青蒿琥酯對大鼠缺血再灌注視網(wǎng)膜損傷保護(hù)作用的研究

畢家瑞，劉發(fā)蘭，劉娟

視網(wǎng)膜作為視覺傳導(dǎo)通路中的中間環(huán)節(jié)，在感受光刺激、傳遞神經(jīng)信號方面發(fā)揮重要作用。視網(wǎng)膜營養(yǎng)主要由視網(wǎng)膜中央動脈提供，視網(wǎng)膜中央動脈是終末血管，管徑細(xì)，分支多，極易發(fā)生缺血，并可迅速導(dǎo)致視網(wǎng)膜的嚴(yán)重?fù)p傷。缺血性視網(wǎng)膜疾病在眼底病中占有很大比例，其常見的原因包括眼動脈血液灌注不足引起的低灌注性視網(wǎng)膜疾病、眼缺血綜合征、視網(wǎng)膜中央動脈阻塞、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、高眼壓以及影響視網(wǎng)膜血流量的眼科手術(shù)等。當(dāng)視網(wǎng)膜組織缺血或視網(wǎng)膜血流灌注明顯下降時，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞功能障礙，部分細(xì)胞功能損傷不可逆，嚴(yán)重影響預(yù)后視力。部分病例的視網(wǎng)膜血管缺血后在一定時間內(nèi)又重新獲得再通，視網(wǎng)膜組織逐漸恢復(fù)血流并再次得到灌注，這個過程稱之為視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷。視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷引起視網(wǎng)膜組織缺氧、缺血，能量代謝障礙引起視功能下降[1]。青蒿琥酯（artesunate）是具有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，藥理作用廣泛，能夠減輕炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤生長，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[2-4]。本實驗通過采用前房灌注生理鹽水升高眼內(nèi)壓法建立SD大鼠缺血再灌注視網(wǎng)膜組織損傷模型，探討青蒿琥酯對大鼠缺血再灌注視網(wǎng)膜組織損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

48 只SPF 級雄性SD 大鼠（體質(zhì)量200～280 g），均符合國家醫(yī)用動物一級動物使用標(biāo)準(zhǔn)，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物實驗中心提供［生產(chǎn)合格證：SCXX（黑）2019-001］。

1.2 材料

青蒿琥酯（純度≥99%，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：H32020967)），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性檢測試劑盒、丙二醛（malondialedhyde，MDA）活性檢測試劑盒（上海碧云天公司），RIPA 蛋白裂解液、Caspase-3、Caspase-9 抗體（南京建成生物工程研究所）。

1.3 分組及造模

48 只SD 大鼠隨機(jī)分為對照組（SOG）、模型組（MG）、青蒿琥酯低（ALG）、高濃度治療組（AHG），每組12 只，除對照組外，其余3 組SD 大鼠水合氯醛麻醉，眼表滴用2%丁卡因麻醉，4.5 號頭皮針通過輸液管連接到生理鹽水瓶輸液上，輸液瓶與大鼠眼表垂直高度為1.5 m，沿顳側(cè)角膜緣將頭皮針刺入前房（避免接觸角膜內(nèi)皮及晶狀體），此時觀察前房加深，角膜霧狀渾濁，瞳孔對光反射消失，視網(wǎng)膜血供中斷，持續(xù)1 h 后拔除針頭，視網(wǎng)膜血供恢復(fù)，模型建立成功。青蒿琥酯低、高濃度組于模型制作完成后立刻將青蒿琥酯（10 mg/kg、20 mg/kg）注射于腹腔內(nèi)，對照組和模型組大鼠腹腔內(nèi)注射等體積0.9%Nacl 注射液，連續(xù)注射7 d，每日1 次。

1.4 大鼠視網(wǎng)膜取材及制備

斷頭處死各組實驗大鼠，摘取眼球后生理鹽水沖洗后剝離視網(wǎng)膜組織，每組隨機(jī)取3 只大鼠視網(wǎng)膜置于10%多聚甲醛溶液中固定，用于HE 染色；取3 只大鼠視網(wǎng)膜組織置于2.5%戊二醛溶液中固定用于透射電鏡觀察；剩余視網(wǎng)膜組織用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.5 視網(wǎng)膜組織HE 染色

大鼠視網(wǎng)膜組織用二甲苯進(jìn)行脫蠟處理，制備石蠟切片，梯度酒精脫水，蒸餾水反復(fù)沖洗，蘇木素染液浸泡10 min 后氨水及酸水分色，置于梯度酒精溶液浸泡10 min，HE 染色30 s，封片后拍照。

1.6 電鏡觀察視網(wǎng)膜組織

取出戊二醛固定液中的視網(wǎng)膜組織，蒸餾水反復(fù)沖洗后四氧化鋨（OsO4）固定2 h，梯度酒精脫水，染色后環(huán)氧樹脂包埋，制備超薄切片，透射電鏡觀察大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞并拍照。

1.7 檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT 活性及MDA 含量

取視網(wǎng)膜組織勻漿，細(xì)胞裂解液裂解后4℃離心（10，000 rpm）10 min，收集上清液在冰浴上操作：取200 μm 上清加入到96 孔板中，用分光光度計在酶標(biāo)儀上測定吸光度。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測Caspase-3 及Caspase-9

研磨視網(wǎng)膜組織，冰上以蛋白裂解液提取蛋白，離心機(jī)離心（12000 r/min）后棄上清，將蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫封閉2 h，孵育加入一抗（Caspase-3 及Caspase-9），1 h 后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，TBST 洗膜3 次后，于暗室掃膜顯影。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用SNK-q 檢驗，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠視網(wǎng)膜組織病理改變

對照組大鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)、外核層細(xì)胞排列致密；模型組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變薄，內(nèi)核層及外核層厚度明顯減少，青蒿琥酯治療組與模型組相比，內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度增加（圖1）。

2.2 視網(wǎng)膜組織電鏡觀察結(jié)果

對照組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，核仁清晰，核膜光滑，核質(zhì)分散均勻；模型組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞內(nèi)大量空泡結(jié)構(gòu)，核膜腫脹溶解，核濃縮；青蒿琥酯治療組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞形態(tài)改善，核內(nèi)染色質(zhì)邊集，空泡結(jié)構(gòu)減少，細(xì)胞核形態(tài)逐漸規(guī)整（圖2）。

2.3 青蒿琥酯對視網(wǎng)膜組織SOD、CAT 活性及MDA含量的影響

SOD：對照組與模型組SOD 活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=30.229，P=0.000）。青蒿琥酯低、高濃度組SOD 活性與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tALG=8.128，P=0.000；tAHG=11.131，P=0.000）。

圖1 各組視網(wǎng)膜病理結(jié)構(gòu)變化結(jié)果（HE 染色×400）。1A 對照組；1B 模型組；1C 青蒿琥酯低濃度組；1D 青蒿琥酯高濃度組

圖2 大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果（×10，000）。2A 對照組：細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整2B 模型組：細(xì)胞內(nèi)大量空泡結(jié)構(gòu)；2C 青蒿琥酯低濃度組：細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集；2D 青蒿琥酯高濃度組：細(xì)胞核形態(tài)相對規(guī)整大鼠視網(wǎng)膜組織病理改變

CAT：對照組與模型組CAT 活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.133，P=0.000），青蒿琥酯低、高濃度組CAT 活性與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tALG=30.229，P=0.000；tAHG=13.914，P=0.000）。

MDA：對照組與模型組MDA 含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.580，P=0.000），青蒿琥酯低、高濃度組MDA 含量與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（tALG=6.119，P=0.000；tAHG=11.639，P=0.000）（表1）。

表1 各組SD 鼠視網(wǎng)膜組織SOD、CAT 活性及MDA 含量（，n=12)

表1 各組SD 鼠視網(wǎng)膜組織SOD、CAT 活性及MDA 含量（，n=12)

注：* 與對照組比較，P<0.05；# 與模型組比較，P<0.05

2.4 Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達(dá)水平比較

Caspase-3：對照組與模型組的Caspase-3 蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.947，P=0.000）。青蒿琥酯低濃度組與模型組的Caspase-3 蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.630，P=0.000）；青蒿琥酯高濃度組與模型組Caspase-3 蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.752，P=0.000）。

Caspase-9：對照組與模型組的Caspase-9 蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=28.271，P=0.000）；青蒿琥酯低濃度組Caspase-9 蛋白與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.320，P=0.000）；青蒿琥酯高濃度組Caspase-9 蛋白與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.426，P=0.000）（表2、圖3）。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3、Caspase-9 蛋白檢測結(jié)果（，n=12)

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3、Caspase-9 蛋白檢測結(jié)果（，n=12)

注：* 與對照組比較，P<0.05；# 與模型組比較，P<0.05

圖3 Western blot 檢測各組視網(wǎng)膜組織中Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達(dá)。3A 對照組；3B 模型組；3C 青蒿琥酯低濃度組；3D青蒿琥酯高濃度組

3 討論

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷引起視網(wǎng)膜組織能量代謝等失衡，氧供應(yīng)不足導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織血液供應(yīng)降低，最終引起神經(jīng)細(xì)胞不可逆損傷[5]。中西醫(yī)結(jié)合治療對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷有較好效果[6]。中藥具有來源廣泛、價格低廉、副作用少的特點(diǎn)，其中青蒿琥酯是青蒿素的一種衍生物，主要來源于植物黃花蒿的葉子。通過抗氧化作用可以抑制多種疾病的發(fā)生，是天然抗氧化劑，該藥對視網(wǎng)膜保護(hù)作用引起了研究者的廣泛關(guān)注[7]。研究證實，青蒿琥酯對糖尿病視網(wǎng)膜病變具有一定的治療作用[8]。李鐵英[9]通過建立1 型糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可以減少糖尿病視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)大鼠視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞保護(hù)因子熱休克蛋白27 和抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)。

本研究采用升高眼壓法制備大鼠缺血再灌注視網(wǎng)膜損傷動物模型，模擬臨床視網(wǎng)膜缺血再灌注發(fā)生機(jī)制，進(jìn)一步探討青蒿琥酯對缺血再灌注大鼠視網(wǎng)膜組織的保護(hù)作用。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，青蒿琥酯干預(yù)后能明顯改善視網(wǎng)膜內(nèi)核層及外核層細(xì)胞形態(tài)，改善視網(wǎng)膜病理損傷。在視網(wǎng)膜缺血再灌注過程中，可出現(xiàn)能量代謝失衡，抗氧化物酶表達(dá)代謝異常。SOD、CAT 和MDA 是氧化應(yīng)激的標(biāo)志性物質(zhì)，SOD 活性與CAT 水平及MDA 含量是相輔相成的。其中，SOD可以消除組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，CAT 能夠抑制膜磷脂過氧化，MDA 的含量是反映細(xì)胞膜過氧化作用強(qiáng)弱的一個指標(biāo)。視網(wǎng)膜組織缺血時引起氧自由基升高，抑制了消除自由基的酶活性，使氧自由基濃度進(jìn)一步升高，加重視網(wǎng)膜損傷[10-11]。本實驗中，青蒿琥酯低、高濃度組SOD 和CAT 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低，提示青蒿琥酯能夠改善視網(wǎng)膜損傷的氧化應(yīng)激狀態(tài)。細(xì)胞凋亡具有復(fù)雜的分子生物學(xué)特征，凋亡過程中清除了異常細(xì)胞，保證了生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，為促進(jìn)系統(tǒng)發(fā)育發(fā)揮作用。Caspase 家族包括一系列在介導(dǎo)細(xì)胞炎癥、應(yīng)激和凋亡過程中起關(guān)鍵作用的酶。本研究顯示，青蒿琥酯治療組可降低缺血視網(wǎng)膜組織Caspase-3、Caspase-9 蛋白的表達(dá)，提示青蒿琥酯過抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜組織作用。

綜上所述，青蒿琥酯對視網(wǎng)膜組織具有一定的保護(hù)作用，除了保護(hù)視網(wǎng)膜形態(tài)（細(xì)胞形態(tài)及視網(wǎng)膜厚度）外，還可以通過抑制Caspase-3、Caspase-9表達(dá)降低SD 大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。