表沒食子兒茶素沒食子酸酯對穩(wěn)定表達淀粉樣前體蛋白的SH-SY5Y細胞抗炎抗凋亡作用研究

王 晶

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(沈陽 110032)

·論著·

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對穩(wěn)定表達淀粉樣前體蛋白的SH-SY5Y細胞抗炎抗凋亡作用研究

王 晶

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(沈陽 110032)

目的 探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)對穩(wěn)定表達淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)的SH-SY5Y細胞抗炎抗凋亡的保護作用。方法 將SH-SY5Y細胞分為對照組、模型組(穩(wěn)定表達APP的細胞)和EGCG組(APP+10、20、30 μmol/L的EGCG)。免疫熒光細胞化學(xué)法觀察APP在各組細胞中表達；MTT法檢測細胞存活能力；TUNEL法檢測細胞凋亡情況；RT-PCR法檢測Bax、Bcl-2和Caspase-3表達；ELISA法測定IL-6和TNF-α濃度。結(jié)果 模型組中，APP高表達；與模型組比較，給予20 μmol/L EGCG的EGCG組明顯提高SH-SY5Y細胞的存活率，減少細胞凋亡數(shù)目，下調(diào)Bax/Bcl-2比例及Caspase-3 mRNA表達，減少IL-6和TNF-α濃度。結(jié)論 EGCG對穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞有一定保護作用，可能是通過抗炎以及減少細胞凋亡發(fā)揮治療作用。

EGCG；APP；阿爾茨海默?。籗H-SY5Y細胞；細胞凋亡

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)，又名老年癡呆，是一種中樞神經(jīng)退變性疾病，起病隱匿，病程緩慢且具有持續(xù)性，以漸進性記憶缺失、認知功能降低及語言表達不清等為主要臨床表現(xiàn)[1]。目前，較為公認的AD發(fā)病機制是突變的淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因先后被β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶剪切形成Aβ1-42，其在腦內(nèi)異常沉積，并觸發(fā)一系列炎癥等不良反應(yīng)，導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)細胞大量損傷乃至凋亡[2-3]。現(xiàn)如今，我國老齡化人口成指數(shù)增長，AD也成為了社會上較為嚴重的問題，所以，最為緊迫的是采用有效藥物來延緩或者治療AD，提高患者及其家屬的生活質(zhì)量。

綠茶是我國主要茶類之一，有著將近5 000年的歷史，其中，含有茶多酚、兒茶素及維生素等營養(yǎng)成分[4]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)是綠茶中的有效活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化以及抗炎等藥理作用[5-6]。最近，研究[7-9]表明，EGCG可通過抑制Aβ聚集、抑制Tau蛋白磷酸化以及增強乙酰膽堿水平等，對AD發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但對AD的抗炎抗凋亡作用還未見報道。因此，本實驗用含有突變APP695基因的SH-SY5Y細胞作為細胞模型來模擬AD，旨在探討EGCG的抗炎抗凋亡作用，為臨床治療AD提供一種新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

EGCG(購自Sigma公司)溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma)，終濃度<0.1%，用DMEM /F12( dulbecco′s modified eagle medium/F12，Gibco)配成含有10、20、30 μmol/L的EGCG培養(yǎng)液待用。胎牛血清 (fetal calf serum, FBS)購自Gibco公司； 青-鏈霉素購自Thermo公司；MTT購自Sigma公司；一抗兔抗APP購于北京博奧森生物有限公司；二抗為驢抗兔FITC購自Jackson公司；DAPI染色液購自Sigma公司；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自Thermo公司；PCR Master Mix Kit試劑購自Thermo公司；IL-6、TNF-α人的ELISA試劑盒購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器

倒置熒光顯微鏡 (DYF-880，上海點應(yīng)光學(xué))，CO2培養(yǎng)箱 (DHP-9052，上海印溪)， PCR儀 (Bio-rad，北京伯邁)，凝膠成像系統(tǒng) (2500R，上海天能)，紫外可見分光光度計(UV-9000，上海元析)，酶標(biāo)儀(BS-1101，南京德鐵)。

1.3 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)

穩(wěn)定表達APP695基因突變的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞(購于美國Burnham醫(yī)學(xué)院)，正常SH-SY5Y細胞(購自中國科學(xué)院動物研究所)，以6×109/L密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)皿中，加入含有10% FBS和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，放置于37 °C，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天全量換液1次，隔天傳代，并在顯微鏡下進行觀察[10]。

1.4 免疫熒光細胞化學(xué)法檢測正常以及穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞中APP的表達

將正常的SH-SY5Y細胞以及穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞以6×105/mL的密度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，100 μL/孔，共10孔。待細胞融合度達到80%～90%時，吸凈培養(yǎng)基， 4%多聚甲醛固定30 min；1%PBS洗滌3次，5 min/次后，再加入1%Tritox X-100透化15 min；1%PBS洗3次，5 min/次后，將兔抗APP以1∶150比例稀釋后，加入到各個孔中，4 ℃過夜； 1%PBS洗3次，5 min/次后，將驢抗兔的二抗以1∶200稀釋后，加入到各個孔中，室溫孵育1 h后，1%PBS洗3次，5 min/次，洗去二抗；以1∶50比例加入 DAPI染色液，室溫避光放置15 min后，于倒置熒光顯微鏡下拍照，保存[11]。

1.5 細胞分組

將SH-SY5Y細胞分為對照組、模型組(穩(wěn)定表達APP的細胞)以及EGCG組(對穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞，給予10、20、30 μmol/L的EGCG)，置于37 °C，5% CO2空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進行以下實驗。

1.6 MTT法檢測各組SH-SY5Y細胞活力

將置于96孔板中經(jīng)處理的各組SH-SY5Y細胞，每孔加入濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液20 μL，在培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄掉上清液，加入150 μL DMSO溶液，在搖床上慢慢搖動15 min，直至紫色甲瓚完全溶解，并用酶標(biāo)儀在492 nm處測定吸光度[12]。每組3個復(fù)孔，重復(fù)3次實驗。

1.7 TUNEL法檢測細胞凋亡

取置于96孔板中經(jīng)處理的各組SH-SY5Y細胞，吸去培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定25 min；1%PBS洗3次，5 min/次后，再向各孔中加入1%Tritox X-100透化5 min；1%PBS洗3次后，每孔加入50 μL TdT溶液；暗處孵育60 min后，每孔加入streptavidin-TRITC溶液，37 ℃，孵育30 min； 1%PBS洗3次后，加入 DAPI染色液(1∶50)，室溫避光放置10 min后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照[10]。每組3個復(fù)孔，重復(fù)3次實驗。

1.8 RT-PCR檢測各組SH-SY5Y細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達

取按1.5分組并處理的細胞，棄去培養(yǎng)基，按查找文獻[13]所示方法，利用Trizol提取各組細胞的RNA，按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書所示步驟，將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA；PCR Master Mix Kit 試劑盒說明書所示步驟，構(gòu)建PCR反應(yīng)。相關(guān)引物序列如下(表1)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，2 min；變性95 ℃ ，30 s，退火60 ℃ ，30 s，延伸72 ℃，1 min，擴增35個循環(huán)；終延伸72 ℃ ，10 min。以β-actin作為內(nèi)參，擴增物用瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)記錄拍照，用Image J圖像分析軟件對條帶進行光密度掃描，結(jié)果用相對光密度表示，相對光密度=光密度目的基因/光密度β-actin。重復(fù)3次實驗。

表 1 相關(guān)基因序列

1.9 ELISA法檢測各組SH-SY5Y細胞上清中IL-6和TNF-α的表達

利用ELISA試劑盒檢測各組細胞上清液中IL-6和TNF-α兩種炎癥因子的表達，按照說明書所示進行操作。吸取置于96孔板中經(jīng)處理的各組SH-SY5Y細胞的上清液50 μL，加入酶標(biāo)板中，每組3個復(fù)孔，加入50 μL酶標(biāo)溶液；37 ℃，溫育60 min后，每孔加入顯色劑A和B各50 μL；37 ℃避光顯色15 min后，加入50 μL終止液，并利用酶標(biāo)儀在450 nm處測量其吸光度。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組細胞上清液中炎癥因子濃度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 APP在正常以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP的SH-SY5Y細胞中的表達

在對照組中，APP的表達很少，而APP組中呈現(xiàn)高水平表達(綠色)。此外，根據(jù)DAPI染色的細胞核中也可看出，對照組的細胞核呈圓形，較飽滿，形態(tài)較好，而模型組的細胞核多數(shù)呈梭形，破裂較多(圖1)。

圖1 免疫熒光細胞化學(xué)法檢測2組細胞中APP的表達

2.2 EGCG增強穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞的活力

模型組的SH-SY5Y細胞活力(67.0±6.30)% 與對照組 (100%)比較，有明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而給予不同濃度EGCG的EGCG組存活率分別為(77.01±5.81)%、(90.00±8.92)%和(91.00±10.11)%，與模型組相比，具有明顯提高(P<0.05，P<0.01)。其中，濃度為 20、30 μmol/L EGCG的SH-SY5Y細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此，以下實驗均用 20 μmol/L的 EGCG(圖2)。

2.3 EGCG減少穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞的凋亡率

模型組的TUNEL陽性細胞率(34.50±4.11)%(紅色)，較對照組(4.30±0.59)%增加(P<0.01)；而給予了EGCG穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞的TUNEL陽性細胞率為(20.11±1.50)%，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3)。

圖2 MTT法比較各組SH-SY5Y細胞活力

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較；#P<0.05,##P<0.01

注：A.TUNEL染色凋亡細胞(紅色)，DAPI染色細胞核(藍色)；B.定量分析細胞凋亡率；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.4 EGCG對穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的影響

用RT-PCR法檢測了EGCG對穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，模型組與對照組相比，凋亡因子Bax/Bcl-2 mRNA比例(4.60±0.55 vs. 1.00±0.09)和Caspase-3 mRNA的表達量(2.01±0.12 vs. 0.98±0.04)明顯升高(P<0.01)；而EGCG組與模型組相比，凋亡因子Bax/Bcl-2 mRNA比例(2.42±0.26 vs. 4.60±0.55)和Caspase-3 mRNA的表達量(1.52±0.08 vs. 2.01±0.12)明顯降低(P<0.01)(圖4)。

圖4 各組SH-SY5Y細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的比較

注： A. RT-PCR 法檢測各組細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的表達，β-actin為內(nèi)參；B、C. Image J分析并比較Bax/Bcl-2和Caspase-3 mRNA的表達；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.5 EGCG對穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞中IL-6和TNF-α表達的影響

為了驗證EGCG是否對穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞具有抗炎作用，使用ELISA試劑盒來檢測各組細胞上清液中IL-6和TNF-α的濃度，結(jié)果顯示，對照組細胞上清液中IL-6和TNF-α濃度分別為(15.91±1.41) pg/mL、(31.62±4.56) pg/mL，模型組細胞上清液中IL-6和TNF-α濃度分別為(70.10±8.03) ng/mL、(120.13±15.10) ng/mL，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；在給予了EGCG后的細胞上清液中，IL-6和TNF-α濃度明顯降低到(37.30±2.69 )ng/mL、(80.61±8.06 )ng/mL，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖5)。

圖5 ELISA法檢測各組細胞中IL-6和TNF-α的濃度

3 討論

EGCG是綠茶中的有效成分，屬于兒茶素，具有抗血栓形成、抗炎以及抗氧化等藥理作用[5-6,14]。EGCG在AD的防治方面也有一定進展，例如閆玉芳等[7]在APP轉(zhuǎn)基因的小鼠細胞體外模型中發(fā)現(xiàn)，EGCG可在基因及蛋白水平上抑制BACE1的表達，使Aβ生成減少來發(fā)揮治療作用；而Rezai-Zadeh等[8]在APP轉(zhuǎn)基因大鼠的體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，給予轉(zhuǎn)基因大鼠灌胃50 mg/kg的EGCG后，Tau蛋白的病理現(xiàn)象得到了明顯改善。因此，本實驗通過選用穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞模擬AD細胞模型，并用免疫熒光細胞化學(xué)法來檢測細胞模型的穩(wěn)定與可靠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L的EGCG可明顯促進模型組細胞的存活能力，減少細胞凋亡的數(shù)目。

細胞凋亡一般是指細胞在外來或自身因素的作用下，通過調(diào)控細胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物而發(fā)生的一種程序性細胞死亡。Bcl-2蛋白家族是調(diào)節(jié)線粒體通透性的主要成分，通過與Bax形成二聚體，對細胞凋亡進行調(diào)控，當(dāng)Bax過表達是促進細胞凋亡，當(dāng)Bal-2過表達為抑制細胞凋亡并且促進神經(jīng)細胞神經(jīng)功能的修復(fù)[15-16]。而Bax與Bcl-2比例的增大，會導(dǎo)致Caspase-3表達增多，進而導(dǎo)致細胞凋亡[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP的SH-SY5Y細胞的凋亡數(shù)較正常組明顯增多，提高了Bax/Bcl-2的比例以及Caspase-3 mRNA的表達；而給予了EGCG的給藥組能夠明顯減少模型組細胞的凋亡數(shù)，降低Bax/Bcl-2的比例以及Caspase-3 mRNA的表達，因此，EGCG具有抑制穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP的SH-SY5Y細胞凋亡的作用。

近年來，研究[18]發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)大量沉積的Aβ會與神經(jīng)膠質(zhì)細胞的受體結(jié)合，激活腦組織中的小膠質(zhì)細胞，進而釋放大量炎癥因子，如IL-6和TNF-α等，誘發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)或直接損傷神經(jīng)元，最終導(dǎo)致大量神經(jīng)元損傷、潰變乃至死亡。本實驗利用ELISA法檢測了細胞上清中IL-6和TNF-α的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 模型組的細胞上清中，IL-6和TNF-α的濃度較正常組明顯增多，當(dāng)給予EGCG后，細胞上清中的IL-6和TNF-α的濃度均有明顯降低，說明了EGCG對炎癥反應(yīng)也有抑制作用。

綜上所述，EGCG對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP的SH-SY5Y細胞有一定的神經(jīng)保護作用，其作用可能是通過抑制細胞凋亡、減輕炎癥因子表達來實現(xiàn)，為有效治療AD等神經(jīng)退行性疾病提供了新思路。

[1]Schonrock N, Matamales M, Ittner L M,etal. MicroRNA networks surrounding APP and amyloid-β metabolism--implications for Alzheimer′s disease[J]. Exp Neurol, 2012, 235(2): 447-454.

[2]Torreilles F, Touchon J. Pathogenic theories and intrathecal analysis of the sporadic form of Alzheimer′s disease[J]. Prog Neurobiol, 2002, 66(3): 191-203.

[3]Wilcock D M, Gharkholonarehe N, Van Nostrand W E,etal. Amyloid reduction by amyloid-beta vaccination also reduces mouse tau pathology and protects from neuron loss in two mouse models of Alzheimer′s disease[J]. J Neurosci, 2009, 29(25): 7957-7965.

[4]黃玉梅, 余小荔. 茶的主要化學(xué)成分及其對人體的保健作用[J]. 農(nóng)業(yè)考古, 2009(5): 240-243.

[5]廖音娟, 胡長平. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯抗肝癌作用機制研究進展[J]. 中南藥學(xué), 2012, 10(2): 132-136.

[6]陳潤麗, 李麗, 唐燕霞, 等. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對柔紅霉素致小鼠心肌損傷的抗氧化作用[J]. 廣西醫(yī)學(xué), 2015, 37(1): 62-64.

[7]閆玉芳, 龔鍇, 馬拓, 等. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過抑制BACE1轉(zhuǎn)錄和翻譯減少Aβ生成[J]. 生物物理學(xué)報, 2013, 29(7): 486-495.

[8]Rezai-Zadeh K, Arendash G W, Hou H,etal. Green tea epigallocatechin-3-gallate (EGCG) reduces beta-amyloid mediated cognitive impairment and modulates tau pathology in Alzheimer transgenic mice[J]. Brain Res, 2008, 1214: 177-187.

[9]Biasibetti R, Tramontina A C, Costa A P,etal. Green tea (-)epigallocatechin-3-gallate reverses oxidative stress and reduces acetylcholinesterase activity in a streptozotocin-induced model of dementia [J]. Behav Brain Res, 2013, 236(1): 186-193.

[10] 王君, 劉新民, 潘瑞樂. SH-SY5Y細胞膜固相色譜法的建立及其對遠志皂苷堿水解產(chǎn)物效應(yīng)物質(zhì)的研究[J]. 中南藥學(xué), 2014, 12(7): 661-663.

[11] Li S, Yan Y, Jiao Y,etal. Neuroprotective Effect of Osthole on Neuron Synapses in an Alzheimer′s Disease Cell Model via Upregulation of MicroRNA-9[J]. J Mol Neurosci, 2016, 60(1): 71-81.

[12] Hu Y, Wen Q, Liang W,etal. Osthole Reverses Beta-Amyloid Peptide Cytotoxicity on Neural Cells by Enhancing Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Phosphorylation[J]. Biol Pharm Bull, 2013, 36(12): 1950-1958.

[13] 李少恒, 胡昱, 姚瓔珈, 等. 蛇床子素對神經(jīng)干細胞體外分化的影響[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報, 2015, 34(7): 856-860.

[14] 龐愛明, 阮長耿. 綠茶的主要成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對血小板功能影響的研究[J]. 中國血液流變學(xué)雜志, 2004, 14(1): 37-39.

[15] Kotipatruni R R, Dasari V R, Veeravalli K K,etal. p53- and Bax-mediated apoptosis in injured rat spinal cord[J]. Neurochem Res, 2011, 36(11): 2063-2074.

[16] Gross A, Jockel J, Wei M C,etal. Enforced dimerization of BAX results in its translocation, mitochondrial dysfunction and apoptosis[J]. EMBO J, 1998, 17(14): 3878-3885.

[17] Li P, Nijhawan D, Budihardjo I,etal. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade[J]. Cell, 1997, 91(4): 479-489.

[18] Hüll M, Lieb K, Fiebich B L. Pathways of inflammatory activation in Alzheimer′s disease: potential targets for disease modifying drugs[J]. Curr Med Chem, 2002, 9(1): 83-88.

A Study on the Anti-inflammatory and Anti-apoptosis Effect of EGCG on APP-expressing SH-SY5Y Cells

Wang Jing.

The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China

Objective To investigate the anti-inflammatory and anti-apoptosis effect of EGCG on human SH-SY5Y cells expressing amyloid precursor protein (APP) stably. Methods The SH-SY5Y cells were randomly divided into three groups including the control group, model group (SH-SY5Y cells expressing APP stably ), and EGCG group ( APP-expressing cells treated with 10, 20 and 30 μmol/L EGCG respectively). The expression of APP was confirmed by the immunofluoresence staining; the cell viability was assessed by MTT; the number of cell apoptosis was assessed by TUNEL; the mRNA expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were determined by RT-PCR; the concentration of IL-6 and TNF-α was assessed by ELISA. Results The APP expression was higher in the model group. Compared with the model group, The administration of 20 μmol/L EGCG promoted the survival rate of SH-SY5Y cells, reduced the number of apoptotic cells, downregulated the radio of Bax and Bcl-2 and the mRNA expression of Caspase-3, and decreased the concentration of IL-6 and TNF-α. Conclusion EGCG has protective effect on the APP-expressing SH-SY5Y cells and the therapeutic effect may be achieved by anti-inflammation and anti-apoptosis.

EGCG; APP; Alzheimer′s disease; SH-SY5Y cells; Cell apoptosis

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170321.0920.010.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.03.004

R284

A