不同地域中藥蘄蛇多糖含量測(cè)定及抗腫瘤作用初步研究

郭 欣 王 維

蘄蛇為蝰科動(dòng)物五步蛇Agkistrodon acutus（Güenther）的干燥體，具有祛風(fēng)，通絡(luò)，止痙等功效，用于風(fēng)濕頑痹，麻木拘攣，中風(fēng)，半身不遂，抽搐痙攣，破傷風(fēng)，麻風(fēng)疥癬[1]。蘄蛇主要含有氨基酸、骨膠原、脂肪、多糖等成分[2]，藥理研究顯示，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制腫瘤活性和殺死癌細(xì)胞的作用[3]。目前以中藥蘄蛇組方而成復(fù)方制劑金龍膠囊、消癌片、解熱除毒丸等在癌癥治療過程中發(fā)揮積極療效，但是由于對(duì)蘄蛇研究的不足，其主要的抗腫瘤活性成分并未明晰[4-5]。本研究前期已經(jīng)分離出蘄蛇多糖和蛋白類成分，多糖類成分在抗腫瘤方面取得很好的效果。蘄蛇蛋白類的成分對(duì)肝癌Hep G2、肺癌A549、H1299、白血病KG-1、MEC-1 等在內(nèi)的多種細(xì)胞株有很好抑制作用[6-7]。但是對(duì)于動(dòng)物蛋白、多糖類成分的提取相對(duì)困難，且得率較低。因此，我們應(yīng)用前期建立的適用于中藥蘄蛇中多糖含量測(cè)定方法，對(duì)不同地域的蘄蛇含量的多糖進(jìn)行測(cè)定，比較不同地域蘄蛇多糖含量，并初步探討其抗腫瘤作用。

1 材 料

1.1 儀器與試劑 UV-2600 紫外分光光度計(jì)（島津公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器-2000 型（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司）、KQ2299DV-超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）、電子分析天平（瑞士梅特勒）、LD4-2A 離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。葡萄糖（中國藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用）、苯酚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、濃硫酸（純度：98.08%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、蒸餾水（MILL-Q 純水儀制備），其他試劑均為分析純，購于北京化工廠。噻唑藍(lán)（MTT）（批號(hào)B0275）、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基1640（RPMI-1640）購自Sigma 公司，改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）購自Sigma 公司（批號(hào)ATCC30-2002）。人肝癌Bel-7404 細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海藥物研究所實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)樣品 本品為蝰科動(dòng)物五步蛇Agkisrrodon acutus（Güenther）的干燥體，剖開蛇腹，除去內(nèi)臟，洗凈，盤成圓盤狀。中藥蘄蛇樣品購自浙江省金華市磐安藥材城。地域分別為浙江溫州（批號(hào)20180924）、浙江麗水（批號(hào)20190713）、江西九江（批號(hào)20190213-4）、福建三明（批號(hào)20180932）、四川自貢（批號(hào)20190101）。

2 方 法

2.1 溶液制備

2.1.1 5%苯酚溶液制備 精密稱取苯酚5.00g 于100mL 棕色量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，得5%苯酚溶液，避光保存。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取于105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品約12.90mg，精密稱定，置25mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.516mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.1.3 供試品溶液制備 總糖供試品溶液制備：分別稱取蘄蛇粉末約10mg，置于10mL 量瓶中，加水適量使溶解，再加水定容至刻度，搖勻，4000rpm 離心5min，取上清液。再將蘄蛇稀釋5 倍，即得總糖供試品溶液。游離糖供試品溶液制備：分別稱取蘄蛇粉末約0.40g，分別置于100mL 三角瓶中，加水20mL 溶解，再加入無水乙醇，使含醇量達(dá)到85%，靜置過夜，4000rpm 離心5min，取上清液，55℃旋蒸蒸干，殘?jiān)盟芙猓D(zhuǎn)移至25mL 量瓶中，并定容至刻度，再將各樣品稀釋50 倍，即得游離糖供試品溶液。

2.2 苯酚-濃硫酸試驗(yàn) 精密吸取系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，蘄蛇供試品溶液各2mL，置于20mL 具塞玻璃試管中，分別加入5%苯酚溶液1mL，混勻，迅速加入濃硫酸7mL，搖勻，于40℃水浴中保溫30min，取出，立即置于冰水浴中5min，恢復(fù)至室溫，以水為隨行空白，于490nm 處測(cè)定吸光度。

2.3 MTT 法測(cè)定肝癌細(xì)胞抑制率 將Bel-7404 細(xì)胞株置于無菌及含有15%小牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，以104/孔接種于96 孔板上，培養(yǎng)24h 至細(xì)胞貼壁后，分別設(shè)置對(duì)照組（給予生理鹽水20mg/L），將福建三明市產(chǎn)蘄蛇多糖稀釋至終濃度為10mg/L（低劑量組）、20mg/L（中劑量組）、30mg/L（高劑量組）繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入MTT 各15μL 繼續(xù)培養(yǎng)4h，將培養(yǎng)基傾出，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，震蕩混合均勻。以酶標(biāo)儀于540nm 波長處讀取各孔吸光度，計(jì)算抑制率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞生長抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值）×100%。

3 結(jié)果

3.1 最大吸收波長確定 分別精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液（51.60μg/mL）和蘄蛇總糖溶液（17.15μg/mL）各2mL 按2.2 操作，于220～800nm 進(jìn)行光譜掃描，最終確定最大吸收波長為490nm，結(jié)果見圖1。

圖1 對(duì)照品和供試品吸收光譜

3.2 線性關(guān)系 分別準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL 于25mL 量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，得系列濃度為30.96，41.28，51.60，61.92，72.24μg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用紫外分光光度計(jì)法按上述系列濃度測(cè)定多糖含量。選取2.5mL 水顯色后的溶液作為空白，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果圖2。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液（濃度為51.60μg/mL）2mL，重復(fù)測(cè)定吸光度6 次，RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.4.1 總糖樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取總糖供試品溶液2mL，苯酚-濃硫酸顯色后分別放置0、2、4、8h測(cè)定吸光度（計(jì)算含量），總糖樣品在0～8h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD 值為0.83%。

3.4.2 游離糖樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取游離糖供試品溶液2mL，苯酚-濃硫酸顯色后分別放置0、2、4、8h 測(cè)定吸光度（計(jì)算含量），游離糖樣品在0～8h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD 值為1.87%。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

3.5.1 總糖樣品重復(fù)性試驗(yàn) 按2.1.3 操作各精密吸取2mL，6 份總糖樣品RSD 為2.83%，提示重復(fù)性良好。

3.5.2 游離糖樣品重復(fù)性試驗(yàn) 按2.1.3 操作得游離糖供試品溶液，各精密吸取2mL，6 份總糖樣品RSD 為2.77%，表明重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收試驗(yàn)

3.6.1 總糖加樣回收試驗(yàn) 分別稱取蘄蛇粉末6份，每份各約10mg，置于10mL 量瓶中，加水適量使溶解，再加水定容至刻度，搖勻，4000rpm 離心5min，取上清液。精密吸取1mL 續(xù)濾液，置于50mL 量瓶中，各加入1mL 葡萄糖對(duì)照品溶液21.75μg/mL，苯酚-濃硫酸顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，結(jié)果顯示，總糖平均回收率為99.62%，RSD=1.89%。見表1。

表1 總糖加樣回收試驗(yàn)

3.6.2 游離糖加樣回收試驗(yàn) 分別稱取蘄蛇粉末6份，各約0.40g，分別置于100mL 三角瓶中，加水20mL 溶解，再加入無水乙醇，使含醇量達(dá)到85%，靜置過夜，4000rpm 離心5min，取上清液，55℃旋蒸蒸干，殘?jiān)盟芙猓D(zhuǎn)移至25mL 量瓶中，并定容至刻度，精密吸取1mL 續(xù)濾液，置于50mL 量瓶中，各加入1mL 葡萄糖對(duì)照品溶液16.58μg/mL，苯酚-濃硫酸顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，結(jié)果顯示，總糖平均回收率94.57%，RSD=2.57%。見表2。

表2 游離糖加樣回收試驗(yàn)

3.7 樣品含量測(cè)定 分別選取來自浙江溫州、麗水、江西九江、福建三明、四川自貢中藥蘄蛇粉末各約0.4g，準(zhǔn)確稱量，按照上述樣品測(cè)定方法進(jìn)行制備并測(cè)定多糖含量。溫州、麗水、九江、三明、自貢中蘄蛇多糖含量依次為5.83%、7.02%、4.64%、8.65%、6.12%。

表3 不同地域蘄蛇中多糖含量測(cè)定結(jié)果

3.8 對(duì)肝癌Bel-7404 細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比較，蘄蛇多糖各個(gè)劑量組均可顯著抑制肝癌Bel-7404 細(xì)胞增殖，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。其抑制濃度隨著蘄蛇多糖含量增加而增強(qiáng)，蘄蛇多糖高劑量組對(duì)Bel-7404 細(xì)胞抑制率達(dá)到82.13%。

表4 MTT 法檢測(cè)蘄蛇多糖對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用

4 討論

隨著分子生物學(xué)研究領(lǐng)域不斷拓展，越來越多從動(dòng)物中提取的活性成分用于治療疾病。如從中藥守宮中提取的守宮硫酸多糖用于治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌[8]，從鮑魚中提取鮑魚多糖用于抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力[9]，鯊魚軟骨多糖及海刺參黏多糖抑制腫瘤細(xì)胞增殖，廣譜抗癌、抗病毒[10]。另有多項(xiàng)研究證實(shí)，多糖類成分在抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力、抗病毒等方面發(fā)揮重要作用[11-14]。蘄蛇作為抗腫瘤中成藥組方中成分，發(fā)揮了重要作用。

然而現(xiàn)行的蘄蛇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，不能完全控制和確保蘄蛇及其制劑的品質(zhì)。本研究采用苯酚-濃硫酸顯色法對(duì)不同地域的中藥蘄蛇中多糖含量進(jìn)行測(cè)定，其測(cè)定多糖含量原理為多糖在濃硫酸作用下先水解為單糖，單糖脫水后形成糖醛衍生物能與苯酚作用生成橙黃色化合物。在檢測(cè)波長490nm 處，吸光度和糖濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，最終對(duì)多糖采用比色法進(jìn)行定量分析[15]。

本研究結(jié)果顯示，已建立的多糖含量測(cè)定方法具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，適用于中藥中蘄蛇多糖含量的測(cè)定。本方法為今后蘄蛇多糖的質(zhì)量控制、藥效評(píng)價(jià)、藥理活性篩查等后續(xù)深入研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)經(jīng)過測(cè)定結(jié)果顯示，福建三明、江西九江地區(qū)的蘄蛇中多糖含量比較高，其具體原因有待于進(jìn)一步研究。以蘄蛇為組方的傳統(tǒng)中藥制劑在臨床上應(yīng)用廣泛，但其抗腫瘤主要成分及作用機(jī)制目前尚未清晰，本研究篩選了Hep G2、SMMC-7721、Hep 3b、H22，Bel-7404，蘄蛇多糖對(duì)其均表現(xiàn)了良好的抑制作用。本研究以蘄蛇中提取的多糖類物質(zhì)為基礎(chǔ)，初步探究其對(duì)肝癌細(xì)胞株的作用，為今后開展蘄蛇多糖抗腫瘤作用機(jī)制，開發(fā)新藥提供參考。