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    血漿miR-150及miR-200在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的表達(dá)及其臨床意義

    2021-05-27 11:06:28黃娟娟三亞中心醫(yī)院檢驗(yàn)科三亞572000
    中國免疫學(xué)雜志 2021年8期
    關(guān)鍵詞:活動度血漿引物

    肖 華 卓 芬 黃娟娟(三亞中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,三亞 572000)

    系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種多發(fā)于青年女性的自身免疫介導(dǎo)的經(jīng)典的結(jié)締組織病,累及皮膚、漿膜、關(guān)節(jié)、腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等,可導(dǎo)致患者多系統(tǒng)損害[1]。傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),如抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體,補(bǔ)體C3、C4、血沉(ESR)及C反應(yīng)蛋白(CRP)等,靈敏度和特異度不高,且其檢測結(jié)果影響因素較多,尚不能成為診斷SLE的最佳標(biāo)志物。因而,尋找能夠在SLE患者體內(nèi)特異表達(dá)的生物標(biāo)志物,對SLE的輔助診斷及病情評估尤為重要。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一類長度在21~25 nt的非編碼RNA,通過促進(jìn)細(xì)胞活化、分化、凋亡、代謝及信號傳導(dǎo)等機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和炎癥反應(yīng)狀態(tài),從而在SLE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-150及miR-200通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化與信號傳導(dǎo)等過程,參與自身免疫疾病的病理生理過程,可能作為潛在的生物標(biāo)志物[4-5]。本研究通過檢測SLE患者 血漿miR-150及miR-200表 達(dá) 水平,分析miR-150及miR-200對SLE的診斷價值,旨在為SLE的診斷及靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    1.1.1 一般資料 選取2017年1月1日至2019年6月30日海南省第三人民醫(yī)院收治的SLE患者120例,其中男性18例,女性102例,年齡19~64歲,平均(36.20±8.74)歲。采用SLE病情活動指數(shù)(sys?temic lupus erythematosus disease activity index,SLE?DAI)評分評估疾病活動度,其中低活動組56例(SLEDAI評分<9分),高活動組64例(SLEDAI評分≥9分)。納入標(biāo)準(zhǔn):①SLE的診斷參考美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology,ACR)2009年修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn);②臨床試驗(yàn)室資料完整,能配合本次研究者。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并急性或慢性炎癥疾病、急性腎損傷、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重心、腦、腎等原發(fā)性疾病及其他自身免疫性疾病者;②近1個月內(nèi)服用過免疫抑制劑、激素及妊娠、哺乳期婦女。另選取50例健康志愿者作為對照組,其中男性11例,女性39例,年齡18~63歲,平均(35.70±9.28)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn),并與患者或家屬簽署知情同意書。

    1.1.2 主要試劑與儀器RNA提取試劑盒購自美國Ambio公司;ELISA檢測試劑購自上??菩律锛夹g(shù)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)引物由廣東銳博公司合成。miR-150引物:正向引物5'-ACAGTCGTCATCAGTGT?GCT-3',反向引物5'-GAGTCTAGGGTCGTAGAC-3';miR-200引物:正向引物5'-GTCAGCTAACTGACT?GCTCG-3',反向引物5'-ATGTACACTGAATAGTCG-3';U6:正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 RT-PCR檢測 所有研究對象均抽取空腹靜脈血3 ml置于EDTA抗凝管,離心分離血漿,-80℃低溫冰箱保存待測。試劑盒提取RNA,實(shí)時熒光定量PCR(real time PCR,RT-PCR)檢測。以U6為內(nèi)參,miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:5μl RNA模板,3μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物,0.15μl 100 mmol/L的脫氧核糖核苷酸(dNTPs),1.00μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μl),1.50μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液,0.19μl RNase抑制劑(20 U/μl),4.16μl無菌三蒸水。PCR總反應(yīng)體系為15μl,反應(yīng)條件:16℃30 min、42℃30 min、85℃5min。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參,反應(yīng)體系為20μl:1μl引物及探針Mix(20×),10μl TaqMan通用混合物溶液(2×),1.33μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA,7.67μl無核酸酶水。擴(kuò)增條件為:95℃10 min 1個循環(huán),95℃15 s、60℃60 s進(jìn)行45個循環(huán),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每個反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-150及miR-200表達(dá)水平,其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)檢查ELISA法檢測抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體含量,ESR使用魏氏法,血沉架手工檢測;血清白蛋白(ALB)、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4及CRP水平在貝克曼全自動生化分析儀上檢測,操作過程均嚴(yán)格按照儀器及配套試劑說明書進(jìn)行。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料以±s表示,多組間均數(shù)比較采用方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線分析血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平對SLE的診斷價值,曲線下面積(area under curve,AUC)的比較采用Z檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較SLE組、高活動組和低活動組抗dsDNA抗體、ESR及CRP水平均明顯高于對照組(P<0.05),且高活動組SLEDAI評分、抗dsDNA抗體水平均明顯高于低活動組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SLE組、高活動組和低活動組C3、C4及ALB水平均明顯低于對照組(P<0.05),且高活動組ALB水平明顯低于低活動組(P<0.05);而高活動組和低活動組ESR、C3、C4及CRP水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)各組間性別、年齡及體質(zhì)指數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    表1 各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較(±s)Tab.1 Comparison of general data and laboratory indexes of each group(±s)

    表1 各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較(±s)Tab.1 Comparison of general data and laboratory indexes of each group(±s)

    Note:Compared with control group,1)P<0.01;compared with low activity group,2)P<0.01.

    CRP(mg/L)3.25±1.06 10.72±4.281)13.90±5.271)12.62±4.511)3.850 0.020 Groups n Control Low activity High activity SLE 50 56 64 120 F P Male/female 11/39 7/49 11/53 18/102 0.352 0.518 Age(years)35.70±9.28 35.84±8.36 36.50±9.13 36.20±8.74 0.728 0.436 SLEDAI score-7.40±1.90 13.25±4.361)2)10.62±3.24 9.714<0.01 Anti dsDNA antibody(U/ml)33.75±5.84 240.36±57.201)308.42±71.601)2)280.74±63.501)10.260<0.001 ESR(mm/h)8.40±2.70 38.64±9.151)42.35±11.731)40.72±9.831)3.586 0.037 C3(g/L)1.16±0.35 0.68±0.241)0.63±0.211)0.65±0.201)4.217 0.012 C4(g/L)0.38±0.14 0.19±0.101)0.16±0.071)0.17±0.081)3.815 0.024 ALB(g/L)48.26±7.93 34.60±6.451)26.84±5.711)2)30.17±5.831)6.193<0.001

    2.2 各組血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平比較SLE組、高活動組和低活動組血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平均明顯低于對照組(P<0.01),且高活動組血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平明顯低于低活動組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

    表2 各組血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平比較(±s)Tab.2 Comparison of expression levels of miR-150 and miR-200 in each group(±s)

    表2 各組血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平比較(±s)Tab.2 Comparison of expression levels of miR-150 and miR-200 in each group(±s)

    Note:Compared with control group,1)P<0.01;compared with low ac?tivity group,2)P<0.01.

    miR-200 2.27±0.56 1.34±0.201)0.52±0.061)2)0.91±0.181)11.825<0.01 Groups Control Low activity High activity SLE n 50 56 64 120 F P miR-150 1.73±0.38 0.81±0.151)0.22±0.031)2)0.48±0.051)14.713<0.01

    2.3 血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平對SLE的診斷價值 血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平診斷SLE的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.54、0.97、195.40 U/ml,三項(xiàng)聯(lián)合診斷SLE的曲線下面積明顯高于單項(xiàng)miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.215,4.903、5.174,P<0.05),其敏感度和特異度為92.5%和86.3%。見表3和圖1。

    表3 血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平對SLE的診斷價值Tab.3 Diagnostic value of plasma miR-150,miR-200 and anti dsDNA antibody levels in SLE

    圖1 血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平診斷SLE的ROC曲線Fig.1 ROC curve of diagnosing SLE with plasma miR-150,miR-200 and anti dsDNA antibody levels

    2.4 血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析顯示,SLE患者血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平與SLEDAI評分、抗dsDNA抗體水平均呈負(fù)相關(guān)(P<0.001),而血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平與C3、C4、ALB及CRP水平均無明顯相關(guān)(P>0.05)。見表4。

    表4 血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.4 Analysis of the correlation between the expression level of miR-150 and miR-200 in plasma and labo-ratory indexes

    3 討論

    miRNA是近年來廣受關(guān)注的重要的基因表達(dá)調(diào)控因子,在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。SLE的免疫發(fā)病機(jī)制與B細(xì)胞過度激活和特異性自身抗體產(chǎn)生有關(guān),而miRNA的表達(dá)水平與外周B細(xì)胞分布改變有關(guān),其通過對免疫細(xì)胞分化與信號傳導(dǎo)等過程調(diào)節(jié)激活B細(xì)胞表達(dá),從而參與SLE的發(fā)生發(fā)展[6]。在SLE患者中,某些miRNA異常表達(dá)導(dǎo)致其調(diào)節(jié)的多個靶蛋白異常累積,導(dǎo)致活化信號的級聯(lián)放大,從而參與SLE的發(fā)病過程,改變SLE患者體內(nèi)miRNA表達(dá)水平可作為潛在的治療手段[7]。miR-150分布于B、T細(xì)胞,目標(biāo)基因是轉(zhuǎn)錄因子c-myb,功能是抑制B、T細(xì)胞的活性和增生,在B細(xì)胞中,miR-150導(dǎo)致c-myb水平降低,并阻止B細(xì)胞成熟,在SLE患者中表達(dá)下降,與SLE活動度呈負(fù)相關(guān)[8]。miR-200作為轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子,能夠調(diào)控細(xì)胞活動各個階段,從分裂到增生到凋亡,可通過影響DNA甲基化及TLR信號通道等多個環(huán)節(jié)調(diào)控各種免疫細(xì)胞亞群分化及功能,在SLE的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。

    本研究顯示,SLE組、高活動組和低活動組抗dsDNA抗體水平均明顯高于對照組,且高活動組SLEDAI評分、抗dsDNA抗體水平均明顯高于低活動組,而SLE組、高活動組和低活動組血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平均明顯低于對照組,且高活動組血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平明顯低于低活動組。提示miR-150及miR-200在SLE患者中異常低表達(dá),且與SLE活動度相關(guān),其水平降低可能預(yù)示疾病活動度較高。相關(guān)分析也顯示,SLE患者血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平與SLEDAI評分呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步提示血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平與SLE患者病情惡化有關(guān),可能作為監(jiān)測SLE患者病情的參考指標(biāo)。REKVIG等[10]研究顯示,抗ds?DNA抗體在SLE患者中高表達(dá),其對診斷SLE有一定的價值,與SLE的活動度相關(guān),并可作為SLE療效評估的參考指標(biāo)。WANG等[11]研究發(fā)現(xiàn),SLE患者miR-200水平明顯低于健康對照組,與SLEDAI評分呈負(fù)相關(guān),可能參與SLE的發(fā)病機(jī)制,未來有望作為SLE的生物標(biāo)志物。本研究應(yīng)用ROC曲線分析,血漿miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體水平診斷SLE的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.54、0.97、195.40 U/ml,三項(xiàng)聯(lián)合診斷SLE的曲線下面積最大,其敏感度和特異度較好。說明miR-150、miR-200及抗dsDNA抗體三項(xiàng)聯(lián)合檢測有助于提高診斷SLE的準(zhǔn)確性。相關(guān)分析也顯示,SLE患者血漿miR-150、miR-200表達(dá)水平與抗dsDNA抗體水平呈負(fù)相關(guān),進(jìn)一步提示三項(xiàng)聯(lián)合檢測對診斷SLE具有較高的臨床價值。NAKHJAVANI等[12]研究顯示,與健康對照組相比,狼瘡性腎炎患者血漿miR-150表達(dá)水平顯著降低,參與了腎纖維化的發(fā)生,可能作為診斷狼瘡性腎炎的潛在生物標(biāo)志物。ZHANG等[13]研究發(fā)現(xiàn),與健康對照組相比,狼瘡性腎炎患者血漿miR-200表達(dá)水平降低,與SLEDAI評分呈負(fù)相關(guān),且miR-200表達(dá)升高是預(yù)測狼瘡性腎炎發(fā)病的獨(dú)立保護(hù)因子,可作為狼瘡性腎炎診斷的新型標(biāo)志物。LI等[14]研究認(rèn)為,SLE患者血清miR-203水平明顯降低,與抗dsD?NA抗體和SLEDAI評分相關(guān),對SLE的鑒別診斷和判斷疾病活動度有一定價值。另有研究表明,SLE患者血漿miR-92a表達(dá)水平下調(diào)可能與其發(fā)病和病情進(jìn)展相關(guān),可以作為SLE臨床診斷的新型生物學(xué)指標(biāo)[15]。

    綜上所述,SLE患者血漿miR-150及miR-200表達(dá)水平明顯降低,且與SLE病情活動度相關(guān),聯(lián)合抗dsDNA抗體檢測對SLE診斷具有一定價值,同時也為了解SLE的發(fā)病機(jī)制提供了新的見解。但這些研究仍處于初步探索階段,今后尚需更多研究進(jìn)一步證實(shí)miR-150及miR-200在SLE中的臨床應(yīng)用價值,使其為臨床提供更豐富的SLE診療體系。

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