輔助生殖技術在葡萄胎治療中的應用及研究進展

楊婧祎，劉巖，智旭

妊娠滋養(yǎng)細胞疾?。╣estational trophoblastic disease，GTD）是一組來源于胎盤滋養(yǎng)細胞的疾病，包括葡萄胎（hydatidiform mole）、侵蝕性葡萄胎、絨毛膜癌、胎盤部位滋養(yǎng)層細胞腫瘤及上皮樣滋養(yǎng)葉細胞腫瘤。葡萄胎是一種異常妊娠，主要特征是異常的胚胎發(fā)育，絨毛水腫變性，滋養(yǎng)層增生，可分為完全性葡萄胎（complete hydatidiform mole，CHM）和部分性葡萄胎（partial hydatidiform mole，PHM）[1-2]。1752年，William Smelie第一次用“葡萄胎”這個名詞來描述“葡萄狀”的胎盤病理特征。1827年Velpeau和Boivin第一次觀察到這些“囊腫”是絨毛的囊狀擴增[3]。

1 流行病學

在西方國家，每600～1 000孕次會發(fā)生1次葡萄胎，且大部分為散發(fā)性葡萄胎，而發(fā)展中國家和不發(fā)達國家的發(fā)病率比西方國家高約2～10倍[4-5]。葡萄胎再發(fā)風險為1%～2%，第3次發(fā)生葡萄胎的概率則增加到15%～20%，且不會因改變性伴侶而降低[2]。在中國，葡萄胎發(fā)病率約為1‰～8.83‰，其中發(fā)病率最高的省份是浙江[6]。

復發(fā)性葡萄胎（recurrent hydatidiform mole，RHM）是指在同一對夫婦中發(fā)生2次及以上的葡萄胎孕史，RHM可以是散發(fā)的，也可能是家族聚集性的。雙親型葡萄胎（biparental hydatidiform mole，BiHM）考慮是由于常染色體隱性遺傳缺陷造成的，但BiHM含有雙親來源的遺傳物質[2,7]。

女方年齡和既往流產(chǎn)病史是研究最多的2項葡萄胎發(fā)生的危險因素。13～18歲或者超過35歲的婦女葡萄胎患病風險增加2～3倍，而大于40歲的婦女患病風險增加7倍[8]。相對于雙精雜合型PHM而言，雙精雜合型和單精純合型CHM與高齡（＞40歲）更相關[9]。CHM的其他危險因素包括男方高齡、維生素A或者胡蘿卜素缺乏和吸煙等。有研究認為不規(guī)則月經(jīng)史和口服避孕藥與PHM有關[8]。

2 臨床表現(xiàn)與檢查

葡萄胎患者早期診斷多依據(jù)B超檢查和異常增高的人絨毛膜促性腺激素（hCG）水平。葡萄胎患者母體血清hCG水平異常增高是由于滋養(yǎng)層的過度增殖引起的，hCG水平一般超過80 000 mIU/mL。CHM臨床表現(xiàn)包括陰道出血，子宮大于正常孕周，B超提示“雪花狀”[1,10]。并發(fā)癥包括妊娠高血壓疾病、貧血、劇吐、甲狀腺功能亢進、栓塞及卵巢黃素化囊腫。隨著孕周升高，患者也會出現(xiàn)子癇前期、甲狀腺功能亢進、妊娠劇吐、貧血和卵巢黃素化囊腫等[3]。而PHM的子宮大小無特殊，可小于相應孕周，B超下可見宮腔內無明顯血流信號，偶有局部混合回聲。早期PHM可見蛻膜、胎盤、子宮肌層的囊狀改變或增加的回聲。胎兒可見無定型回聲，幾乎不見胎兒心跳，卵黃囊橫斷面和前后徑的比例大于1.5[1,10]。

3 組織學分類

發(fā)育充分的CHM標本包含大量的血性組織及肉眼可辨認的、增大水腫的絨毛，形成大小不等的半透明水泡，未見正常胎盤及可辨別的胎兒成分。而PHM標本往往與非葡萄胎自然流產(chǎn)類似，大多為正常的絨毛組織，偶見葡萄狀囊泡，根據(jù)流產(chǎn)時的孕齡，或者清宮之前胎死宮內的時間，可能見到孕囊、胎兒成分或相對完整的胎兒[11]。

顯微鏡下，發(fā)育良好的CHM顯示兩個突出的形態(tài)學特征：彌漫性絨毛間質水腫和顯著的絨毛滋養(yǎng)細胞增生且常伴有細胞非典型性，缺乏胎兒型有核紅細胞等胎兒成分及羊膜、卵黃囊等非絨毛胎盤結構，也有極個別的CHM發(fā)現(xiàn)了內細胞團衍生物[7]。PHM則表現(xiàn)為兩種形態(tài)的絨毛：一種為大的、高度水腫的不規(guī)則絨毛，另一種為小的、外形正常或纖維化的絨毛，兩者混雜分布，后者常含有胎兒血管和有核紅細胞。絨毛形狀不規(guī)則呈扇貝形，?？梢姷阶甜B(yǎng)細胞內陷形成假包涵體。滋養(yǎng)細胞環(huán)繞絨毛呈輕至中度非極性增生，無明顯異型性[11-12]。

非葡萄胎二倍體、雙雌單雄三倍體和三體性自然流產(chǎn)均可出現(xiàn)水腫性妊娠產(chǎn)物，表現(xiàn)為形狀不規(guī)則的絨毛，伴滋養(yǎng)細胞假包涵體形成和不同程度的間質水腫，并可見胎兒血管和胎兒紅細胞。因此，相似的形態(tài)學特征無法鑒別上述非葡萄胎流產(chǎn)和PHM，對疑似病例應進行STR（short tandem repeat）基因型分析以確診。

4 診斷和鑒別診斷

現(xiàn)階段葡萄胎診斷的常用標準是組織學檢查中出現(xiàn)滋養(yǎng)細胞增生的現(xiàn)象[3]。孕早期可以通過超聲進行診斷[1]。對葡萄胎亞型的評估包括大小、絨毛的形狀，水腫的程度，滋養(yǎng)層增生的程度。水腫流產(chǎn)型往往沒有滋養(yǎng)層的增生而僅有絨毛的水腫[11]。

p57是母源表達的基因，CHM缺少母源性基因的表達，即細胞滋養(yǎng)層的絨毛中不表達p57，而PHM有p57的表達。但是p57免疫組織化學不能區(qū)分PHM和非葡萄胎性妊娠，需要用STR進行分析[2,10]。STR是群體中高度多態(tài)性的重復DNA序列，可以通過熒光標記的引物對多個STR位點進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，通過計算各個位點的峰高、峰面積比值來確定位點的相對拷貝數(shù)[12-13]。

其他輔助技術，包括傳統(tǒng)的細胞遺傳學（核型分析）、DNA倍性分析（流式細胞術，圖像分析）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），都不能區(qū)分母源和父源染色體。近年來，也有研究嘗試將基于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的芯片技術應用于診斷葡萄胎，然而該項技術還沒有在臨床工作中廣泛展開[14]。

5 遺傳因素

在遺傳層面，CHM約有80%～90%是單精純合型葡萄胎，即單精入卵，2條染色體均來自于父親，可能原因是染色體失活的卵或者是空卵與一個單倍體精子結合，單倍體染色體復制形成純合型二倍體，也可能是染色體失活的卵或者是空卵與第二次減數(shù)分裂失敗的二倍體精子結合，46,YY基本不能存活，故單精純合型葡萄胎核型大多為46,XX。有10%～20%的CHM是雙精入卵，即雙精葡萄胎或雜合葡萄胎，核型為46,XX或46,XY。也有一些三倍體或四倍體的CHM，其額外的遺傳物質都是父源的。偶有雙親來源的CHM多認為與常染色體隱性遺傳缺陷有關[2,8]。

而PHM多是雙精入卵形成的三倍體，也有可能是二倍體精子入卵，即1份染色體來自母親，另外2份染色體來自父親，基因型大多為69,XXX，有報道發(fā)現(xiàn)四倍體的PHM，即有3份基因組來自父親（92,XXXX、92,XXYY、92,XXXY）[2,7-8]。

5.1葡萄胎與基因印跡基因印跡是指依靠單親傳遞相關遺傳學性狀的現(xiàn)象，一個基因的兩個親本副本中僅有一個表達，可分為父源印跡基因和母源印跡基因?；蚪M印跡是一個動態(tài)的過程，與表觀遺傳修飾相關，由DNA甲基化、乙酰化作用和組蛋白修飾調節(jié)。在胚胎發(fā)育過程中，父源印跡基因多作用于胎盤的生長，而母源印跡基因多作用于胚胎的生長[2,15]，這對于葡萄胎的發(fā)生過程十分重要。NLRP7和KHDC3L基因突變可能與葡萄胎組織中印跡基因的甲基化缺失有關。NLRP7可以和染色質結合因子YY1（Ying-yang 1）結合，而YY1能夠以甲基化依賴的方式來調控印跡基因的表達[8]。同時，也有研究推測NLRP7和YY1的相互作用可以調控滋養(yǎng)層的分化[16]。Demond等[17]研究中發(fā)現(xiàn)，KHDC3Lc.1A＞G突變可導致卵細胞甲基化的減少，胚胎植入前階段甲基化削弱和植入后印跡位點甲基化缺失。

5.2葡萄胎與基因突變在OMIM網(wǎng)站（https://www.omim.org/）中，概述了4種RHM相關基因，見表1。

表1 OMIM網(wǎng)站中葡萄胎遺傳相關基因

NLRP7[nucleotide oligomerization domain（NOD）－like receptor,pyrin containing 7]定位在人類染色體19q13.4區(qū)域，又稱NALP7、NOD12、PYPAF3、CLR19.4、PAN7、HYDM，是2006年由Sharlene Murdoch在19q13.4區(qū)域最早發(fā)現(xiàn)的RHM致病基因。NLRP7蛋白屬于NLR家族，編碼1 037個氨基酸，有3個主要區(qū)域：氨基（N）端的PYRIN、NACHT 和羧基（C）端的LRR（leucine-rich repeat）區(qū)域，其表達和白細胞介素1β（IL-1β）的分泌、滋養(yǎng)層的分化有關[15]。其中，PYRIN區(qū)域和蛋白之間的連接相關，PYRIN結構域在凋亡蛋白中可以連接程序性凋亡相關蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase），在細胞凋亡通路中，PYRIN結構域介導形成的蛋白復合物可以把信號從受體傳到下游效應因子；NACHT結構域十分保守，其含有的ATP/GTPase 特 異 性P 環(huán) 可 以 將ATP 水 解 為GTP，NACHT結構域由神經(jīng)元凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitor protein，NAIP）、Ⅱ型主要組織相容性復合體轉錄激活子 （class Ⅱ major histocompatibility complex trans-activator，CⅡTA）、來源于柄孢霉的非親和位點蛋白（HET-E）、哺乳動物端粒酶相關蛋白1（telomerase associated protein1，TP1）組成，NACHT區(qū)域主要在神經(jīng)元凋亡抑制蛋白、主要組織相容性復合體（MHC）Ⅱ類活化和Caspase-募集蛋白發(fā)揮作用；LRR結構域通常存在于Toll樣受體、RanGTPase和RNA酶抑制蛋白中，是炎癥小體激活所必需的結構域，可以特異性識別受體[15]。NLRP7是一種母源效應基因，基因變異可以導致卵細胞缺陷，并影響輸卵管和宮腔中的母體環(huán)境[4]。在葡萄胎患者中NLRP7的變異可能導致外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的IL-1β表達水平下降，進而降低免疫學耐受力[18]。NLRP7在卵細胞發(fā)育的各個階段和精子中均有表達，NLRP7轉錄本水平受精后開始下降，在胚胎發(fā)育的第3天，即胚胎植入過程中達到最低水平，然后從D3到D5時期內急速增加，對應于胚胎基因組轉錄活化階段[2]。

在NLRP7雙等位基因變異的葡萄胎患者已發(fā)現(xiàn)NLRP7的47個變異位點，包括終止密碼子、小于20 bp的缺失或插入、剪接突變、大的缺失或插入以及復雜的重排，而在一個NLRP7等位基因變異的葡萄胎患者中，發(fā)現(xiàn)了2個蛋白截斷突變，1個終止密碼子，1個60 kb的缺失和17個錯義突變[2]。在復發(fā)性葡萄胎患者中，48%～80%的患者攜帶NLRP7的變異[8]。攜帶一個等位基因變異的女性患者多有其他不良妊娠史，其后代可能攜帶有DNA甲基化的改變，而攜帶兩個等位基因變異的女性患者生育結局幾乎都為葡萄胎[19]。攜帶純合變異的男性沒有生殖功能異常[2]。Akoury等[5]總結既往報道的病例和該研究中的病例，發(fā)現(xiàn)在131例NLRP7兩個等位基因均變異患者的612次妊娠記錄中，自然妊娠活產(chǎn)率僅1%，并提示這些活產(chǎn)和一些僅輕微改變蛋白功能的錯義突變有關，該研究也報道了2例NLRP7雙等位基因變異的RHM患者通過贈卵的方式獲得3個健康男嬰。NLRP7較輕微的變異，如錯義突變，發(fā)生的葡萄胎組織學多表現(xiàn)為類似PHM，即有不同程度的p57表達，而NLRP7較嚴重的變異，如截斷突變導致的葡萄胎則表現(xiàn)類似CHM，p57的表達異常缺如[20]。在NLRP家族中，NLRP5和NLRP2也都在胚胎發(fā)育過程中起著重要的作用。有報道發(fā)現(xiàn)NLRP2變異可能與Beckwith-Wiedemann綜合征（BWS）的發(fā)生有關，而NLRP5作為皮質下母源效應復合體（subcortical maternal complex，SCMC）復合物的一員，在小鼠和猴子的早期胚胎發(fā)育中起著重要作用，近年來，NLRP5與人類自然流產(chǎn)、多位點印跡干擾（multilocus imprinting disturbance，MLID）等疾病的關系也成了學者們關注的焦點[21]。

KHDC3L[KH domain containing 3-like]又稱C6orf221，在靈長類動物中又稱ECAT1，是2011年被發(fā)現(xiàn)的第2個與RHM相關的基因，KHDC3L定位在6號染色體上，編碼217個氨基酸，該蛋白屬于KHDC1（KH homology domain containing 1）家族，在人類中，這個蛋白家族包括KHDC3L、KHDC1、DPPA5（developmental pluripotency associated 5）和OOEP（oocyte-expressed protein），這些基因都與卵母細胞或者早期胚胎的基因表達有關，該家族的特征性結構是N端的不能結合RNA的非典型KH結構域[2]。在人類卵細胞中，KHDC3L可以和NLRP7一起調節(jié)表觀遺傳學的狀態(tài)，也可作為SCMC復合物的一員在卵細胞和植入前胚胎中發(fā)揮作用。在人類和猴子的胚胎中，KHDC3L的mRNA水平在桑椹胚期較低，而在囊胚期大幅增加，提示KHDC3L可能在胚胎植入后的階段也行使重要功能[22]。在人胚胎干細胞中，有研究證實了KHDC3L磷酸化可以調節(jié)同源重組修復介導的DNA損傷修復和PARP1[poly（ADP-ribose）polymerase 1]的活化[22]。在不攜帶NLRP7致病變異的葡萄胎患者中，有10%～14%的患者存在該基因的變異[8]。在2個KHDC3L等位基因均缺陷的葡萄胎患者中，發(fā)現(xiàn)有7種與RHM有關的變異，其中包括2個錯義突變、3個4 bp的缺失，1個剪切突變[23]和1個移碼突變[24]，迄今為止在2個KHDC3L等位基因缺陷患者中沒有活產(chǎn)報道，2018年報道的KHDC3L基因變異患者輔助生殖周期中，配子可以完成胞漿內單精子注射（ICSI）過程，但是胚胎發(fā)育最終阻滯在桑椹胚期，這提示KHDC3L變異可能比NLRP7嚴重[23-24]，然而在關于中國葡萄胎患者的研究里，僅有1篇文獻報道了攜帶有KHDC3L基因變異的葡萄胎患者，且該基因變異在中國人群中變異頻率較高，被認為和BiHM沒有特別的相關性。這提示中國人群中可能存在其他與葡萄胎相關的基因變異[25]。

NLRP7與KHDC3L共同定位于淋巴母細胞樣細胞系和外周血單核細胞中的微管組織中心和高爾基體[8]。透射電子顯微鏡法也證明了NLRP7與KHDC3L是卵細胞骨架的一部分。這也暗示了兩者可能有相似的功能[2,8]。在早期卵裂過程中，兩者均不對稱地分布在細胞外皮層區(qū)域，而在囊胚階段，NLRP7和KHDC3L分別定位到細胞質和細胞核[21]。也有研究推測KHDC3L可能和NLRP7作為同種卵細胞復合物的組成成分，直接或間接調節(jié)卵母細胞遺傳物質的表觀遺傳學狀態(tài)。然而，小鼠中沒有KHDC3L和NLRP7的直接同源物，不適合在小鼠模型中做相應研究[17]。

不攜帶NLRP7和KHDC3L致病基因變異的RHM患者有很高的遺傳異質性，葡萄胎組織僅有8%是雙親來源的二倍體。不含有已知基因變異位點的患者對再發(fā)葡萄胎有輕微的遺傳易感性，不除外多基因或者多因素作用[7]。有研究在2個葡萄胎家系中發(fā)現(xiàn)了MEI1基因變異，患者的葡萄胎組織分型提示均為單精純合CHM[26]。MEI1基因在男性不育癥中研究較多見[27]，而Nguyen等[26]研究表明，在基因敲除Mei1小鼠卵母細胞中，基因敲除會導致遺傳物質部分或全部從卵母細胞中排出，這與攜帶基因變異患者的葡萄胎、流產(chǎn)等病史相符。該研究也報道了2例有葡萄胎病史的患者中存在TOP6BL/C11orf80 [type 2 DNA topoisomerase 6 subunit B-like]基因變異，1例有1次流產(chǎn)史3次CHM病史的患者存在REC114基因變異，已知這2個基因在小鼠與減數(shù)分裂中DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）有關。

有研究報道了1例有2次流產(chǎn)史4次葡萄胎病史的患者，篩查后發(fā)現(xiàn)攜帶有PADI6基因復合雜合變異[28]。另有報道了2例有長達十余年原發(fā)性不孕癥病史的患者，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)分別攜帶了PADI6基因復合雜合變異（c.866C＞T，c.1895C＞T）和PADI6基因純合變異（c.1124dupT），輔助生殖治療周期提示PADI6和胚胎早期發(fā)育阻滯相關[24]。PADI6基因編碼肽酰精氨酸脫亞氨酶，這種鈣離子依賴性酶在轉錄后翻譯中將多肽的精氨酸殘基修飾成為瓜氨酸，已知PADI6與人和小鼠胚胎早期發(fā)育阻滯相關，Padi6基因敲除可導致雌性小鼠不孕，且該研究中發(fā)現(xiàn)PADI6和NLRP7在人GV期卵母細胞和早期胚胎中有著相同的定位，提示PADI6可能與葡萄胎發(fā)生有關[28]。

此外，2018年也有研究發(fā)現(xiàn)6個微小RNA（microRNA，miRNA），即miR-370-3p、miR-371a-5p、miR-518a-3p、miR-519d-3p、miR-520a3p和miR-934，在妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN）患者和CHM患者滋養(yǎng)層組織中表達有差異，其功能與機制有待進一步探討[29]。

6 治療及預后

葡萄胎患者臨床常用的治療方法主要為清宮術，由于患者子宮較大且質軟，需要避免子宮穿孔和大出血，可術前開放靜脈通路，術中在B超引導下進行吸宮，通常選用大號吸管，并選擇低負壓狀態(tài)[10,30]。清宮的病例有持續(xù)數(shù)周的高hCG水平或者hCG水平下降后復升，即提示可能有滋養(yǎng)層組織的殘留。葡萄胎患者要避免惡變的可能，然而在西方國家中，15%～20%的CHM可能會發(fā)生GTN，而僅有約不到5%的PHM可能會發(fā)生GTN[2]。在葡萄胎患者的隨訪中，需要避孕并持續(xù)關注血清中hCG的水平，直到hCG水平正常。同時隨訪中也需要關注患者的月經(jīng)情況、婦科檢查情況并復查B超等[10]。

7 葡萄胎和輔助生殖技術

隨著FISH、SNP array、ICSI、二代測序等技術的發(fā)展，輔助生殖技術可以幫助有2次及以上葡萄胎病史的女性實現(xiàn)正常受精，ICSI可以保證單精入卵，F(xiàn)ISH可以篩選男性胚胎來避免含有X染色體精子的單雄生殖[2]，如果不愿放棄女性胚胎，也可以在胚胎植入前檢測親本來源，以確保遺傳物質來源于父母雙方。按照時間順序將輔助生殖技術和葡萄胎患者相關的報道整理，見表2，但是即使是體外受精-胚胎植入前遺傳學檢測（IVF-PGT）技術仍不能避免葡萄胎發(fā)生的可能[2]。

表2 輔助生殖技術應用于葡萄胎患者的報道

NLRP7和KHDC3L在卵母細胞發(fā)育過程中都起著至關重要的作用，尤其是攜帶NLRP7雙等位基因變異的患者自然妊娠可能性較小，卵子捐贈有望提高患者的生育結果[2]。目前已經(jīng)報道了5例攜帶有NLRP7純合或復合雜合變異的患者通過捐卵的方式正常妊娠[37]。散發(fā)的葡萄胎患者比復發(fā)性雙親二倍體葡萄胎患者更有可能用自己的卵母細胞活產(chǎn)，這些患者可以通過IVF-PGT選擇雙親來源的二倍體胚胎進行移植，雖然這種方法不能完全防止葡萄胎的出現(xiàn)，但可以最大限度地增加患者正常懷孕的機會。隨著高通量測序的發(fā)展，SNP基因型分析和倍型分析也逐漸應用到輔助生殖技術中，這也為輔助生殖技術在葡萄胎患者中的應用提供了新的思路[38]。

8 結語與展望

隨著醫(yī)療水平的不斷提高，越來越多的葡萄胎患者在臨床上被發(fā)現(xiàn)，然而目前臨床上對于葡萄胎的診斷多依據(jù)臨床表現(xiàn)和組織病理分型，STR分型和基因檢測手段仍未普及，且由于臨床上取材的不完整性和葡萄胎組織存在嵌合的可能，葡萄胎準確的病理診斷仍然很困難。隨著輔助生殖技術的發(fā)展，針對RHM患者的生育需求，ICSI-IVF技術可以保證單精入卵，PGT通過單倍體分型明確胚胎遺傳物質的親本來源，減少非雙親來源的葡萄胎發(fā)生。然而，由于葡萄胎病因十分復雜，葡萄胎相關的遺傳因素眾多，IVF技術也不能完全避免葡萄胎的發(fā)生，因此葡萄胎的發(fā)病機制成為亟待闡明的難題，輔助生殖技術對葡萄胎患者生育結局的影響也需要進一步探討。