般天然來源的抗菌肽活性并不高，甚至其中一些對真核細胞存在毒性；因此，為了保證海洋魚源抗菌肽能夠作為合格的“抗生素替代物”，則要對其作用機制及特點進行深入研究，并通過科學的結構優(yōu)化以提高活性、降低毒性。未來的研究方向可以是：1）通過對海洋魚類生存策略及環(huán)境適應機制的研究來探索防御策略，揭示魚類適應海洋環(huán)境的物質基礎與分子機制，并借助基因組文庫、cDNA文庫、生物信息學分析等手段發(fā)現(xiàn)更豐富的海洋魚源抗菌肽；2）通過對已發(fā)現(xiàn)的海洋魚源抗菌肽進行組合化學、定量構效關系的整合，以豐富抗菌肽分子庫，并借助熒光染色技術、離子通道技術及分子動力學等手段對抗菌肽結構進行合理設計及改造；3）通過運用靜電紡絲技術、脂質基納米遞送技術及蛋白納米粒子技術等納米材料手段，保證海洋魚源抗菌肽以飼料添加劑、食品包裝材料、營養(yǎng)補充劑等形式在食品工業(yè)中發(fā)揮實際應用價值。