膿性滲出物中老兵諾卡菌的分離鑒定及文獻復習

邵玲，吳小利，翟明賀，劉麗文（遼寧省人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學科，沈陽110016）

諾卡菌（Nocardia）廣泛存在于土壤、灰塵、腐爛的植被、動物糞便沉積物以及水環(huán)境中［1］，并作為一種機會致病菌，可引起免疫功能受損患者的感染，尤其是呼吸道感染［2］。目前諾卡菌屬包括100多個菌種［3］，其中有接近30個菌種與人類感染有關，包括膿腫諾卡菌（N.abscessus）、非洲諾卡菌（N.africana）、星形諾卡菌（N.asteroides）、巴西諾卡菌（N.brasiliensis）等［2］。隨著分子鑒定技術的快速發(fā)展，很多少見或新命名的諾卡菌菌種逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。老兵諾卡菌（N.veterana）就是其中之一，該菌于2001年從一位78歲患者的支氣管鏡灌洗液中分離并獲命名［4］。目前全球關于人類感染老兵諾卡菌的病例報道已有20多例，而我國僅臺灣地區(qū)有1例報道［5］。目前，諾卡菌的鑒定多采用16SrRNA、secA1、hsp65、gyrA和rpoB等基因為基礎的分子生物學方法［6］。近年來，隨著質(zhì)譜技術的發(fā)展以及諾卡菌參考數(shù)據(jù)庫的擴增，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）亦可用于老兵諾卡菌的鑒定。本文報道從1例診斷為橫紋肌溶解癥患者患肢膝蓋后側(cè)膿性滲出物中分離得到1株老兵諾卡菌，對該菌的微生物學特征、鑒定及藥物敏感性進行分析，并結合文獻復習，為臨床實驗室檢出該菌提供參考并加強臨床對于該菌感染的重視。

1 材料與方法

1.1 研究對象及菌株來源 菌株分離自一位55歲男性橫紋肌溶解癥患者患肢膝蓋后側(cè)膿性滲出物，患者合并2型糖尿病并有類固醇激素使用史?；颊呷朐旱?天至第26天膝蓋后側(cè)持續(xù)有膿性滲出物，無臭味，白細胞計數(shù)處于持續(xù)升高狀態(tài)，最高可達17.58×109/L，分別在第2天及第10天取膿性滲出物進行一般細菌培養(yǎng)，檢出老兵諾卡菌。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 35218購自上海寶錄生物公司。

1.2 主要儀器及試劑 LEICA DM750光學顯微鏡（德國LEICA公司）；microflexTMLRF質(zhì)譜分析儀及CHCA基質(zhì)液（Bruker Daltonics公司）；血瓊脂培養(yǎng)基（中國彥程公司）；革蘭染色液（快速）、抗酸染色液（快速）（珠海貝索公司）；DL-96STAPH試劑盒（珠海迪爾公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒（天根公司）；EasyTaq PCR SuperMix聚合酶（北京全式金公司）；磁珠法DNA凝膠回收試劑盒（上海碩美公司）；引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.3 分離菌的培養(yǎng)與形態(tài)觀察 將分離菌株接種在血平板上35℃培養(yǎng)0～120 h，取培養(yǎng)24～120 h菌落制片后革蘭染色觀察；分別取培養(yǎng)48 h菌落制片后，參照快速抗酸染色試劑說明書并略改良進行弱抗酸染色：石碳酸復紅染色10 min，2 mol/L H2SO4分別脫色2 s、10 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s，亞甲藍染色2 min觀察鏡下形態(tài)。重復2次。

1.4 MALDI-TOF MS鑒定 挑取血平板上培養(yǎng)48 h單個菌落涂在靶板上，自然干燥后加入1μL 70%甲酸，待完全干燥后，加入1μL CHCA基質(zhì)液，待完全干燥后，置于質(zhì)譜儀上進行鑒定并依據(jù)儀器說明書進行結果判讀。

1.5 16SrRNA基因序列分析 收集單個菌落，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取。參照文獻［7］合成細菌16SrRNA引物，序列分別為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系為30μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 15μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，DNA模板2μL，H2O 11μL。PCR反應條件：94℃5 min；94℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，25個循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳并采用磁珠法DNA凝膠回收試劑盒對目的條帶進行回收，采用Sanger法在ABI 3730XL設備上進行測序，測序由北京睿博興科生物技術有限公司完成。測序后將序列和GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對。并下載與待測菌相似度大于98.0%的菌種的各個基因序列，其中每個菌種選取相似度最高的1個菌株，用MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 生化反應及藥物敏感性分析 選取血平板培養(yǎng)48 h單個菌落，制備0.5麥氏濁度單位菌懸液，在DL-96STAPH生化反應板孔中每孔加入菌懸液100μL，生化反應包括D-氨基葡萄糖、脲酶、麥芽糖、β-半乳糖苷酶、七葉苷、棉子糖，VP、硝酸鹽；取50μL 0.5麥氏濁度單位菌懸液加入DL-96STAPH試劑盒中的M-H肉湯培養(yǎng)基中，充分混勻并分別取上述含菌液M-H肉湯培養(yǎng)基100μL加入含抗菌藥物試驗孔，35℃孵育72 h，依據(jù)DL-96STAPH試劑盒說明書以及美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）M62文件［8］進行結果判讀。同時采用大腸埃希菌ATCC 35218作為質(zhì)控菌株。

1.7 文獻復習 使用PubMed、中國知網(wǎng)（CNKI）對老兵諾卡菌感染的相關文獻進行檢索，檢索范圍為2001年1月至2020年3月以前發(fā)表的文獻，英文關鍵詞為“Nocardia veterana”，中文關鍵詞為“老兵諾卡菌”，語言限制為英文和中文，對檢索的文獻進行審查，排除人類感染以外的文獻以及對諾卡菌屬感染的匯總分析文獻。

2 結果

2.1 分離菌的培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)及鏡下形態(tài) 分離菌株在血平板上35℃可緩慢生長，24 h呈較小白色干燥顆粒狀菌落，48～72 h后形成干燥白色菌落，菌落有褶皺現(xiàn)象（圖1），且有泥土氣味。鏡下為革蘭陽性絲狀菌，培養(yǎng)24 h鏡下呈分枝狀（圖2A），48～96 h分枝逐漸斷裂（圖2B、2C、2D），120 h后分枝完全消失（圖2E）。弱抗酸染色呈弱抗酸性（圖2F）。

圖1 老兵諾卡菌在血平板上菌落形態(tài)（35℃培養(yǎng)24～72 h）

圖2 革蘭染色及弱抗酸染色鏡下形態(tài)

2.2 生化反應及MALDI-TOF MS鑒定 MALDI-TOF MS鑒定為老兵諾卡菌（得分為2.245）。分離菌35℃培養(yǎng)48 h后，D-氨基葡萄糖、脲酶、麥芽糖、β-半乳糖苷酶、七葉苷陽性，棉子糖、VP、硝酸鹽陰性。

2.3 16S rRNA基因序列分析結果 PCR擴增產(chǎn)物Sanger法測序長度為1 385 bp，將測序序列和GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，結果顯示分離菌與數(shù)據(jù)庫中的Nocardia veterana（登錄號：NR_115156.1）序列相似性達100%。以Streptomyces gardneri strain NBRC 3385為外類群，通過MEGA7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)分離菌與N.veterana DSM4445在同一分支上，屬于同一菌種，老兵諾卡菌與克露茨克氏諾卡菌（N.kruczakiae）親緣關系較近。見圖3。

圖3 基于16SrRNA基因序列和運用Neighbor-Joining的方法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 藥物敏感試驗 分離菌對抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）分別為阿米卡星（0.25μg/mL）、慶大霉素（1μg/mL）、克拉霉素（0.25μg/mL）、利奈唑胺（≤2μg/mL）、復方磺胺甲噁唑（1/19μg/mL）、環(huán)丙沙星（8μg/mL）。其中，分離菌對環(huán)丙沙星耐藥，其余抗菌藥物均敏感。

2.5 文獻資料 共納入13篇文獻，英文為13篇，中文為0篇，病例數(shù)為16例［4-5，9-20］。16例感染病例中大部分來源于歐美地區(qū)（11/16），2例來自澳大利亞，3例來自亞洲地區(qū)（日本2例，中國臺灣地區(qū)1例）；感染部位多見于肺部（8/16），還可引起腦、腸道、尿道、腹膜及淋巴管感染甚至菌血癥，以及1例足分支菌病及1例眼部感染。鑒定方法大部分采用16SrRNA測序，有2例采用MALDI-TOF MS與16SrRNA測序相結合，經(jīng)過適當治療，有11例效果良好。見表1。

表1 老兵諾卡菌感染文獻復習

續(xù)表

3 討論

本文對臨床分離老兵諾卡菌進行24～120 h培養(yǎng)后的鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)該菌可以形成明顯分枝狀菌絲，分枝在48～96 h易斷裂，120 h后幾乎全部斷裂，與文獻中星形諾卡菌鏡下形態(tài)相似［21］。本文分離老兵諾卡菌具有弱抗酸特點。諾卡菌弱抗酸染色的結果與脫色時間有關［21］，本文采用脫色時間在2～60 s時，弱抗酸染色為陽性，＞60 s顯示為陰性，因此在對諾卡菌進行弱抗酸染色時，要控制脫色時間，以免產(chǎn)生假陰性結果。有研究顯示，老兵諾卡菌七葉苷反應為陽性，而非洲諾卡菌為陰性；非洲諾卡菌棉子糖反應為陽性，老兵諾卡菌為陰性［11］，但是由于生化反應特異性較弱，且諾卡菌種類繁多，僅通過生化反應難以實現(xiàn)菌種鑒定。

本文采用的MALDI-TOF MS參考數(shù)據(jù)庫包括星形諾卡菌（N.asteroides）、非洲諾卡菌（N.africana）、巴西諾卡菌（N.brasiliensis）、老兵諾卡菌（N.veterana）等35種諾卡菌。MALDI-TOF MS蛋白質(zhì)處理方法有2種，分別是直接涂布法和蛋白質(zhì)提取法，蛋白質(zhì)提取法可提高鑒定的準確性［22］。由于分離菌生長較為緩慢，依據(jù)文獻［23］，本文采用幼齡菌進行鑒定。目前基因測序已經(jīng)成為鑒定諾卡菌最準確的方法，現(xiàn)有文獻報道老兵諾卡菌的鑒定大多采用16SrRNA測序。當有些諾卡菌菌種間序列相似性較高時，可以增加其他管家基因如secA1、hsp65、gyrA和rpoB或構建系統(tǒng)進化樹增加鑒定可信度。本文采用MALDI-TOF MS與16SrRNA測序的方法同時鑒定出分離菌為老兵諾卡菌，另外系統(tǒng)進化樹結果顯示分離菌與N.veterana DSM4445在同一分支上，屬于同一菌種。

文獻復習發(fā)現(xiàn)，16例老兵諾卡菌感染的病例中除了肺部感染（8/16），還可引起腦、腸道、尿道、腹膜、淋巴管感染甚至菌血癥，以及足分支菌病及眼部感染等淺表感染，因此，老兵諾卡菌引起的感染范圍較為廣泛。而易感人群大多存在明確的免疫力受損因素，如使用免疫抑制劑治療、HIV感染以及患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病，雖然有2例無明確的免疫抑制狀態(tài)，但仍伴隨有糖尿病或支氣管擴張等基礎疾病。本文患者患有2型糖尿病且有類固醇使用史，亦存在易感因素。由于國際上對于老兵諾卡菌的治療尚無統(tǒng)一方案，文獻報道大部分采用復方磺胺甲噁唑成功治愈，其治療劑量從160 mg/800 mg～320 mg/1 600 mg不等，治療期限為3個月至1年，需要根據(jù)患者的癥狀及免疫狀態(tài)而定。而復方磺胺甲噁唑與阿米卡星、碳青霉烯或頭孢曲松的組合常用于嚴重或全身感染［24］。本例患者分離菌對復方磺胺甲噁唑敏感，治療中聯(lián)合應用了復方磺胺甲噁唑和頭孢他啶，但由于患者基礎疾病較重，最終死亡，未能對其藥效進行評估。利奈唑胺是一種新型唑烷酮類抗生素，2003年Moylett等［25］首次報道了6例用利奈唑胺治療成功的諾卡菌感染患者。因此，對于老兵諾卡菌感染的患者，可選用復方磺胺甲噁唑，對于磺胺類藥物不耐受者，可選擇利奈唑胺進行治療。

綜上，本文對老兵諾卡菌的形態(tài)、鑒定及藥敏試驗進行描述，為臨床實驗室對該菌的識別提供可視化參考；同時總結了國內(nèi)外相關報道及治療經(jīng)驗，為臨床治療提供用藥參考。