肺泡灌洗液宏基因組測序在兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎的診斷價(jià)值

姚仲偉 李美錦 王桃 聶川 吳曉武 鄭亦男

廣東省婦幼保健院PICU（廣州511400）

呼吸道感染性疾病是危害兒童健康的重要疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國兒童基金會(huì)統(tǒng)計(jì)，呼吸道感染性疾病是造成5 歲以下兒童發(fā)病和死亡的首要原因，僅2019年全球約有80萬5歲以下兒童死于肺炎［1］。兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎病死率高的主要原因是不明致病菌性肺炎及復(fù)合感染性肺炎比例高，因此，早期病原菌的識(shí)別和精準(zhǔn)干預(yù)是降低患兒病死率和改善預(yù)后的關(guān)鍵。宏基因組測序（metagenomics next?generation sequencing，mNGS）是一種新型的DNA/RNA 檢測技術(shù)，具有檢測速度快、靈敏度高等特點(diǎn)，在重癥與疑難病例的病原學(xué)診斷中發(fā)揮重要的作用［2］。近年來關(guān)于mNGS 在臨床病原檢測方面的報(bào)道相繼出現(xiàn)，但國內(nèi)關(guān)于該技術(shù)在兒童重癥肺炎方面的報(bào)道相對(duì)較少。本文對(duì)廣東省婦幼保健院兒童重癥監(jiān)護(hù)病房（PICU）重癥社區(qū)獲得性肺炎患兒的肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行mNGS 檢測，探討mNGS 檢測技術(shù)對(duì)兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎的診斷價(jià)值，為臨床提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料選取2019年3月至2020年2月期間廣東省婦幼保健院PICU 因重癥社區(qū)獲得性肺炎需要肺泡灌洗治療的患兒29 例為研究對(duì)象。所有入選患兒符合兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)呼吸學(xué)組，結(jié)合我國實(shí)際情況制定的重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）嬰幼兒：腋溫≥38.5 ℃，RR ≥70 次/min（除外發(fā)熱哭吵等因素影響），胸壁吸氣性凹陷，鼻扇，紫紺，間歇性呼吸暫停、呼吸呻吟，拒食；（2）年長兒：腋溫≥38.5 ℃，RR ≥50 次/min（除外發(fā)熱哭吵等因素影響），鼻扇，紫紺，呼吸呻吟，有脫水征。收集研究對(duì)象的一般人口學(xué)資料、臨床資料與影像學(xué)資料?；純号R床特點(diǎn)見表1。

表1 兒童重癥肺炎臨床特點(diǎn)Tab.1 Clinical characteristics of severe pneumonia in children 例（%）

1.2 方法

1.2.1 支氣管肺泡灌洗液和BALF 的收集支氣管肺泡灌洗術(shù)均要求在局部麻醉下完成，一般選擇在病變肺段，若為彌漫性感染，則應(yīng)選擇肺葉中葉或舌葉，對(duì)于嬰兒則多選擇右肺下葉。在行纖維支氣管鏡操作時(shí)，將支氣管鏡嵌于肺葉的目的片段，利用溫的無菌生理鹽水進(jìn)行灌洗，總灌洗液量1 ～3 mL/kg，分3 次，同時(shí)利用吸引器以25 ～100 mmHg 的負(fù)壓將液體回收至無菌的塑料收集器，立即送檢，或保存在-80 ℃的冰箱里，并且及時(shí)送檢。對(duì)于符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患兒收集其相應(yīng)的臨床信息及病原學(xué)檢查結(jié)果。

1.2.2 mNGS 檢測由廣州微遠(yuǎn)基因生物公司完成，包括DNA和RNA兩部分的監(jiān)測。RNA部分進(jìn)行宿主細(xì)胞核糖體RNA 的去除步驟以提高RNA 病毒的檢測靈敏度。mNGS 技術(shù)通過臨床樣本總核酸提取后，隨機(jī)引物建庫，PCR 擴(kuò)增出該樣本中的所有微生物，最后通過對(duì)擴(kuò)增片段的序列測定和比對(duì)鑒定具體的微生物種類，然后再去宿主化扣除正常人群中出現(xiàn)的微生物群落背景，來找到所檢測臨床標(biāo)本中可能致病的微生物。mNGS 技術(shù)給出的病原檢測指標(biāo)有該微生物讀取到的特異核酸read 數(shù)目，read 數(shù)目越大，說明該病原菌的含量越高。若是定植情況，含量一般都不會(huì)太高［4］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方法在不同種類病原體的比較在29 例重癥社區(qū)獲得性肺炎患兒中，不同病原菌檢測陽性率有所不同，其中細(xì)菌檢出率mNGS 明顯高于傳統(tǒng)檢測方法（58.6%vs.20.7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。見表2。

表2 兩種方法在不同種類病原體的比較Tab.2 Comparison of two methods in different kinds of pathogens 例（%）

2.2 兩種檢測方法病原體檢出種類數(shù)比較在29 例重癥社區(qū)獲得性肺炎患兒中，傳統(tǒng)檢測方法靈敏度為72.4%，mNGS 靈敏度高達(dá)93.1%，并且在2 種以上病原體檢出率上明顯高于傳統(tǒng)檢測方法（34.5%vs. 0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.001）。見表3。

2.3 兩種檢測方法結(jié)果一致性比較當(dāng)mNGS 與傳統(tǒng)檢測出完全相同的病原體，認(rèn)為結(jié)果完全一致；檢出的病原體部分一致，認(rèn)為結(jié)果部分一致；檢出的病原體完全不同，認(rèn)為結(jié)果不一致。在不一致的病原體中，8 例（27.6%）的傳統(tǒng)檢測結(jié)果陰性，只有1 例（3.4%）mNGS 陰性。細(xì)菌方面，12例（27.6%）的傳統(tǒng)檢測結(jié)果陰性，mNGS 無陰性結(jié)果。病毒方面，2 例（6.9%）的傳統(tǒng)檢測結(jié)果陰性，3例（10.3%）mNGS陰性。真菌方面，5例（17.2%）的傳統(tǒng)檢測結(jié)果陰性，mNGS無陰性結(jié)果。見表4。

表3 兩種方法病原體檢出種類數(shù)比較Tab.3 Comparison of the number of pathogens detected by two methods 例（%）

表4 兩種方法檢測結(jié)果一致性的比較Tab.4 Comparison of consistency between two methods 例（%）

2.4 兩種方法在復(fù)合感染中的比較當(dāng)檢測出一種致病菌時(shí)認(rèn)為是單病原體感染；檢測出兩種及以上致病菌時(shí)認(rèn)為是復(fù)合感染。在單病原體感染中，傳統(tǒng)方法檢出率高于mNGS，傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果以病毒感染最為常見，mNGS 以細(xì)菌感染最為常見；在復(fù)合感染中，mNGS 明顯高于傳統(tǒng)檢測方法，傳統(tǒng)檢測與mNGS，均以細(xì)菌+病毒的復(fù)合感染最為多見。見表6。

3 討論

兒童社區(qū)獲得性肺炎病原菌構(gòu)成復(fù)雜，近年來新發(fā)、未知、耐藥病原體層出不窮，使抗感染治療的難度日益增大，造成巨大的醫(yī)患?jí)毫Γ?］。不明致病菌與復(fù)合感染是導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)性治療效果不佳的重要原因。因此，如何快速、準(zhǔn)確找到致病菌，給予敏感的藥物進(jìn)行精準(zhǔn)治療，改善不良預(yù)后，是臨床醫(yī)生迫切需要解決的［4，6-9］。

在目前的臨床實(shí)踐中，盡管培養(yǎng)的方法被認(rèn)為是檢測病原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是對(duì)于社區(qū)獲得性肺炎，微生物培養(yǎng)只有10%的陽性率［10］，而PCR 檢測只針對(duì)已知的病原菌，仍然不能解決臨床診斷陽性率低的問題［11］。而mNGS能克服傳統(tǒng)病原菌檢測的局限性，可明顯提高病原菌的檢出陽性率，尤其是不明致病菌與復(fù)合感染。近年研究發(fā)現(xiàn)［12-15］，在呼吸系統(tǒng)感染性疾病中，mNGS 檢測陽性率均高于傳統(tǒng)檢測方法，尤其在細(xì)菌檢測方面［5，16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，在兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎中，mNGS細(xì)菌檢出率和2 種以上病原體檢出率明顯高于傳統(tǒng)檢測方法，與近年研究結(jié)果一致，提示mNGS 檢測在細(xì)菌感染與復(fù)合感染的病原微生物診斷方面有巨大的優(yōu)勢。本研究中，在mNGS 與傳統(tǒng)檢測結(jié)果不一致的病原體中，細(xì)菌與真菌培養(yǎng)陰性明顯多于mNGS 陰性結(jié)果，驗(yàn)證了mNGS 檢測方法的優(yōu)越性。本研究在分離到的28 種病原體中細(xì)菌有16 種，mNGS 以檢出銅綠假單胞菌最為常見，傳統(tǒng)方法以檢出肺炎克雷伯菌最為常見；病毒有9 種，mNGS 以檢出腺病毒7 型、呼吸道合胞病毒與巨細(xì)胞病毒最為常見，傳統(tǒng)方法以檢出巨細(xì)胞病毒最為常見；真菌有3 種，mNGS 以白色念珠菌最為常見，傳統(tǒng)方法以檢出白色念珠菌與煙曲霉最為常見。臨床的其他檢驗(yàn)指標(biāo)及根據(jù)mNGS 檢出結(jié)果進(jìn)行治療的有效性也與mNGS 的檢測結(jié)果相吻合。

兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎的復(fù)合感染是增加治療難度的重要因素，與兒童免疫功能低下有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于免疫能力強(qiáng)的患者，最常見的復(fù)合感染是細(xì)菌+病毒和細(xì)菌+細(xì)菌，而免疫功能低下的患者中，細(xì)菌+真菌+病毒與細(xì)菌+真菌感染是最常見的組合［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，我院收治的重癥社區(qū)獲得性肺炎的復(fù)合感染中，不管是mNGS還是傳統(tǒng)檢測方法，均以細(xì)菌+病毒最為常見。

表5 兩種方法在復(fù)合感染中的比較Tab.5 Comparison of two methods in compound infection例（%）

本研究經(jīng)BALF mNGS檢測發(fā)現(xiàn)，在重癥社區(qū)獲得性肺炎中，腺病毒7 型、呼吸道合胞病毒與巨細(xì)胞病毒為最常見病原體；而傳統(tǒng)檢測中，有10 例巨細(xì)胞病毒感染患兒。在病毒檢測方面，mNGS 檢測并沒有表現(xiàn)出優(yōu)勢，可能與本次研究納入患兒感染的病毒均為已知病毒，并未發(fā)現(xiàn)罕見病毒有關(guān)。

2018年有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)NGS 診斷結(jié)合分枝桿菌復(fù)合群導(dǎo)致CNS 感染的病例，之后陸續(xù)有mNGS檢出腮腺炎病毒、EB 病毒、布氏桿菌、李斯特菌、狂犬病毒、腦囊蟲相關(guān)的腦炎或腦膜炎的報(bào)道［18］。筆者在其他的未納入本次研究的重癥肺炎人群中通過mNGS技術(shù)也確診了數(shù)例肺部的結(jié)合分枝桿菌感染和非結(jié)合分枝桿菌感染的病例。本研究納入人群為社區(qū)獲得性肺炎人群，未發(fā)現(xiàn)結(jié)核感染，符合社區(qū)獲得性肺炎發(fā)病規(guī)律。mNGS技術(shù)從2017年開始從實(shí)驗(yàn)室走入臨床應(yīng)用后，通過mNGS 檢測出各種罕見病原體，從而幫助臨床解決感染上的疑難雜癥，為臨床提供了很大幫助［2，19-22］。本文通過mNGS數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)，為PICU醫(yī)生理解兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎常見病原體提供依據(jù)。

本研究也存在局限性。首先，病例數(shù)有限，僅對(duì)29 例BALF 進(jìn)行了mNGS 檢測；其次，在判定混合感染的客觀性和準(zhǔn)確性上存在不足，下一步將給出更加全面的研究報(bào)道。

綜上所述，在兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎中，BALF mNGS 相比傳統(tǒng)方法有更高的檢出率，尤其是對(duì)細(xì)菌、真菌與復(fù)合感染的檢測更具有優(yōu)勢，能早期及精準(zhǔn)的進(jìn)行臨床干預(yù)，為臨床診治兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎提供依據(jù)。