銀杏葉提取物對小鼠心肌細胞氧化應激損傷的影響*

宋 軍，朱燕梅，王秋林

成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科(成都 610500)

·論著·

銀杏葉提取物對小鼠心肌細胞氧化應激損傷的影響*

宋 軍，朱燕梅，王秋林△

成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科(成都 610500)

目的 探討銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract, EGb)對缺氧/復氧所致心肌細胞氧化應激損傷的保護作用。方法 將原代大鼠心肌細胞分為空白對照組(Con組)、高劑量EGb對照組(C160組)、缺氧/復氧組(H/R組)、低劑量EGb組(EGb40組)、中劑量EGb組(EGb80組)、高劑量EGb組(EGb160組)。采用四唑鹽(MTT)法檢測各組細胞活力，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組細胞的MDA含量、SOD活力、GSH與GSSG含量，并計算GSH/GSSG比值以及GSH/GSSG氧化還原電勢(Eh(GSH/GSSG))。結果 與Con組相比，H/R組的MDA含量、Eh(GSH/GSSG)升高(P<0.01)，細胞活力、GSH/GSSG值及SOD活力降低(P<0.01)。EGb40、EGb80和EGb160組的MDA含量、Eh(GSH/GSSG)較H/R組降低(P<0.01)，細胞活力、GSH/GSSG值及SOD活力升高(P<0.01)，且呈濃度依賴性(P<0.01)。結論 EGb具有明顯的抗氧化應激能力，EGb預處理可明顯衰減H/R心肌細胞所受的氧化損傷。

銀杏葉提取物；心肌細胞；氧化應激

擴張冠脈、溶栓、冠脈搭橋以及介入等再灌注療法是治療缺血性心臟病最主要的治療手段，但在這些治療措施產(chǎn)生療效的同時，也會引起潛在的缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷，直接影響患者預后[1]。大量證據(jù)表明，引起心肌細胞氧化應激損傷的重要病理機制是心肌缺血再灌注期間細胞內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)[2-3]，進而使機體的氧化和抗氧化平衡系統(tǒng)向氧化系統(tǒng)傾斜，表現(xiàn)為大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如丙二醛(malondialdehyde，MDA)產(chǎn)生、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力下降，還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸凸入赘孰?glutathione disulfide，GSSG)增多，導致GSH/GSSG比值降低，GSH/GSSG氧化還原電勢Eh(GSH/GSSG)升高。如何保護缺血性心肌，減輕心肌I/R損傷是目前治療缺血性心臟疾病的重要難題之一。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract, EGb)是一種天然的自由基清除劑。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)其對于預防心肌缺血再灌注損傷具有較顯著的作用[4]，可明顯提高SOD的活性并發(fā)揮其獨特的抗自由基作用[5]。本研究旨在觀察EGb對缺氧/復氧所致心肌細胞氧化應激損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

舒血寧注射液(EGb，國藥準字Z13020795，神威藥業(yè)，中國)；四唑鹽(MTT)購自美國Amresco公司；MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、GSSG檢測試劑盒均購自南京建成生物技術工程研究所。酶標儀購自美國Bio-rad公司；紫外分光光度儀購自德國Agilent Technologies公司。

1.2 實驗分組與模型制備

取生長達到70%～80%融合的心肌細胞(取自1～3 d齡SD大鼠乳鼠)，隨機分為空白對照組(Con組，持續(xù)CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，無處理)、高劑量EGb對照組(C160組，持續(xù)CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)+160 mg/L EGb)、缺氧/復氧組(H/R組，僅作缺氧/復氧處理，不加藥)、低/中/高劑量EGb組(EGb40組/EGb80組/Egb160組，缺氧/復氧處理+40/80/160 mg/L EGb)。藥物預處理2 h后，參照文獻[6]的方法在厭氧培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)(5% CO2；5% H2；90% N2；37 ℃)24 h，缺氧處理完畢后再進行復氧培養(yǎng)(5% CO2；95% 空氣；37 ℃)4 h，完成缺氧/復氧模型的建立。

1.3 檢測指標與方法

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 心肌細胞形態(tài)學觀察結果

倒置顯微鏡下觀察心肌細胞，剛分離的乳鼠心肌細胞呈圓形，大小均一；培養(yǎng)72 h后可見細胞呈簇生長且搏動明顯，折光性強，有偽足伸出，細胞形態(tài)多樣化，如圓形、梭形，菱形等(圖1A)。H/R組心肌細胞搏動幅度減弱或消失、節(jié)律不齊且部分停搏，折光性下降，偽足縮短或消失(圖1B)。EGb160組心肌細胞形態(tài)得到明顯改善，逆轉(zhuǎn)了H/R損傷造成的搏動頻率和節(jié)律的異常(圖1C)。

圖1 心肌細胞形態(tài)圖

注：A為正常心肌細胞(Con)10×;B為缺氧復氧心肌細胞(H/R)10×;C為EGb 160 mg/L(EGb160)10×

2.2 EGb對心肌細胞H/R損傷誘發(fā)的氧化應激的影響

H/R組MDA含量較其他組高(P<0.001)，3組遞增劑量EGb預處理組的MDA含量較H/R組低(P值均<0.001)，呈濃度依賴性，且EGb40、EGb80與EGb160組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖2)。

圖2 銀杏葉對心肌細胞H/R損傷后MDA的影響±s)

注：##代表與Con組比較P< 0.001，**代表與H/R組比較P< 0.001

2.3 EGb對心肌細胞H/R損傷后抗氧化酶活力的影響

與Con組比較，H/R組SOD活力降低(P<0.001)，3組遞增劑量EGb預處理組的SOD活力較H/R組上升(P=0.002，P<0.001，P<0.001)，呈濃度依賴性，且EGb40、EGb80與EGb160組間差異明顯(P<0.001)(圖3)。

注：##代表與Con組比較P< 0.001，**代表與H/R組比較P<0.001

2.4 EGb對心肌細胞H/R損傷后氧化還原狀態(tài)改變的影響

與Con組比較，H/R組GSH/GSSG值下降(P<0.001)，而Eh(GSH/GSSG)上升(P=0.001)。3組遞增濃度EGb預處理組的GSH/GSSG值較H/R組高(P<0.001，P<0.001，P<0.001)，而Eh(GSH/GSSG)低(P=0.029，P=0.001，P<0.001)，均呈濃度依賴性。GSH/GSSG值和Eh(GSH/GSSG)在EGb40、EGb80與EGb1603組間差異無統(tǒng)計學意義(P<0.001，P=0.004)(圖4)。

圖4 銀杏葉對心肌細胞H/R損傷后氧化還原狀態(tài)的影響

注：#和##分別代表與Con組比較P< 0.05和P< 0.001，*和**分別代表與H/R組比較P< 0.05和P< 0.001

3 討論

EGb是從銀杏葉中提取的有效藥用成分，主要成分為黃酮及萜內(nèi)酯，具有清除氧自由基，提高抗氧化酶的活性；降低Ca2+內(nèi)流，減少細胞內(nèi)鈣超載；舒張血管，改善微循環(huán)；調(diào)節(jié)血脂；減少血小板聚集，抗血栓形成等作用。EGb的還原性羥基功能團可直接發(fā)揮抗氧化作用，清除超氧陰離子，增加SOD[7]和過氧化氫酶的活性及含量，增加谷胱甘肽水平，降低MDA，抑制髓過氧化物酶(MPO)活性[8-9]，有效清除超氧陰離子[7]，對抗二苯三硝基苯肼自由基的損傷[10]、抑制脂質(zhì)過氧化反應[11]，下調(diào)環(huán)氧化酶-2基因表達[12]、增加誘導型一氧化氮合酶的表達[13]。本研究利用EGb預處理H/R損傷心肌細胞，觀察EGb對心肌細胞H/R損傷的影響。結果發(fā)現(xiàn)，H/R處理后，細胞活力下降，MDA含量增加、抗氧化酶SOD活性降低。經(jīng)EGb預處理H/R損傷心肌細胞后，細胞存活率明顯上升、MDA含量明顯降低、SOD活力明顯增強。提示EGb能對抗H/R損傷。這些結果與之前的研究結果[14-15]類似，再次證明EGb具有抗氧化應激作用。

氧化應激是心肌缺血再灌注損傷過程中關鍵的一個環(huán)節(jié)[16]，它的誘發(fā)主要起源于再灌注期間ROS的爆發(fā)性產(chǎn)生[17]。生理狀態(tài)下由于細胞內(nèi)存在完善的抗氧化防御系統(tǒng)，使體內(nèi)產(chǎn)生的ROS不斷被清除，僅有1%～2%的氧生成ROS；但在I/R損傷等病理狀態(tài)下，ROS爆發(fā)性產(chǎn)生使保護酶活性受抑制，破壞了機體氧化-抗氧化平衡，使細胞處于氧化狀態(tài)，造成ROS生成與清除這一動態(tài)平衡被打破，機體累計過多的ROS而引起的一系列損傷。隨著機體生理、疾病過程的變化，體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)也隨之發(fā)生改變。文獻[18]報道，在與氧化應激相關的疾病如不同類型的腫瘤、急性胰腺炎和慢性阻塞性肺病過程中，機體的氧化還原狀態(tài)明顯向氧化方向偏移。氧化應激可引起GSSG濃度升高、GSH濃度降低而導致GSH/GSSG值下降，因此可以利用GSH/GSSG值評價機體氧化還原狀態(tài)。由于考慮到Eh值可定量地表示GSH/GSSG獲得或失去電子的趨勢，再加上2GSH← →GSSG這一化學計量關系，可認為Eh(GSH/GSSG)比GSH/GSSG值更重要。而Eh(GSH/GSSG)易受GSH濃度及GSH/GSSG值的影響，因此Eh(GSH/GSSG)也不能完整闡明機體的氧化還原狀態(tài)；本研究重點結合GSH/GSSG值與Eh(GSH/GSSG)共同反映機體的氧化還原狀態(tài)的改變，檢測了EGb對H/R心肌細胞GSH/GSSG值、Eh(GSH/GSSG)的影響。結果顯示，經(jīng)H/R處理后，細胞GSH/GSSG值下降、Eh(GSH/GSSG)上升，說明受H/R損傷后細胞的氧化還原狀態(tài)向氧化方向偏移。而EGb預處理后GSH/GSSG值上升而Eh(GSH/GSSG)下降，表明EGb預處理可抵抗H/R損傷導致的氧化還原狀態(tài)向氧化偏移，提高細胞的抗氧化能力。

綜上所述，本研究成功建立了缺氧/復氧模型，證實了EGb具有明顯的抗氧化應激能力，EGb預處理可明顯衰減H/R心肌細胞所受的氧化損傷，其相關分子機制研究正在進行中。

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A Study on the Effect of Ginkgo Biloba Extract on the Oxidative Stress Injury of Mouse Cardiomyocytes

Song Jun, Zhu Yanmei, Wang Qiulin△.

Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

Objective To investigate the protective effect of Ginkgo Biloba Extract (EGb) on the oxidative stress injury induced by hypoxia/reoxygenation in cardiomyocytes. Methods The cardiomyocytes of primary rats were divided into the blank control group (Con group), and high-dose EGb control group (C160 group), hypoxia/reoxygenation group (H/R group), low-dose EGb group (EGb40 group), medium-dose EGb group (EGb80 group), and high-dose EGb group (EGb160 group). The methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the viability of cardiomyocytes in each group, and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was adopted to measure the SOD activity and the content of MDA, GSH and GSSG. Then the ratios of GSH/GSSG and GSH/GSSG redox potential (Eh(GSH/GSSG)) were calculated. Results Compared with the Con group, MDA content and Eh(GSH/GSSG)in the H/R group were significantly increased (P<0.01), while the cell viability, GSH/GSSG ratio and SOD activity were significantly decreased (P<0.01). Compared with the H/R group, the MDA content and Eh(GSH/GSSG)in the EGb40, EGb80 and EGb160 groups were significantly lower (P<0.01), while the cell viability, GSH/GSSG ratio and SOD activity were significantly increased (P<0.01) in a concentration-dependent manner (P<0.01). Conclusion EGb has obvious capacity of antioxidant stress, and the EGb pretreatment can attenuate the oxidative damage of H/R cardiomyocytes.

Ginkgo biloba extract; Cardiomyocytes; Oxidative stress

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170321.0922.016.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.03.005

四川省教育廳自然科學科研項目(No:2006B109)

R285.5

A

△通信作者：王秋林，E-mail:wangredox@163.com