人乳腺珠蛋白熒光免疫層析檢測(cè)方法的建立①

崔云會(huì) 陳 楠 王云龍 明 亮 李玉林 王繼創(chuàng)

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450052）

乳腺癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1］。生物標(biāo)記物的使用已經(jīng)成為幫助乳腺癌診斷以及確定預(yù)后、預(yù)測(cè)治療反應(yīng)和治療后監(jiān)測(cè)的一種方法，非侵入性的生物標(biāo)記物，如血清學(xué)分子，與其他類型的生物標(biāo)記物相比，檢測(cè)更方便［2-3］。人乳腺珠蛋白（human mamma?globin，hMAM）是子宮珠蛋白基因家族中的一個(gè)乳腺特異性成員，編碼定位于染色體11q13上的10kDa糖蛋白［4］。hMAM在乳腺上皮細(xì)胞中低表達(dá)，在乳腺癌中高表達(dá)，已被證明與腫瘤早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］。且有研究表明，血液中的hMAM可作為乳腺癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，并且已成為乳腺癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的最特異的標(biāo)志物之一［6］。本研究以鑭系稀土元素Eu3+羧基熒光微球作為標(biāo)記物，建立hMAM時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)方法，為乳腺癌診斷和治療監(jiān)測(cè)提供一種快捷、準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料SCGB2A2單克隆抗體購(gòu)自Abnova公司，Eu3+羧基熒光微球購(gòu)自Bangs公司，羊抗鼠IgG、hMAM多抗、hMAM室內(nèi)參考品均由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，PVC板購(gòu)自上海良信公司，硝酸纖維素膜（NC膜）購(gòu)自Sartorius公司，玻璃纖維棉購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司，Human mam?maglobin ELISA試劑盒購(gòu)自Cusabio公司，臨床樣本由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，其他化學(xué)試劑均為分析純。免疫熒光定量檢測(cè)儀購(gòu)自杭州峰航科技有限公司，XYZ三維點(diǎn)膜噴金儀、微電腦自動(dòng)斬切機(jī)購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司，超微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo fisher公司，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司，納米粒度電位儀購(gòu)自Malvern公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫微球制備 采用EDC（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺）和NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）化學(xué)偶聯(lián)的方法活化微球，取50μl熒光微球加入1 ml 20 mmol/L MES溶液，漩渦振蕩混勻后，加入20μl EDC溶液（10 mg/ml）和200μl NHS溶液（20 mg/ml）作為活化劑混勻后，低速搖床振蕩活化1 h；15 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 ml0 mmol/L MES，沉淀用500μl MES（20 mmol/L）旋起，超聲分散；再加入10μg hMAM標(biāo)記抗體，偶聯(lián)2 h；15 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 ml封閉液，超聲后搖床振蕩2 h；加入微球保護(hù)液500μl復(fù)溶沉淀，超聲后備用，并用粒度儀檢測(cè)偶聯(lián)抗體后的標(biāo)記微球與純凈微球粒徑大小均一性。

1.2.2 試紙條構(gòu)建 用XYZ三維點(diǎn)膜噴金儀將1.0 mg/ml的hMAM包被抗體、2.0 mg/ml羊 抗 鼠IgG以1μl/cm的量包被于NC膜上，分別作為檢測(cè)線T線、質(zhì)控C線，并于37℃干燥2 h。將1.2.1制備好的微球混勻后，按8μl/cm均勻噴在微球墊上，置于37℃干燥2 h；依次將樣品墊、微球墊、包被有T線、C線的NC膜和吸水紙組裝在PVC板上，用自動(dòng)斬切機(jī)裁成3.9 cm寬的試紙條。

1.2.3 試紙條檢測(cè) 在樣品墊上滴加70μl樣品，10 min后放置于免疫熒光定量檢測(cè)儀上檢測(cè)，通過(guò)T線、C線熒光強(qiáng)度分析樣品中的hMAM濃度。

1.2.4 工藝條件優(yōu)化 在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)的MES緩沖液量、熒光微球量、超聲功率、超聲時(shí)間，選擇20 mmol/L MES緩沖液量為500、1 000、1 500μl，微球量為40、50、60μl，超聲功率為60、80、100 W，超聲時(shí)間0.5、1、2 min，按照1.2.1、1.2.2的工藝流程制備試紙條。

1.2.5 分析性能評(píng)價(jià)

1.2.5.1 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 取濃度為0.312、0.625、1.25、2.5、5、10、20 ng/ml的hMAM線性標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)檢測(cè)3次，以hMAM濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的T/C均值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 精密性 隨機(jī)抽取3批試紙條，分別檢測(cè)低、中、高值的hMAM樣本，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定10次，分析3個(gè)批次批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV）。

1.2.5.3 準(zhǔn)確度 用基質(zhì)血清將20 ng/ml的hMAM室內(nèi)質(zhì)控品稀釋成預(yù)測(cè)濃度為3、10、17 ng/ml樣品，采用本方法制備的hMAM免疫層析試紙條檢測(cè)，分別計(jì)算其回收率，回收率=（實(shí)測(cè)濃度/預(yù)測(cè)濃度）×100%。

1.2.5.4 特異性 將CEA（20 ng/ml）與CA153（50 U/ml）分別與濃度為15 ng/ml的hMAM室內(nèi)質(zhì)控品等體積混合后，重復(fù)檢測(cè)10次。

1.3 方法學(xué)比對(duì) 應(yīng)用本研究建立的hMAM熒光免疫層析試紙條與CUSABIO公司Human Mamma?globin ELISA試劑盒平行檢測(cè)46例乳腺癌樣本的外周血中hMAM的含量，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫微球制備 采用熒光層析工藝進(jìn)行微球與抗體偶聯(lián)，偶聯(lián)微球與純凈微球粒徑檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：均為單一峰，且偶聯(lián)前后粒子分布均一性較好（PDI＜0.20），說(shuō)明采用本實(shí)驗(yàn)方法偶聯(lián)微球效果較好。

圖1 標(biāo)記微球與純凈微球粒徑強(qiáng)度與體積分布Fig.1 Particle size intensity and volume distribution of la-beled microspheres and pure microspheres

2.2 工藝條件優(yōu)化 四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：由極差分析可得，最優(yōu)組合為MES緩沖液量1 000μl、微球50μl、超聲功率100 W、超聲時(shí)間1 min。

表1 四因素三水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Four-factor three-level experimental results

2.3 分析性能評(píng)價(jià)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 本實(shí)驗(yàn)建立的熒光層析方法檢測(cè)結(jié)果如圖2所示：y=0.177x+0.097，R2=0.992 3。線性范圍為0.312～20 ng/ml。

圖2 熒光免疫層析法檢測(cè)人乳腺珠蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of mammoglobin detection by fluo-rescence chromatography

2.3.2 精密性 采用本方法制備的試紙條檢測(cè)濃度分別為3、10、17 ng/ml的樣品，批內(nèi)變異系數(shù)分別為7.65%、8.74%、8.97%，均小于10%；批間變異系數(shù)分別為11.72%、9.43%、12.95%，均小于15%，精密性符合要求。

2.3.3 準(zhǔn)確度 采用本研究制備的熒光層析試紙條檢測(cè)高、中、低值回收率結(jié)果如表2所示，低、中、高值回收率分別為101.7%、101.2%、104.9%，均符合回收率85%～115%的要求。

表2 回收率檢測(cè)結(jié)果（±s）Tab.2 Four-factor three-level experimental results（±s）

表2 回收率檢測(cè)結(jié)果（±s）Tab.2 Four-factor three-level experimental results（±s）

Sample Recovery rate（%）Low value Median value High value Predicted concentration（ng/ml）3 10 17 Detection concentration（ng/ml）3.05±0.14 10.12±0.30 17.83±0.97 101.7 101.2 104.9

2.3.4 特異性 特異性檢測(cè)結(jié)果如表3所示，與乳腺癌常見(jiàn)的血清標(biāo)志物無(wú)明顯交叉反應(yīng)，表明試紙條特異性較好。

表3 特異性檢測(cè)結(jié)果（±s，ng/ml）Tab.3 Specificity for hMAM detection（±s，ng/ml）

表3 特異性檢測(cè)結(jié)果（±s，ng/ml）Tab.3 Specificity for hMAM detection（±s，ng/ml）

Cross-reaction substances CEA（20 ng/ml）CA153（50 U/ml）Theoretical concentration 15 15 Measured concentration 14.69±0.85 14.82±1.18

2.4 方法學(xué)比對(duì) 如圖3所示，2種方法檢測(cè)血清中hMAM的相關(guān)方程為y=1.036x-0.079，R2=0.982 2，表明兩種方法相關(guān)性較好。

圖3 熒光免疫層析法與ELISA法的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between fluorescence

3 討論

乳腺癌是一種腫瘤細(xì)胞可以在早期擴(kuò)散到血液和淋巴系統(tǒng)的全身性疾病，由于血液樣本相對(duì)容易獲得，對(duì)腫瘤的早期且準(zhǔn)確的非侵入性檢測(cè)成為患者治療和預(yù)后的重要因素［7］。對(duì)于乳腺癌，CA15-3和CEA是常見(jiàn)的標(biāo)志物，但缺乏敏感性和特異性，且很少在嚴(yán)重疾病中升高。雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長(zhǎng)因子受體2在臨床上是最有用的預(yù)后和治療指標(biāo)，但對(duì)診斷和進(jìn)展無(wú)顯著意義［8］。一種高靈敏度、高特異性的生物標(biāo)志物對(duì)乳腺癌的正確診斷和預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要［9］。hMAM是一種乳腺上皮細(xì)胞相關(guān)糖蛋白，在93%的乳腺癌中表達(dá)，血液中hMAM可在很早的階段被檢測(cè)到，且在早期乳腺癌中表達(dá)量最高［10-12］。有研究表明外周血中hMAM陽(yáng)性與乳腺癌的診斷、監(jiān)測(cè)治療和臨床預(yù)后存在顯著相關(guān)性［13］。故建立hMAM快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)疾病診斷治療具有重要意義。目前血清hMAM含量的檢測(cè)主要有RT-PCR、ELISA等方法，RT-PCR檢測(cè)靈敏性較高，但mRNA容易降解，操作較為復(fù)雜，而ELISA分析時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，不適合快速檢測(cè)［14-16］。熒光免疫層析法由于具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［17］。

本研究建立了一種銪螯合熒光納米微球免疫層析方法，采用時(shí)間分辨熒光技術(shù)利用波長(zhǎng)和時(shí)間2個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，有效地排除非特異熒光的干擾，與傳統(tǒng)的快速檢測(cè)技術(shù)相比，該方法具有靈敏度高、定量檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。此外，本研究通過(guò)對(duì)熒光微球偶聯(lián)工藝的優(yōu)化，使得微球抗體偶聯(lián)較均一、熒光信號(hào)強(qiáng)、精密性、準(zhǔn)確性均較好，與ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)46例臨床樣本，相關(guān)性較好。綜上所述，本研究建立的hMAM熒光免疫層析檢測(cè)方法定量準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷，可為基層醫(yī)院提供一種乳腺癌診斷和預(yù)后的輔助檢測(cè)手段，適合臨床推廣應(yīng)用。