miR-486-3p通過(guò)直接靶向BIK調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲①

馮 莉 劉 妍 荊 麗 韓 晶 張 雪 劉義冰（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，石家莊 050011）

近年我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，位居惡性腫瘤第3，經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率更高［1-2］。隨治療手段改善，系統(tǒng)的規(guī)范化診療使結(jié)直腸癌患者死亡率明顯下降，但仍有約50%患者在結(jié)直腸癌根治術(shù)后不久發(fā)生延期肝轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確，一般認(rèn)為其惡性生物學(xué)行為是涉及多基因、多步驟的調(diào)控過(guò)程［3-4］。細(xì)胞凋亡通路障礙是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中最重要的分子事件，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為腫瘤治療的思路之一。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Bcl-2相互作用殺傷蛋白（Bcl-2 inter?acting killer，BIK）是其中一種重要的促凋亡蛋白，作為BH3家族促凋亡蛋白的創(chuàng)始成員，通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。BIK可結(jié)合的Bcl-2家族凋亡抑制蛋白最多，且與Bcl-2及Mcl-1的結(jié)合力最強(qiáng)［6］。隨死亡信號(hào)刺激，BIK磷酸化后可與凋亡抑制蛋白相互作用，自主表達(dá)時(shí)強(qiáng)效殺傷細(xì)胞，提示BIK可能是細(xì)胞和病毒抗凋亡蛋白的重要靶點(diǎn)。miRNA是一類由19～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA，可與mRNA互補(bǔ)片段結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解或抑制其翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞增殖分化及凋亡調(diào)節(jié)、影響細(xì)胞自我更新、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作用［7］。miR-486-3p是新發(fā)現(xiàn)的miRNA，目前在結(jié)直腸癌中的研究較少，miR-486-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的調(diào)控作用是否與BIK相關(guān)鮮有報(bào)道。本文研究miR-486-3p表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的調(diào)控作用并探討其作用機(jī)制，從分子機(jī)制水平為結(jié)直腸癌治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620和正常結(jié)腸細(xì)胞系NCM-460購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心。

1.1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰酶、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Gibco公司；miR-486-3p模擬物（miR-486-3p mimics）、miR-486-3p抑制劑（miR-486-3p inhibitor）和陰性對(duì)照（NC）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自美國(guó)Agilent公司；雙熒光素酶試驗(yàn)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Pro?mega公司；BIK siRNA、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗由美國(guó)Santa Cruz公司合成和化學(xué)修飾；MTT試劑、細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）一抗、半胱天冬酶-9（Caspase-9）一抗、半胱天冬酶-3（Caspase-3）一抗、GAPDH一抗、RIPA裂解液和BCA蛋白分析試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司；結(jié)晶紫購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Annexin VFITC/PI試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司；PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本TaKaRa公司；BIK一抗、APAF1一抗、p-Erk1/2一抗、Erk1/2一抗購(gòu)自美國(guó)Abam公司；Su?per SignalTM化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.1.3 主要儀器-80℃冰箱購(gòu)自日本SANYO公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Precision公司；Syner?gyTM2酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；5430R型低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；FACSAria flow流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；凝膠掃描分析系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)Syngene公司；Step One PlusTMrealtime PCR System購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；Western blot電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、ChemiDoc成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR和Western blot檢測(cè)SW620細(xì)胞和NCM-460細(xì)胞miR-486-3p和BIK表達(dá) 從液氮中取出凍存細(xì)胞株，迅速?gòu)?fù)蘇后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，采用DMEM培養(yǎng)（含10%胎牛血清）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用0.25%胰酶進(jìn)行消化、傳代，取第3～4代對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用RT-PCR測(cè)定SW620細(xì)胞和NCM-460細(xì) 胞miR-486-3p和BIK mRNA表達(dá)，Western blot法測(cè)定SW620細(xì)胞和NCM-460細(xì)胞BIK蛋白表達(dá)。

1.2.2 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn) 從人cDNA中擴(kuò)增BIK 3'-UTR序列，將BIK的野生型和突變3'-UTR區(qū)域克隆至pGL3 XbaⅠ位點(diǎn)，采用定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?duì)BIK 3'-UTR中的miR-486-3p靶位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)定向突變。在轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于24孔板培養(yǎng)14～16 h，3'-UTR質(zhì)粒在SW620細(xì)胞中采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24 h采用雙熒光素酶試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行報(bào)告試驗(yàn)，將相對(duì)Renilla熒光素酶活性歸一化為螢火蟲(chóng)熒光素酶活性作為轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參。

1.2.3 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將SW620細(xì)胞分為陰性對(duì)照組（NC）、miR-486-3p mimics組、miR-486-3p in?hibitor組和BIK siRNA組，各組SW620細(xì)胞采用Li?pofectamine2000分別轉(zhuǎn)染生理鹽水、miR-486-3p mimics、miR-486-3p inhibitor和BIK siRNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，1.0×105個(gè)/孔接種于6孔板，采用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，20μl/孔加入MTT溶液（5 mg/ml）培養(yǎng)4 h，棄上清，150μl/孔加入DMSO，振蕩15 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度（A）。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，1.0×105個(gè)/孔接種于6孔板，DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿單層，20μl移液槍頭沿培養(yǎng)板底部垂直劃線，PBS沖洗3次去除細(xì)胞碎片，更換DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)12 h，拍照，測(cè)量劃痕間距。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，1.0×105個(gè)/ml加入Transwell小室上室，放入含DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）的細(xì)胞培養(yǎng)板孔（下室），37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，采用棉簽將上室內(nèi)非遷移細(xì)胞刮除，小室底部遷移細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.2%結(jié)晶紫染色，雙蒸水沖洗上室，相差顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.7 流失細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，更換為DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37℃、5%CO2培養(yǎng)至48 h，PBS洗滌2次，3 000 r/min離心2 min，去上清，預(yù)冷結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入An?nexin V-FITC/PI混勻，4℃避光培養(yǎng)15 min，加入10μl PI（4μg/ml，含RNA酶），避光室溫孵育15 min，F(xiàn)ACSAria流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件分析。

1.2.8 q-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，更換為DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37℃、5% CO2培養(yǎng)至48 h，Trizol試劑提取總RNA，異丙醇法濃縮RNA，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA純度，控制A260/A280為1.9～2.1，RNA電泳檢測(cè)完整性。檢測(cè)濃度及純度后取2μg總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min，85℃5 s。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA純化后采用Step One PlusTMreal-time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為20μl：1.5μl cDNA模板，1μl引物，10μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，7.5μl H2O。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，擴(kuò)增循環(huán)95℃5 s，60℃34 s，共40個(gè) 循 環(huán)。以GAPDH為 內(nèi) 參，2-ΔΔCt法 計(jì) 算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，更換為含10μmol/ml Flu的RPMI1640培養(yǎng)液37℃、5%CO2培養(yǎng)至48 h，收獲各組細(xì)胞，RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞，離心，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性后按20μg/孔進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳（90 V 30 min，120 V 1 h），濕轉(zhuǎn)至PVDF膜（400 mA 2 h），5%BSA封閉1 h，TBST緩沖液洗膜，分別加入BIK、APAF1、p-Erk1/2、Erk1/2、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3和GAPDH一抗后4℃過(guò)夜，TBST緩沖液充分洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液充分洗膜30 min，SuperSignalTM化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，顯影，測(cè)定各組細(xì)胞目標(biāo)蛋白表達(dá)，與β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prer軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單向ANOVA分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常結(jié)直腸細(xì)胞miR-486-3p和BIK表達(dá) 結(jié)直腸癌細(xì)胞miR-486-3p表達(dá)水平較正常結(jié)直腸細(xì)胞（NCM-460）顯著增加（圖1A），BIK mRNA和蛋白水平均較正常結(jié)直腸細(xì)胞顯著降低（圖1B～D），提示miR-486-3p表達(dá)上調(diào)可能與結(jié)直腸癌細(xì)胞BIK表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

圖1 結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常結(jié)直腸細(xì)胞miR-486-3p和BIK表達(dá)Fig.1 miR-486-3p and BIK expressions in colorectal can-cer cells and normal colorectal cells

2.2 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn) 采用Targetscan和miR?Walk進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，BIK的3'-UTR存在與miR-486-3p種子序列匹配的區(qū)域（圖2A）。雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)顯示，miR-486-3p顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞BIK 3'-UTR熒光素酶活性（P＜0.05），但不降低BIK 3'-UTR的突變序列（圖2B），表明BIK 3'-UTR是miR-486-3p的直接靶標(biāo)。轉(zhuǎn)染miR-486-3p抑制劑導(dǎo)致BIK mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高，而轉(zhuǎn)染miR-486-3p模擬導(dǎo)致BIK mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（圖2C、D），與轉(zhuǎn)染BIK siRNA結(jié)果一致。

圖2 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Dual luciferase reporter test

2.3 miR-486-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組24 h、48 h和72 h結(jié)腸癌細(xì)胞光密度顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組顯著增加（P＜0.05或P＜0.01，圖3），提示miR-486-3p在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮致癌基因作用。

圖3 miR-486-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of miR-486-3p on proliferation of colorectal cancer cells

2.4 miR-486-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組細(xì)胞劃痕寬度顯著增加（P＜0.01），而miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組細(xì)胞劃痕寬度顯著降低（P＜0.05，圖4），提示miR-486-3p可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。

圖4 miR-486-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的影響Fig.4 Effect of miR-486-3p on migration of colorectal cancer cells

2.5 miR-486-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01），而miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05，圖5），提示miR-486-3p可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移。

圖5 miR-486-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲的影響Fig.5 Effect of miR-486-3p on invasion of colorectal can-cer cells

2.6 miR-486-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.01），而miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.01，圖6），提示miR-486-3p可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

圖6 miR-486-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of miR-486-3p on apoptosis of colorectal can-cer cells

2.7 miR-486-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組Cyt C、APAF1、Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加，p-Erk1/2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；miR-486-3p模擬組和BIK siRNA組Cyt C、APAF1、Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；4組細(xì)胞Erk1/2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖7），提示miR-486-3p可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮致癌基因作用。

圖7 miR-486-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of miR-486-3p on expressions of mitochon-drial apoptosis pathway proteins in colorectal can-cer cells

3 討論

全球每年結(jié)腸癌平均新發(fā)病例超過(guò)120萬(wàn)例，病死率約50%［8］。外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展及化療藥物的應(yīng)用使結(jié)直腸癌療效顯著提高，但其發(fā)病率仍位居惡性腫瘤第3，僅次于肺癌和乳腺癌，是腫瘤相關(guān)死亡的第4大病因。我國(guó)近年結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢(shì)，2015年我國(guó)結(jié)直腸癌預(yù)測(cè)發(fā)病率、死亡率分別為376.3/10萬(wàn)、191.0/10萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人們生命健康［2］。手術(shù)治療在結(jié)直腸癌治療中占據(jù)主要地位，但多數(shù)患者仍會(huì)出現(xiàn)局部或全身轉(zhuǎn)移，并對(duì)傳統(tǒng)化療方案耐藥［9］。最新研究表明，術(shù)前放化療根治性手術(shù)是治療局部進(jìn)展性結(jié)直腸癌的有效方法，但仍有約40%患者療效較差［10］。

miRNA是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的內(nèi)源性非編碼小RNA，參與機(jī)體多種生理過(guò)程調(diào)控，如生長(zhǎng)發(fā)育、造血功能、細(xì)胞增殖與凋亡、器官形成、脂肪代謝等，目前人類有10%～30%基因受miRNA調(diào)節(jié)，miRNA可發(fā)揮原癌基因作用，也可發(fā)揮抑癌基因作用［11］。miRNAs可有效沉默靶基因并參與一系列基因調(diào)節(jié)過(guò)程，有利于癌癥作為一種異質(zhì)性疾病治療［12］。miR-519b是一類包括miR-519a、miR-519b和miR-519c 3個(gè)miRNA的家族，目前關(guān)于miR-519b的研究鮮有報(bào)道。乳頭狀甲狀腺癌組織中miR-486-3p表達(dá)顯著升高［13］；而在喉癌組織中miR-519b-3p表達(dá)明顯低于癌旁組織，且miR-519b-3p類似物可顯著抑制喉部生長(zhǎng)鱗狀Hep-2細(xì)胞增殖［14］。YE等［15］研究發(fā)現(xiàn)，miR-486-3p可直接靶向ECM1而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。研究顯示，miR-519b-3p表達(dá)與局部進(jìn)展性結(jié)直腸癌患者對(duì)術(shù)前放化療根治性手術(shù)的反應(yīng)性相關(guān)，miR-519b-3p在對(duì)術(shù)前放化療根治性手術(shù)樣品相應(yīng)的標(biāo)本中呈高表達(dá)，miR-519b-3p以ARID4B依賴的方式直接參與直腸癌患者對(duì)術(shù)前放化療根治性手術(shù)的反應(yīng)［16］。本研究顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620 miR-486-3p表達(dá)較正常結(jié)直腸細(xì)胞NCM-460顯著增加（P＜0.05），miR-486-3p抑制劑組細(xì)胞增殖、增殖、凋亡、遷移和侵襲均較正常對(duì)照組顯著降低，而miR-486-3p模擬劑組細(xì)胞增殖、增殖、凋亡、遷移和侵襲均較正常對(duì)照組顯著增加，提示miR-486-3p是結(jié)直腸癌的致癌基因。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的自主性有序性死亡，維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育，凋亡失衡可能導(dǎo)致腫瘤及神經(jīng)退行性疾病。線粒體是細(xì)胞凋亡的主要發(fā)起者和執(zhí)行者，主要由Bcl-2家族成員調(diào)節(jié)。Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，由促凋亡和抗凋亡成員組成，其共同特點(diǎn)是均含有BH3結(jié)構(gòu)域。BIK是一種僅含有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，其活性受Thr33和Thr35磷酸化程度調(diào)節(jié)。伴隨死亡信號(hào)刺激，BIK磷酸化后可與抗凋亡蛋白結(jié)合，促使其他促凋亡蛋白直接激活Bax，Bax移位至線粒體并形成同源二聚體通道，促進(jìn)Cyt C釋放，導(dǎo)致Caspase蛋白激活和細(xì)胞凋亡［6］。3'-UTR克隆可用于miRNA靶標(biāo)驗(yàn)證、預(yù)測(cè)靶標(biāo)功能驗(yàn)證和miR?NA對(duì)靶標(biāo)調(diào)控作用的研究。miRNA通過(guò)靶向mRNA 3'-UTR導(dǎo)致mRNA降解或抑制其翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá)［17］。BIK 3′-UTR包含與miR-486-3p種子序列匹配的區(qū)域，雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)顯示miR-486-3p顯著降低結(jié)直腸癌細(xì)胞中BIK 3′-UTR熒光素酶活性，但不降低BIK 3′-UTR突變序列，表明BIK 3′-UTR是miR-486-3p的直接靶標(biāo)。miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組細(xì)胞增殖、增殖、凋亡、遷移和侵襲較正常對(duì)照組顯著增加，進(jìn)一步說(shuō)明miR-486-3p通過(guò)BIK直接發(fā)揮對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、增殖、凋亡、遷移和侵襲的調(diào)節(jié)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中存在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失調(diào)和細(xì)胞死亡基因調(diào)控異常，線粒體凋亡通路是細(xì)胞凋亡最重要和研究最為深入的途徑之一，細(xì)胞受凋亡刺激后Cyt C從線粒體內(nèi)釋出是線粒體步入凋亡途徑的標(biāo)志。Cyt C釋放至胞漿導(dǎo)致APAF1活化，誘導(dǎo)凋亡的半胱天冬酶活化［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-486-3p表達(dá)上調(diào)可顯著抑制Cyt C、APAF1、Caspase-9和Caspase-3表達(dá)，增加p-ERK1/2表達(dá)，揭示miR-486-3p調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的分子機(jī)制。