缺氧條件下CK1δ和PER1可調(diào)控BV2細(xì)胞的線粒體形態(tài)

金晶 劉雨朦 張棟 葛建 陳思源 施海媛 何明利

1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（江蘇連云港222002）；2南京醫(yī)科大學(xué)連云港臨床醫(yī)學(xué)院（江蘇連云港222002）

缺血性腦卒中是一種常見的難治性疾病，其主要發(fā)病機(jī)制是腦血管阻塞導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致一系列病理生理事件，例如小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、能量代謝異常、氧化應(yīng)激等［1-3］。近幾年的研究顯示缺血性腦卒中的發(fā)病時(shí)間及損傷程度具有時(shí)間依賴性［4-5］，疾病與晝夜節(jié)律之間的潛在聯(lián)系受到關(guān)注。OLIVEIRA 等［6］研究顯示生物體晝夜節(jié)律的異常會(huì)改變?nèi)毖阅X卒中患者的活動(dòng)水平。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到缺血性腦損傷與核心生物鐘蛋白PER1 的節(jié)律性改變密切相關(guān)［7］。上述實(shí)驗(yàn)均提示晝夜節(jié)律的破壞可能參與了缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程。

PER1 蛋白是晝夜節(jié)律調(diào)控中的重要一環(huán)，CK1 蛋白對(duì)PER 蛋白的磷酸化被認(rèn)為是決定生物鐘速度的關(guān)鍵步驟［8］。CK1 存在六個(gè)亞型（α、γ1、γ2、γ3、δ和ε），CK1δ是大腦和行為節(jié)律中介導(dǎo)PER 晝夜起搏的主要內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子［9］。據(jù)報(bào)道，CK1 活性改變會(huì)影響小鼠的腦梗死體積［10］。此外，WIEBKING 等［11］通過敲除小鼠Per1 基因發(fā)現(xiàn)，PER1 能通過調(diào)控凋亡和自噬相關(guān)因子的表達(dá)調(diào)節(jié)小鼠的腦損傷情況。但最近的研究表明，PER1 能夠優(yōu)化線粒體功能以適應(yīng)能量供應(yīng)/需求的每日變化［12］，提示CK1δ、PER1 對(duì)于缺血性腦卒中的調(diào)控可能是通過調(diào)控線粒體的功能實(shí)現(xiàn)的。因此，本研究以BV2 細(xì)胞為研究對(duì)象，用CoCl2處理細(xì)胞來模擬腦卒中時(shí)細(xì)胞的缺氧狀態(tài)［13］，在細(xì)胞缺氧條件下，抑制、敲低和過表達(dá)CK1δ來檢測(cè)晝夜節(jié)律的調(diào)控基因PER1 及線粒體的功能，以揭示晝夜節(jié)律基因CK1δ、PER1 調(diào)控缺血性腦卒中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與缺氧處理BV2 細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫，與含10%胎牛血清的DMEM（Gibco）一起置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將CoCl2（Sigma?Aldrich）溶解于雙蒸水中，配成100 mmol/L母液，分裝保存于-20 ℃冰箱，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋成50、100、200、400、800 μmol/L 處理細(xì)胞。

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real?time，PCR）使用Trizol（Invitrogen）提取細(xì)胞總RNA，并溶解于RNA free 的ddH2O 中，紫外分光光度儀（Invitrogen）分析RNA 純度并測(cè)定其濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen）的說明，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)并合成Per1 和CK1δ的引物序列：Per1 正向（5′?3′）GTCTAGCTGGTGCCA?TTCTC 和反向（5′?3′）CTCGATGTAACGGCTTGTG；CK1δ正向（5′?3′）ACGCCGGGATCGAG?AAGAA 和反向（5′?3′）CCGACCGGGAATCTGTG?AG。用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，擴(kuò)增32 個(gè)循環(huán)，分析數(shù)據(jù)。

1.3 CK1δ抑制劑PF670462（Med Chem Express）在DMSO（Sigma）中配制成10 mmol/L 儲(chǔ)存液，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至0.25、0.5、1、2 μmol/L 處理細(xì)胞，并用PBS 作為對(duì)照。

1.4 CK1δ過表達(dá)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，按照Lipofectamine 2000 試劑（Invitrogen）的轉(zhuǎn)染說明，用無血清培養(yǎng)基稀釋pEGFP?CK1δ質(zhì)粒（上海生工構(gòu)建）和脂質(zhì)體，室溫混合20 min 后加入到BV2 細(xì)胞中，輕輕混勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后更換為完全培養(yǎng)基，用熒光顯微鏡觀察熒光后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)CK1δ蛋白的表達(dá)。

1.5 siRNA 介導(dǎo)的CK1δ沉默針對(duì)CK1δ mRNA不同基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成3 條干擾序列及陰性對(duì)照序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），分別命名siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3 及siRNA NC。siRNA1正義鏈：GGAUCAGUGAGAAGAAAGAUTT，反義鏈：AUCUUCUUCUCACUGAUCCTT；siRNA2 正 義 鏈：GGGACUACAAUGUCAUGGUTT，反義鏈：ACCAU?GACAUUGUAGUCCCTT；siRNA3 正義鏈：GACAG?CUCUUCAGAAAUCUTT，反義鏈：AGAUUUCUGA?AGAGCUGUCTT。根據(jù)lipo2000 說明書，用50 pmol siRNA 轉(zhuǎn)染6 孔腔中的2.5×105BV2 細(xì)胞，6 h 后熒光顯微鏡觀察熒光，48 h 后Western blot 檢測(cè)CK1δ蛋白的敲低效果。

1.6 Western blot收集各組細(xì)胞，RIPA 裂解液提取總蛋白，細(xì)胞核抽提試劑盒（碧云天）提取細(xì)胞核蛋白，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將提取蛋白與蛋白上樣緩沖液1∶4 混合后100 ℃煮沸5 min。使用SDS?PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，加5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗Per1（1∶500）、CK1δ（1∶5 000）和Tubulin（1∶1 000）4 ℃過夜，TBST液洗膜3次，隨后加入二抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h。用顯影儀掃描膠片，Image J 軟件（Bio?Rad 公司，美國）分析條帶灰度值。

1.7 線粒體和細(xì)胞核染色將BV2 細(xì)胞以5×107接種至激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中按照試劑盒說明方法進(jìn)行線粒體和細(xì)胞核標(biāo)記。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入Mito Tracker Red（Invitrogen）和Hoechst（凱基生物）染色液，置于培養(yǎng)箱中孵育30 min，共聚焦顯微鏡（Nikon）觀察線粒體和細(xì)胞核的形態(tài)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 26.0 軟件分析數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)比較兩組之間的差異，單因素方差分析比較多組間的差異。數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧條件下Ck1δ和Per1 基因的mRNA 表達(dá)水平本研究采用CoCl2處理BV2 細(xì)胞后，Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，CoCl2濃度為200 μmol/L 時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子HIF?1α蛋白的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值（圖1A）。用200 μmol/L CoCl2分別處理BV2細(xì)胞6、12、24、48 h 來探究最佳處理時(shí)間，結(jié)果顯示200 μmol/L CoCl2處理細(xì)胞在24 h時(shí)，HIF?1α蛋白的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值（圖1B）。因此，在200 μmol/L CoCl2處理24 h 后提取細(xì)胞總RNA，qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示與常氧條件相比，CK1δ和Per1 在缺氧條件下的mRNA 表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1C、D）。

圖1 Western blot 檢測(cè)HIF?1α蛋白和qPCR 檢測(cè)CK1δ、Per1 基因的mRNA 表達(dá)量Fig.1 Western blot detects HIF?1α protein，qPCR detects the mRNA expression levels of CK1δ and Per1 genes

2.2 抑制、敲低和過表達(dá)CK1δ后細(xì)胞總PER1 蛋白表達(dá)CK1δ特異性抑制劑PF?670462處理BV2細(xì)胞后，CK1δ蛋白的表達(dá)水平明顯降低，且1 μmol/L PF?670462 處理24 h 對(duì)CK1δ蛋白的抑制效果最佳（圖2A）。siRNA 序列干擾以及過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，與對(duì)照組相比，siRNA1 干擾效果最好，CK1δ?pEGFP 的表達(dá)量明顯增加（圖2B、C）。1 μmol/L PF?670462、siRNA1、pEGFP?CK1δ在常氧和缺氧條件處理BV2 細(xì)胞后，Western blot 結(jié)果顯示常氧和缺氧組中CK1δ蛋白的減少或增加不會(huì)引起細(xì)胞中總PER1 蛋白表達(dá)量的改變，但相比于常氧組，缺氧處理后PER1 蛋白表達(dá)量有所降低（圖2D），進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。

圖2 抑制、敲低和過表達(dá)CK1δ后細(xì)胞總PER1 蛋白表達(dá)Fig.2 Inhibition，knockdown andoverexpression of CK1 δ induced the expression of total Per1 protein

2.3 抑制、敲低和過表達(dá)CK1δ后細(xì)胞核中PER1蛋白表達(dá)量本研究檢測(cè)缺氧條件下CK1δ蛋白表達(dá)量改變對(duì)PER1 蛋白亞細(xì)胞定位的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，常氧和缺氧條件下，抑制和干擾CK1δ導(dǎo)致細(xì)胞核中PER1 蛋白表達(dá)量上升，過表達(dá)CK1δ會(huì)降低細(xì)胞核中PER1 蛋白的含量。與常氧條件相比，缺氧條件下抑制和干擾CK1δ時(shí)，細(xì)胞核中PER1蛋白的表達(dá)量明顯升高（圖3）。

圖3 抑制、敲低和過表達(dá)CK1δ后細(xì)胞核中PER1 蛋白表達(dá)量Fig.3 The expression level of Per1 protein in the nucleus after inhibition，knockdown and overexpression of CK1δ

2.4 qPCR 檢測(cè)Tom22、Tim23、Mfn1、Drp1、Ucp1、Pink1 的mRNA 表達(dá)量在抑制、敲低和過表達(dá)CK1δ后檢測(cè)多個(gè)線粒體蛋白的變化，qPCR結(jié)果顯示，CK1δ表達(dá)量的改變對(duì)線粒體外膜蛋白Tom22、線粒體內(nèi)膜蛋白Tim23、解偶聯(lián)蛋白Ucp1的mRNA 表達(dá)量幾乎沒有影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4 A、B、D），但抑制和敲低CK1δ會(huì)引起線粒體融合蛋白Mfn1 的表達(dá)量增加以及線粒體裂變蛋白Drp1 的表達(dá)量降低，且過表達(dá)CK1δ造成Mfn1 表達(dá)量降低以及轉(zhuǎn)運(yùn)激酶Pink1、Drp1表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4C、E、F）。

2.5 線粒體形態(tài)圖4 的結(jié)果提示，CK1δ和PER1表達(dá)量的改變會(huì)影響Mfn1 和Drp1 基因的mRNA表達(dá)水平。由于DRP1 和MFN2 是控制線粒體形態(tài)的關(guān)鍵基因，本實(shí)驗(yàn)利用Mito Tracker 和Hoechst 處理細(xì)胞，共聚焦顯微鏡觀察線粒體的形態(tài)。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，CK1δ抑制劑組和敲低組線粒體的線狀占比增加，而CK1δ過表達(dá)組的點(diǎn)狀占比明顯增加。見圖5。

3 討論

CoCl2是目前廣泛用于細(xì)胞化學(xué)缺氧模擬的藥物之一，能夠穩(wěn)定持續(xù)地誘導(dǎo)細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)［14］。本研究采用CoCl2成功構(gòu)建了BV2 細(xì)胞缺氧模型，缺氧處理后Ck1δ和Per1 的mRNA 表達(dá)水平明顯下降，這與之前的研究結(jié)果一致，缺氧環(huán)境下HIF?1α的激活會(huì)改變晝夜節(jié)律基因的表達(dá)水平［15-16］。已有證據(jù)表明，通過物理作用，生物鐘通路和缺氧誘導(dǎo)通路之間存在雙向串?dāng)_［16］，但具體的作用機(jī)制尚不清楚，是目前研究的活躍領(lǐng)域。

圖4 qPCR 檢測(cè)Tom22、Tim23、Mfn1、Drp1、Ucp1、Pink1 的mRNA 表達(dá)量Fig.4 qPCR detects the mRNA expression of Tom22，Tim23，Mfn1，Drp1，Ucp1，Pink1

已知CK1 對(duì)PER 蛋白的磷酸化作用與亞細(xì)胞定位和蛋白降解有關(guān)，但是缺氧條件下兩者相互作用的確切機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)抑制或過表達(dá)CK1δ后，細(xì)胞總PER1 蛋白的表達(dá)量不變，但缺氧后兩者蛋白表達(dá)量略有下降，進(jìn)一步驗(yàn)證缺氧破壞了生物鐘基因的正常表達(dá)水平。雖然CK1δ的改變不會(huì)影響PER1 總表達(dá)量，但卻能影響PER1蛋白的核輸入。抑制CK1δ會(huì)促進(jìn)PER1蛋白入核，尤其是缺氧條件下，當(dāng)CK1δ被抑制時(shí)細(xì)胞核中PER1 蛋白的積累量明顯增加。據(jù)報(bào)道，當(dāng)CK1 與PER1 兩種蛋白在細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致PER1 磷酸化，核定位信號(hào)被掩蓋，進(jìn)而在胞質(zhì)中積累［17］。因此，抑制或干擾CK1δ的表達(dá)可能導(dǎo)致被磷酸化的PER1 蛋白減少，留下未被磷酸化的PER1 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，而過表達(dá)的CK1δ可能通過干擾核輸入途徑來改變PER1 的輸入動(dòng)力學(xué)，造成PER1 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累。此外，本實(shí)驗(yàn)還觀察到缺氧環(huán)境下PER1 蛋白的核積累量相比于常氧環(huán)境明顯增加，猜想這可能是由于缺氧誘導(dǎo)因子HIF?1α下調(diào)了CK1δ的表達(dá)，減少了PER1 的磷酸化，或是HIF?1α蛋白的激活可能對(duì)PER1 蛋白的核定位信號(hào)有增強(qiáng)作用，導(dǎo)致其入核量增加。

圖5 共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài)Fig.5 The morphology of mitochondria was observed by confocal microscope

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激條件下，Per1 基因的表達(dá)與線粒體功能之間存在密切聯(lián)系［18］。線粒體是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，會(huì)不斷發(fā)生融合和裂變［19-20］，與BV2 細(xì)胞的活化存在密切聯(lián)系［21］。晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)器可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)水平控制線粒體的代謝過程［22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CK1δ表達(dá)量的改變會(huì)影響Mfn1 和Drp1 基因的表達(dá)，引起線粒體形態(tài)的變化。線粒體形態(tài)先前已被證明幾乎可以調(diào)節(jié)線粒體功能的各個(gè)方面：線粒體融合形成廣泛的管狀網(wǎng)絡(luò)會(huì)導(dǎo)致氧化呼吸和其他功能的整體上調(diào)，而線粒體分裂成小片段則相反［23］。此外，SUN 等［12］研究發(fā)現(xiàn)Per1 基因缺失會(huì)導(dǎo)致線粒體形態(tài)發(fā)生顯著的異常變化。本研究結(jié)果顯示，CK1δ抑制或敲低組Mfn1 表達(dá)增加，線粒體的線狀占比偏多，而過表達(dá)組Drp1 表達(dá)上升，線粒體的碎片化點(diǎn)狀占比較大。這可能是由于抑制或干擾CK1δ促進(jìn)PER1 蛋白入核，增加了Mfn1 基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯且抑制了Drp1 的表達(dá)，從而引起線粒體的融合或裂變，導(dǎo)致其形態(tài)改變。然而，這只是分析本研究結(jié)果得出的推斷，具體機(jī)制將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律基因控制線粒體形態(tài)與氧化代謝之間存在分子聯(lián)系。晝夜節(jié)律基因的調(diào)節(jié)［24］和線粒體充足的能量供應(yīng)［25］對(duì)于神經(jīng)元興奮性和存活至關(guān)重要，與神經(jīng)退行性疾病和腦缺血等腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。目前對(duì)于這些腦血管疾病的治療選擇有限，基于對(duì)缺血性損傷潛在的致病分子機(jī)制的了解，開發(fā)出有效的干預(yù)方法來減輕腦損傷至關(guān)重要，而缺氧條件下CK1δ和Per1 對(duì)線粒體的調(diào)節(jié)作用可能為缺血性腦卒中新的治療途徑開啟一個(gè)新的方向。