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    血清KL-6、DD及CRP在ANCA相關(guān)性血管炎合并間質(zhì)性肺病檢測(cè)中的臨床價(jià)值①

    2021-05-27 11:06:26譚立明盧曉霞黃家翌宮陽(yáng)陽(yáng)張皓承劉宇晗余建林
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2021年8期
    關(guān)鍵詞:南昌大學(xué)試劑意義

    譚立明 盧曉霞 張 倩 黃家翌 宮陽(yáng)陽(yáng) 張皓承 劉宇晗 余建林

    (南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院,南昌 330006)

    抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎(antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis,ANCA-associated vasculitis,AAV)是一類以血清AN?CA檢測(cè)陽(yáng)性和中小型血管炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病,主要包括顯微鏡下多血管炎、肉芽腫性多血管炎和嗜酸性肉芽腫性多血管炎三種類型,主要影響腎、肺和其他器官[1-2]。最新研究表明AAV患者的標(biāo)準(zhǔn)化死亡率是健康人的2.7倍[3]。AAV合并間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease,ILD)在臨床上較為常見,診斷方法主要為病史分析、臨床檢查、影像學(xué)分析和ANCA檢測(cè),但由于檢查存在不良反應(yīng)或費(fèi)用較高等,不易被一般患者所接受。研究表明,血清Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面抗原(krebs von den-lun?gen-6,KL-6)在結(jié)締組織病(connective tissue dis?ease,CTD)合并ILD中高表達(dá),可以反映ILD的活動(dòng)程度[4];D-二聚體(D-dimer,DD)為凝血指標(biāo),在活動(dòng)期的AAV中高表達(dá),且與ILD的發(fā)生密切相關(guān)[5-6];C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)為炎癥指標(biāo),與AAV的活動(dòng)性相關(guān)。本研究選取南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院45例AAV-ILD患者、42例AAV患者和40例健康體檢者作為研究對(duì)象,旨在探究血清KL-6、DD及CRP檢測(cè)對(duì)AAV-ILD的診斷價(jià)值。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    1.1.1 研究對(duì)象 選取南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2015年5月至2019年7月確診的45例AAV-ILD患者,42例AAV患者,40例健康體檢者。AAV的診斷符合2012年美國(guó)Chapel Hill Consensus Conference關(guān)于ANCA相關(guān)性血管炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];ILD確診條件:①臨床表現(xiàn)有漸進(jìn)性氣促、干咳、活動(dòng)性呼吸困難,肺部聽診有散在或彌漫的濕啰音;②肺功能檢查表現(xiàn)出不同程度的彌散量減少及限制性通氣功能障礙;③肺部高分辨率CT(high-resolution CT,HRCT)有下列影像學(xué)變化,如肺內(nèi)呈現(xiàn)不規(guī)則線條網(wǎng)格樣改變、雙下肺外側(cè)出現(xiàn)蜂窩影、小葉間隔增厚、磨玻璃影等多種表現(xiàn)。研究對(duì)象均知情同意,并且本研究獲得南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)許可。

    1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①所有患者知情并同意本研究;②患者診斷明確,臨床資料詳實(shí);③所有健康體檢者的臨床表現(xiàn)、病理、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢查均無(wú)異常變化。

    1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①繼發(fā)性血管炎;②合并其他肺疾病,如:肺結(jié)核、肺部感染、支氣管擴(kuò)張及肺部腫瘤等;③合并其他自身免疫性疾??;④合并心、腦、肝、腎及血液系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病;⑤合并肝炎、艾滋病等傳染性疾??;⑥妊娠或哺乳期婦女。

    1.1.4 試劑和儀器

    1.1.4.1 KL-6的檢測(cè)試劑由日本積水醫(yī)療科技(中國(guó)北京)有限公司提供,儀器為AU5400全自動(dòng)生化分析儀。

    1.1.4.2 DD的檢測(cè)試劑由日本積水醫(yī)療科技(中國(guó)北京)有限公司提供,儀器為全自動(dòng)血凝分析儀Sysmex CS-5100。

    1.1.4.3 CRP的檢測(cè)由美國(guó)貝克曼公司提供的IM?MAGE 800型全自動(dòng)特定蛋白分析系統(tǒng)及配套試劑完成。

    1.1.4.4 ANCA的檢測(cè)試劑由德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份有限公司提供,EUPOStarⅢPlus熒光顯微鏡由德國(guó)EVROIMMUN公司提供。

    1.1.4.5 抗髓過氧化物酶抗體(MPO)和抗蛋白酶3抗體(PR3)的檢測(cè)試劑盒由歐根泰克診斷股份有限公司生產(chǎn),儀器為KHBST-360酶標(biāo)儀(上海科華生物工程股份有限公司)、PW-960全自動(dòng)洗板機(jī)[記憶科技(深圳)有限公司]。

    1.2 方法

    1.2.1 血樣采集 所有研究對(duì)象空腹采3.0 ml外周靜脈血2份,一份置于枸櫞酸鈉抗凝管中并搖晃均勻,2 500 r/min離心15 min,用于檢測(cè)DD濃度;一份置于非抗凝管中靜置30 min后,2 500 r/min離心15 min,用于檢測(cè)KL-6和CRP濃度及ANCA。

    1.2.2 KL-6的檢測(cè) 操作步驟:輸入樣品號(hào),輸入預(yù)先設(shè)置的項(xiàng)目組合號(hào),選擇檢測(cè)項(xiàng)目KL-6,輸入對(duì)應(yīng)樣品號(hào)所做的項(xiàng)目信息,將樣品架放入進(jìn)樣軌道,點(diǎn)擊開始。所有操作均嚴(yán)格遵循試劑說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2.3 DD的檢測(cè) 操作步驟:輸入樣本號(hào),選擇檢測(cè)項(xiàng)目DD,將樣品架放入進(jìn)樣軌道,點(diǎn)擊開始。所有操作均嚴(yán)格遵循試劑說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2.4 CRP的檢測(cè) 采用速率散射比濁法測(cè)定CRP,操作步驟:輸入樣本識(shí)別,確定架號(hào)和樣本號(hào),選擇檢測(cè)項(xiàng)目CRP及樣本類型,保存設(shè)置,點(diǎn)擊開始。以上所有操作均嚴(yán)格遵循試劑說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2.5 ANCA的檢測(cè)

    1.2.5.1 采用間接免疫熒光法測(cè)定ANCA操作步驟:將患者稀釋的血清與生物載片(反應(yīng)區(qū)內(nèi)固定有包被基質(zhì)的生物薄片)溫育30 min后進(jìn)行沖洗,再加入熒光素標(biāo)記的抗人抗體溫育30 min,沖洗后進(jìn)行封片,最后于顯微鏡下觀察熒光模型。實(shí)驗(yàn)中建立質(zhì)量控制,每分析批使用試劑盒中匹配的陰陽(yáng)性對(duì)照物進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)使用自制的弱陽(yáng)性質(zhì)控物進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.5.2 采用ELISA測(cè)定MPO和PR3操作步驟:將質(zhì)控品和稀釋的患者血清分別加入包被過氧化物酶和蛋白酶3的微孔板中,加速儀內(nèi)溫育15 min后洗液洗板3次,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗人IgG類抗體,加速儀內(nèi)溫育7.5 min,洗板5次,加底物后加速儀內(nèi)避光溫育7.5 min,加終止液,30 min之內(nèi)用450 nm波長(zhǎng)比色,計(jì)算結(jié)果。以上所有操作均嚴(yán)格遵循各試劑說明書及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),正態(tài)分布資料以±s表示,比較前采用Levene's Test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊性的兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),方差不齊的兩兩比較采用t'檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(n)或率(%)表示,比較用χ2檢驗(yàn);根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)繪制受試者工作特征(receiver operating characteris?tic,ROC)曲線,計(jì)算ROC曲線下面積(area under the curve,AUC),AUC在0.5~0.7有較低診斷準(zhǔn)確性,AUC在0.7~0.9有一定診斷準(zhǔn)確性,AUC>0.9有較高診斷準(zhǔn)確性,當(dāng)P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組一般資料比較AAV-ILD組年齡36~85歲,平均(63.29±14.37)歲,AAV組年齡20~88歲,平均(58.12±15.74)歲,健康對(duì)照組年齡18~85歲,平均(53.63±18.36)歲,3組的平均年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.775,P=0.066);AAV-ILD組男女比例為1∶0.55,AAV組男女比例為1∶1.1,健康對(duì)照組男女比例為1∶1,3組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.920,P=0.232),詳見表1。

    表1 各組患者臨床特征的比較Tab.1 Comparison of clinical features of patients in each group

    2.2 血清KL-6、DD及CRP檢測(cè)水平比較AAVILD組患者血清KL-6和CRP水平與AAV組和健康對(duì)照組比較,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);血清DD水平與AAV組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與健康對(duì)照組比較,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),詳見表2。

    表2 血清KL-6、DD及CRP檢測(cè)水平比較(±s)Tab.2 Comparison of serum KL-6,DD and CRP levels(±s)

    表2 血清KL-6、DD及CRP檢測(cè)水平比較(±s)Tab.2 Comparison of serum KL-6,DD and CRP levels(±s)

    Note:Compared with AAV and control group,1)P<0.01;compared with AAV,2)P<0.05;compared with control group,3)P<0.01.

    n Groups AAV-ILD AAV Control CRP(mg/L)78.01±37.721)51.41±28.943)6.90±3.39 45 42 40 KL-6(U/ml)715.95±265.991)266.48±101.14 251.11±98.14 DD(μg/ml)4.88±3.032)3.61±2.133)0.30±0.13

    2.3 血清ANCA檢測(cè)結(jié)果比較AAV-ILD和AAV組的p-ANCA、c-ANCA陽(yáng)性率均大于健康對(duì)照組,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);AAV-ILD和AAV組內(nèi),p-ANCA陽(yáng)性率均大于c-ANCA陽(yáng)性率,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),詳見表3。

    表3 血清ANCA檢測(cè)結(jié)果比較[例(%)]Tab.3 Comparison of test results of serum ANCA[n(%)]

    2.4 血清KL-6、DD及CRP的診斷效能KL-6的靈敏度和特異度都很高;DD的靈敏度最高,但特異度很低;CRP的靈敏度較高,特異度一般,詳見表4。

    表4 血清KL-6、DD及CRP的診斷效能比較Tab.4 Comparison of diagnostic efficacy of serum KL-6,DD and CRP

    2.5 血清KL-6、DD及CRP的ROC曲線分析 根據(jù)3組患者血清KL-6、DD及CRP水平計(jì)算出ROC曲線參數(shù),繪制ROC曲線,其中KL-6對(duì)AAV-ILD的診斷價(jià)值最高,詳見表5和圖1。

    表5 標(biāo)志物的ROC曲線參數(shù)Tab.5 Parameters of biomarker′s ROC curves

    2.6 各血清標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè) 將檢測(cè)指標(biāo)聯(lián)合,進(jìn)行串并聯(lián)分析,計(jì)算聯(lián)合后診斷AAV-ILD的敏感度和特異度。串聯(lián)檢測(cè)可顯著提高診斷特異度,其中KL-6+DD+CRP串聯(lián)時(shí)最高,為0.995;并聯(lián)檢測(cè)可顯著提高診斷敏感度,其中KL-6+DD+CRP并聯(lián)時(shí)最高,為0.999。所以聯(lián)合檢測(cè)對(duì)AAV-ILD診斷意義更大,詳見表6。

    圖1 血清KL-6、DD及CRP的ROC曲線Fig.1 ROC curves of serum KL-6,DD and CRP

    表6 各血清標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)(%)Tab.6 Joint detection of serum markers(%)

    3 討論

    AAV是一種嚴(yán)重的自身免疫性疾病,主要影響中小型血管且常累及其他器官。AAV的臨床表現(xiàn)多種多樣,從最初的皮疹可發(fā)展到多系統(tǒng)疾病,往往導(dǎo)致診斷上的明顯延遲[8]。ILD是AAV常見的并發(fā)癥之一,合并ILD的AAV患者病死率較高,早期診斷對(duì)于治療和預(yù)后有重要意義。目前,HRCT是AAV-ILD診斷的重要手段,但難以做到早期診斷和檢測(cè)病情的變化。因此,尋找診斷價(jià)值高的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)尤為重要。

    KL-6是日本人KOHNO等[9]于1985年發(fā)現(xiàn)并命名的高分子量(200 kD)糖蛋白,由MUC1基因編碼,主要在Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面表達(dá),肺泡上皮細(xì)胞受破壞后會(huì)導(dǎo)致血清中KL-6的水平升高,因此KL-6可鑒別診斷各種慢性肺纖維化和肺泡蛋白沉積,目前已有研究報(bào)道KL-6為診斷ILD、評(píng)估病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的一種有效的生物標(biāo)志物[10-14];DD來源于纖溶性交聯(lián)纖維蛋白凝塊,主要用于排除肺動(dòng)脈栓塞和輔助診斷急性主動(dòng)脈夾層,其含量在AAV的活動(dòng)期患者中顯著高于緩解期,對(duì)AAV-ILD患者的診斷價(jià)值研究尚少[15-16];CRP是全身性炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物,可反映AAV的病情活動(dòng)程度,在大部分AAVILD患者中顯著升高,但屬非特異性指標(biāo),其對(duì)AAV-ILD的診斷價(jià)值少有研究。

    本研究發(fā)現(xiàn),AAV-ILD組血清KL-6水平明顯高于AAV組和健康對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),AAV組KL-6水平和健康對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與YASUNORI IWATA等[17]的研究結(jié)果相似,說明AAV-ILD患者血清中KL-6水平的升高與AAV無(wú)關(guān),而是由并發(fā)的ILD造成。本研究還發(fā)現(xiàn)AAV-ILD組血清DD及CRP水平高于AAV組和健康對(duì)照組,且AAV組高于健康對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以上研究結(jié)果提示KL-6、DD及CRP可作為輔助診斷AAV-ILD的血清學(xué)指標(biāo),經(jīng)分析得出三者單獨(dú)檢測(cè)時(shí)的診斷效能,發(fā)現(xiàn)KL-6的敏感度為0.844,特異度為0.963,具有最大的診斷價(jià)值;DD和CRP的靈敏度均較高,但特異度比較低,DD的特異度僅為0.524,表明二者單獨(dú)檢測(cè)時(shí)診斷價(jià)值不大。

    ANCAs是一組針對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿成分的抗體,是診斷AAV的重要血清學(xué)指標(biāo),主要分為核周型(p-ANCA)和胞質(zhì)型(c-ANCA)。本研究中,AAV-ILD組的ANCA陽(yáng)性率顯著高于健康對(duì)照組,與AAV組ANCA陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明AAV并發(fā)ILD對(duì)ANCA結(jié)果沒有顯著影響,同時(shí)也提示ANCA不是輔助診斷AAV-ILD的血清學(xué)指標(biāo)。此外,AAV-ILD和AAV組內(nèi)p-ANCA陽(yáng)性率均高于c-ANCA,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),這與NISHKANTHA ARULKUMARAN等[18]的研究結(jié)果相似,說明AAV并發(fā)ILD之后對(duì)ANCA的陽(yáng)性類別沒有顯著影響。

    通過比較血清KL-6、DD及CRP單獨(dú)檢測(cè)時(shí)ROC曲線下面積,發(fā)現(xiàn)KL-6的曲線下面積最大,為0.932,說明其具有很高的診斷價(jià)值,這是因?yàn)镵L-6主要在Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面表達(dá),當(dāng)肺組織受到損傷時(shí),血清中KL-6水平升高,而AAV組和健康對(duì)照組的肺組織并未受到損傷,血清KL-6水平基本不會(huì)升高[19]。聯(lián)合檢測(cè)時(shí),KL-6+DD+CRP串聯(lián)檢測(cè)的特異度最高,為0.995;并聯(lián)檢測(cè)的靈敏度最高,為0.999,表明聯(lián)合檢測(cè)的輔助診斷價(jià)值明顯優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)。此外,KL-6+DD和KL-6+CRP串聯(lián)檢測(cè)的特異度較高,KL-6+DD、KL-6+CRP和DD+CRP并聯(lián)檢測(cè)時(shí)的靈敏度均較高,因此在臨床工作中,需要根據(jù)具體情況選擇合適的檢測(cè)方法。

    綜上所述,血清KL-6、DD及CRP這3項(xiàng)指標(biāo)在AAV-ILD患者中高表達(dá),單獨(dú)檢測(cè)KL-6具有較高的診斷價(jià)值,三者聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高AAV-ILD輔助診斷的診斷效能、靈敏度和特異度,具有較大的臨床價(jià)值。

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