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    TLR2、IL-10 mRNA的表達(dá)及樹突狀細(xì)胞分布在外陰硬化性苔蘚中的臨床意義①

    2021-05-27 11:06:26王楠楠劉嗣同中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科沈陽(yáng)110000
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2021年8期
    關(guān)鍵詞:樹突陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)展

    王楠楠 王 婧 劉嗣同 武 昕(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科,沈陽(yáng) 110000)

    外陰硬化性苔蘚(vulvar sclerosing lichen,VLS)是婦科常見的一種慢性難治性疾病,表現(xiàn)為女性外陰瘙癢、皮膚色素脫失、萎縮,嚴(yán)重者出現(xiàn)尿道口和陰道口狹窄,惡變率為2%~4%[1]。目前病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚,可能與自身免疫、感染、性激素和遺傳有關(guān),也沒有較好的治療方法。因此,探討VLS發(fā)病機(jī)制是臨床上亟待解決的問題。因其真皮內(nèi)可見大量的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn),故多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它是一種與自身免疫有關(guān)的疾病[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)VLS中促炎因子干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α和白介素-1,2等明顯增多,而抗炎因子研究較少(IL-10)在VLS中表達(dá)情況尚未見報(bào)道[2-3]。Toll樣受體(TLR)是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁,TLR廣泛分布于多種細(xì)胞表面,其中TLR-2表達(dá)范圍最廣,TLR-2主要存在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面,TLR-2通過影響T輔助細(xì)胞1(T helper cell1,Th1)和T輔助細(xì)胞2(T helper cell 2,Th2)的平衡,引起IFN-γ分泌降低,IL-10分泌相對(duì)升高,來抑制免疫反應(yīng)[4-5]。前期本課題組檢測(cè)到淋巴細(xì)胞CD4、CD8在VLS中真皮層明顯增多,而樹突狀細(xì)胞在VLS形成和發(fā)展作用如何?TLR2和IL-10是否表達(dá)異常,與病變關(guān)系如何?目前尚不清楚,因此,本研究探討TLR2、IL-10 mRNA和樹突狀細(xì)胞在VLS病變形成中作用。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    1.1.1 一般資料 選取2016至2018年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科手術(shù)或活檢的VLS標(biāo)本50例(早期和進(jìn)展期各25例),外陰正常皮膚(源于外陰整形手術(shù)切除的正常組織)15例。部分福爾馬林溶液固定用于免疫組化實(shí)驗(yàn);部分新鮮標(biāo)本-80℃保存,用于PCR實(shí)驗(yàn)。所有標(biāo)本診斷均經(jīng)2位病理醫(yī)生證實(shí)。本研究已通過中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

    1.1.2 主要試劑 鼠抗人CD1α單克隆抗體、通用S-P超敏試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司);miRNeasy Mini Kit試劑盒(德國(guó)Qiagen公司);β-actin、IL-10、TLR2引物(美國(guó)Invitrogen公司);A5001反轉(zhuǎn)錄試劑盒及A6001 Real Time PCR試劑盒(美國(guó)Pro?mega公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 免疫組化檢測(cè)4μm石蠟切片,脫蠟至水,枸櫞酸緩沖液熱抗原修復(fù),采用免疫組織化學(xué)S-P法對(duì)CD1α細(xì)胞進(jìn)行染色。滴加過氧化物酶阻斷溶液(試劑A)室溫下孵育10 min,正常非免疫動(dòng)物血清(試劑B)室溫下孵育20 min,再加一抗(CD1α單抗1∶100),37℃孵育1 h,生物素標(biāo)記的二抗(試劑C)室溫下孵育30 min,鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)室溫下孵育30 min,DAB呈色后蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。切片脫水后封片保存。

    1.2.2 PCR檢測(cè)

    1.2.2.1 總RNA的提取 使用miRneasy Mini Kit試劑盒抽提全部30例標(biāo)本組織RNA,操作按說明書進(jìn)行,RNA樣品保存于-80℃冰箱。

    1.2.2.2 RNA的逆轉(zhuǎn)錄 ①取一定量模板RNA加入引物。②模板RNA與引物的混合物,70℃、5 min預(yù)變性,完成后取出置于冰上。③配置RT-Mix,向每個(gè)樣品管加入10μl RT-Mix,見表1。④設(shè)置反轉(zhuǎn)錄程序,包括退火(25℃,5 min)、延伸(42℃,60 min)、逆轉(zhuǎn)錄酶失活(70℃,15 min)三步。程序完成后得到cDNA,并存于-20℃冰箱,(按照promega A5001試劑說明書操作)。

    表1 RT-Mix具體配置方法Tab.1 Specific configuration method of RT-Mix

    1.2.2.3 RT-PCR(按照promega A6001試劑說明書操作)①按表2配置PCR反應(yīng)混合液,并分至各反應(yīng)管,然后加入2μl模板。②反應(yīng)體系加入96孔板,加蓋光學(xué)封口膜,離心后放入ABI 7900HT熒光定量PCR儀,PCR反應(yīng)條件為:95℃2 min,95℃15 s,60℃60 s,40個(gè)循環(huán),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。③完成RTPCR后對(duì)其溶解曲線進(jìn)行分析,并結(jié)合瓊脂糖分析PCR產(chǎn)物是否特異。分析PCR反應(yīng)曲線,所得出的數(shù)據(jù)按2-ΔΔCT法計(jì)算出基因表達(dá)的相對(duì)量。本實(shí)驗(yàn)涉及的引物,β-actin由Invitrogen公司設(shè)計(jì),具體引物如下,見表3。

    表2 PCR反應(yīng)混合液具體配置方法Tab.2 Specific configuration method of PCR reaction mixture

    表3 引物列表Tab.3 List of primers

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CD1α陽(yáng)性細(xì)胞在VLS中的表達(dá)CD1α陽(yáng)性細(xì)胞光鏡下:在正常皮膚中平均(14.0±5.8)個(gè),在早期VLS中平均(18.4±7.7)個(gè),兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異(P>0.05)。在進(jìn)展期VLS中平均(28.6±3.2)個(gè),與正常相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖1。

    表4 CD1α陽(yáng)性細(xì)胞在VLS中的表達(dá)(±s)Tab.4 Expression of CD1αpositive cells in VLS(±s)

    表4 CD1α陽(yáng)性細(xì)胞在VLS中的表達(dá)(±s)Tab.4 Expression of CD1αpositive cells in VLS(±s)

    Note:Compared with healthy vulvar skin,1)P<0.05.

    Number 14.0±5.8 18.4±7.7 28.6±3.21)Groups Healthy vulvar skin Early VLS Advanced VLS n 15 25 25

    圖1 CD1α陽(yáng)性細(xì)胞在VLS中的表達(dá)Fig.1 Expression of CD1α-positive cells in VLS

    2.2 TLR2、IL-10 mRNA在VLS中的表達(dá)TLR2的mRNA表達(dá)量在早期VLS為1.34±1.27,與正常皮膚(1.65±0.84)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異(P>0.05)。但在進(jìn)展期為3.97±0.79,與正常相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(P<0.05)。IL-10的mRNA表達(dá)量在早期VLS中為1.09±0.89,與正常皮膚(1.08±0.36)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異(P>0.05)。在進(jìn)展期VLS為2.93±1.04,與正常相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(P<0.05,見表5)。

    表5 TLR2和IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(±s)Tab.5 Relative expressions levels of TLR2 and IL-10 mRNA(±s)

    表5 TLR2和IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(±s)Tab.5 Relative expressions levels of TLR2 and IL-10 mRNA(±s)

    Note:Compared with healthy vulvar skin,1)P<0.05.

    IL-10 1.08±0.36 1.09±0.89 2.93±1.041)Groups Healthy vulvar skin Early VLS Advanced VLS TLR2 1.65±0.84 1.34±1.27 3.97±0.79

    3 討論

    目前病理學(xué)上將VLS分為兩種類型:早期和進(jìn)展期。早期可見棘層輕度不規(guī)則的增厚,真皮淺層水腫,大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),無明顯的均質(zhì)帶;進(jìn)展期可見表皮角質(zhì)層增厚,棘層細(xì)胞減少,基底細(xì)胞液化,真皮淺層膠原纖維變性形成均質(zhì)帶,其下伴有大量的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)[6]。兩種病理改變是否存在一個(gè)演變的過程,形成機(jī)制是否相同,尚不清楚。TLR屬于廣泛模式識(shí)別受體,是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁。TLR廣泛分布于多種細(xì)胞表面,但主要表達(dá)于和宿主防御功能有關(guān)的細(xì)胞,如單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。TLR識(shí)別內(nèi)外源性配體后可激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生,調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答[7]。TLR中TLR2表達(dá)范圍最廣,其胞外段可識(shí)別病原危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(PAMPS/DAMPS)分子。通過跨膜結(jié)構(gòu)將信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),經(jīng)由髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴信號(hào)傳導(dǎo)途徑和MyD88非依賴信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生復(fù)雜的級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)導(dǎo)致核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)等轉(zhuǎn)錄因子活化,介導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌,參與免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)后天免疫功能的啟動(dòng)。TLR2通過影響Th1和Th2的平衡,引起INFγ分泌的降低,IL-10分泌的相對(duì)升高,來抑制免疫反應(yīng)[4]。激活TLR-2可以促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生TLR-2依賴的IL-10,并促進(jìn)Treg細(xì)胞生成[8]。文獻(xiàn)報(bào)道TLR2/TLR1異質(zhì)二聚體是CD4+T細(xì)胞上的一種協(xié)同調(diào)控受體,在本課題組前期實(shí)驗(yàn)中已檢測(cè)出CD45RO+T細(xì)胞(記憶性CD4+T細(xì)胞)在VLS中表達(dá)增加,且進(jìn)展期增加更明顯[7]。提示增多的CD4+T細(xì)胞表面的TLR2可能也增加,導(dǎo)致IL-10分泌增多。本研究的結(jié)果顯示VLS早期TLR2和IL-10 mRNA表達(dá)略增加,與正常外陰皮膚相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異;而進(jìn)展期TLR2和IL-10 mRNA表達(dá)明顯高于正常,有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異。提示進(jìn)展期TLR2和IL-10 mRNA增加與CD4+T細(xì)胞增加有一定相關(guān)性。樹突狀細(xì)胞是皮膚中一種抗原提呈細(xì)胞,是啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié),可通過TLR-2通路被激活,從而釋放一些細(xì)胞因子如IL-10和TGF-β等?;罨臉渫粻罴?xì)胞極化Th0細(xì)胞至Treg細(xì)胞,顯示樹突狀細(xì)胞中TLR-2依賴的免疫調(diào)節(jié)功能[9]。本研究發(fā)現(xiàn)CD1α標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞在VLS中表達(dá)增加,早期沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異,進(jìn)展期增加明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與TLR2和IL-10 mRNA在VLS中表達(dá)增加呈正相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)進(jìn)展期TLR2和IL-10 mRNA增加與樹突狀細(xì)胞增多有一定的相關(guān)性。還有文獻(xiàn)報(bào)道:TLR2與巨噬細(xì)胞的結(jié)合被發(fā)現(xiàn)可以介導(dǎo)IL-10的產(chǎn)生[9]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)中還檢測(cè)到VLS中CD68+細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)增多,進(jìn)展期增加更明顯,與早期相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異[8]。本研究中TLR2和IL-10 mRNA在進(jìn)展期也增高,進(jìn)一步提示TLR2和IL-10 mRNA增加與巨噬細(xì)胞增多有一定相關(guān)性。綜上所述,在VLS進(jìn)展期CD4淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增加,可能促使其表面活化的TLR2增多,因此,以上細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10增加。IL-10是體內(nèi)重要的炎癥反應(yīng)抑制因子,通過下調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子及單核巨噬細(xì)胞上MHCⅡ類分子的表達(dá),控制炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度及抑制免疫反應(yīng)[10-11]。IL-10是CD4+CD25+Treg細(xì)胞的重要免疫調(diào)節(jié)因子,誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞增多,抑制免疫反應(yīng),在VLS的早期IL-10無明顯增加,而進(jìn)展期IL-10明顯增多,與TLR2及其相關(guān)細(xì)胞增多有相關(guān)性[12]。進(jìn)一步提示在VLS進(jìn)展期存在免疫抑制現(xiàn)象。

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