腫瘤壞死因子-α誘導蛋白8樣分子-2通過NF-κB信號通路影響LPS誘導的支氣管上皮細胞分泌炎癥因子①

穆亞敏 宋志勇 劉啟明 黃 希（湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術學院，湘潭 410004）

急性肺損傷是臨床上常見的危重疾病，其分子發(fā)生機制十分復雜，目前仍然缺乏有效的防治手段［1］。研究表明，急性肺損傷的發(fā)生與炎癥反應有關［2］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭氏陰性菌細胞外膜的主要成分，其可以引起支氣管上皮細胞釋放炎癥因子，從而促進炎癥反應，誘導肺組織損傷發(fā)生，因此，研究LPS條件下支氣管上皮細胞炎癥發(fā)生的分子機制是目前醫(yī)學工作者研究的熱點［3］。腫瘤壞死因子-α誘導蛋白8樣分子-2（tu?mor necrosis factor-αinduced protein 8 like 2，TIPE2）具有免疫負調控作用，在淋巴結等免疫器官以及炎癥組織中廣泛表達，能夠維持免疫穩(wěn)定［4］。TIPE2具有抗炎作用，其可以有效抑制動脈粥樣硬化炎癥產生，后續(xù)在腦缺血再灌注、心衰等疾病中同樣證實TIPE2具有抑制炎癥浸潤的功效［5-6］。在類風濕性關節(jié)炎中的研究顯示，TIPE2低表達可以激活NF-κB信號從而促進疾病進展［7］。文獻報道表明，TIPE2在哮喘支氣管上皮細胞炎癥介質釋放中發(fā)揮抑制作用［8］。本次實驗探討TIPE2在LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥反應中的作用和機制，以期為闡明急性肺損傷炎癥損傷機制和基因治療急性肺損傷提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細胞系（16HBE）購自上海美軒生物科技有限公司；LPS購自美國Sigma公司；IL-8含量檢測試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰荆籘IPE2過表達載體由云舟生物科技（廣州）有限公司構建；PCR試劑購自大連TaKaRa公司；IL-1β含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；Trizol試劑購自美國Thermo Fisher公 司；Lipo?fectamine 2000購自美國Invitrogen公司；IL-6含量檢測試劑盒購自深圳市金準生物醫(yī)學工程有限公司；NF-κBp65抗體、p-ⅠκBαSer32抗體、TIPE2抗體購自美國Abcam公司；細胞核蛋白提取試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS對支氣管上皮細胞中TIPE2表達影響檢測 支氣管上皮細胞分別用0和25μg/ml的LPS細胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)，分別記為Normal和LPS組，細胞培養(yǎng)刺激12 h后，收集細胞用下述RT-PCR和Western blot方法檢測TIPE2表達變化。RT-PCR：收集細胞，以Trizol試劑常規(guī)方法提取總RNA，用紫外分光光度計測定RNA樣品在260 nm和280 nm吸光度的比值，比值在1.8～2.0之間可用于后續(xù)實驗。取1μl的RNA，添加1μl 10 mmol/L的dNTP和1μl oligo（dT）primer，以無菌水補足12μl，在65℃下反應5 min，然后冰浴10 min；再添加4μl 5×Reaction Buffer、2μl DTT、1μl RNA酶抑制劑，在37℃反應2 min，添加1μl的M-MLV RTase，37℃孵育50 min，70℃保溫15 min，將制備的cDNA保存在-20℃。RT-PCR方法定量檢測TIPE2 mRNA表達。以β-ac?tin作為內參，引物序列為：TIPE2上游5′-TCAGAAACATCCAAGGCCAGAC-3′，下游5′-CG?GACCGACCAGCCATTTTAC-3′；β-actin上 游5′-TGCGTGACATCAAAGAGAAG-3′，下游5′-TCCATACCCAAGAAGGAAGG-3′。RT-PCR體系為：上下游引物各0.5μl、12.5μl的SYBR Premix Ex TaqTM、1μl的cDNA，添加ddH2O至25μl，在PCR儀上反應，反應程序為：95℃孵育30 s，95℃孵育5 s，60℃孵育20 s，循環(huán)40次。結果用2-ΔΔCtCt法計算。

Western blot：收集細胞，用冰冷的PBS反復漂洗細胞3次，然后在細胞中添加蛋白抽提試劑，置于冰上裂解30 min，4℃12 000 r/min離心10 min，收集蛋白上清溶液。采用BCA方法測定蛋白濃度，步驟同試劑盒說明書。配制8%的SDS-PAGE凝膠。取蛋白樣品，添加5×上樣緩沖液混合，100℃煮沸5 min，加樣，每孔添加50μg蛋白樣品。采用8 V/cm電壓觀察染料到達分離膠邊緣后，調整電壓為15 V/cm繼續(xù)電泳，染料進入到凝膠底部1 cm時，將電壓關閉。在4℃條件下轉膜，轉膜條件為110 mA恒流。取出NC膜，在4℃條件下封閉過夜，封閉液用5%的BSA。用TBST洗滌3次，將NC膜放在TIPE2一抗（1：600）中，在37℃反應2 h。繼續(xù)以TBST洗滌3次，把NC膜放在以1：3 000稀釋后的辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG中，室溫孵育2 h。采用ECL方法顯色，步驟同ECL顯色試劑盒說明書。Image J分析條帶的吸光度值，內參用β-actin，分析TIPE2蛋白表達變化。

1.2.2 細胞轉染及過表達效果檢測 收集人支氣管上皮細胞，用Lipofectamine2000分別把TIPE2過表達載體（pcDNA3.1-TIPE2）和對照載體（pcDNA3.1）轉染到細胞中，步驟完全按照轉染試劑說明書操作，并且把轉染后的支氣管上皮細胞用25μg/ml的LPS細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別命名為LPS+TIPE2和LPS+vector組。細胞培養(yǎng)12 h后，用RT-PCR和Western blot方法檢測TIPE2表達變化，步驟同1.2.1。

1.2.3 細胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β水平檢測 收集培養(yǎng)12 h后的Normal、LPS、LPS+vector、LPS+TIPE2組細胞培養(yǎng)液上清，用ELISA方法檢測IL-6、IL-8、IL-1β含量，步驟均參照試劑盒說明書。

1.2.4 細胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白表達檢測 收集培養(yǎng)12 h后的Normal、LPS、LPS+vector、LPS+TIPE2組細胞，用Western blot方法檢測細胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白表達情況，步驟同1.2.1。同時提取培養(yǎng)12 h后的Normal、LPS、LPS+vector、LPS+TIPE2組細胞核蛋白，蛋白提取步驟參照細胞核蛋白提取試劑盒，用Western blot方法檢測NF-κBp65蛋白表達。

1.2.5 NF-κB信號激活劑對過表達TIPE2影響支氣管上皮細胞分泌炎癥因子的作用 取1.2.2轉染TIPE2過表達載體后的支氣管上皮細胞，用含有1μmol/L的NF-κB激活劑PMA和25μg/ml的LPS細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為LPS+TIPE2+PMA組，設置LPS+TIPE2組作為參照，培養(yǎng)12 h后，用ELISA方法測定上清中IL-6、IL-8、IL-1β含量，Western blot方法測定細胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白表達情況，步驟均同1.2.1。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件分析所得實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均用±s表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較均采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LPS對支氣管上皮細胞TIPE2、IL-6、IL-8、IL-1β、NF-κBp65、p-ⅠκBα影響LPS處理后的支氣管上皮細胞中TIPE2 mRNA以及蛋白水平均下降，IL-6、IL-8、IL-1β分泌水平升高，細胞核NF-κBp65蛋白表達增加（圖1，表1）。

圖1 Western blot方法測定LPS處理后支氣管上皮細胞中TIPE2、NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達Fig.1 Western blot analysis of expression of TIPE2，NFκBp65，p-ⅠκBαSer 32protein in LPS treated bronchi-al epithelial cells

表1 LPS處理對支氣管上皮細胞中TIPE2 mRNA、蛋白表達、分泌IL-6、IL-8、IL-1β和細胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達影響（±s，pg/ml）Tab.1 Effects of LPS treatment on the expression of TIPE2 mRNA，protein，secretion of IL-6，IL-8，IL-1β，NF-κBp65and p-ⅠκBαSer 32 protein expression in bronchial epithelial cells（±s，pg/ml）

表1 LPS處理對支氣管上皮細胞中TIPE2 mRNA、蛋白表達、分泌IL-6、IL-8、IL-1β和細胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達影響（±s，pg/ml）Tab.1 Effects of LPS treatment on the expression of TIPE2 mRNA，protein，secretion of IL-6，IL-8，IL-1β，NF-κBp65and p-ⅠκBαSer 32 protein expression in bronchial epithelial cells（±s，pg/ml）

Note：Compared with normal group，1）P＜0.05.

cell nucleus NF-κBp65 0.13±0.01 0.32±0.031）Groups TIPE2 mRNA TIPE2 protein IL-6 IL-8 IL-1β NF-κBp65 p-ⅠκBαSer 32 Normal LPS 1.00±0.11 0.36±0.021）0.62±0.03 0.21±0.041）145.24±12.02 384.61±32.841）12.35±1.21 72.91±6.171）76.58±6.32 357.16±33.271）0.24±0.03 0.55±0.061）0.20±0.02 0.57±0.041）

2.2 TIPE2過表達載體對LPS處理的支氣管上皮細胞TIPE2、IL-6、IL-8、IL-1β、NF-κBp65、p-ⅠκBα影響 在支氣管上皮細胞中轉染TIPE2過表達載體，細胞中TIPE2 mRNA以及蛋白水平均升高，IL-6、IL-8、IL-1β水平降低，細胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白表達表達減少，細胞核NF-κBp65蛋白表達增加（圖2，表2）。TIPE2過表達載體可明顯提高LPS條件下支氣管上皮細胞中TIPE2表達水平。

圖2 Western blot方法測定TIPE2過表達載體轉染后LPS條件下支氣管上皮細胞中TIPE2、NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達Fig.2 Western blot analysis of the expression of TIPE2，NF-κBp65，p-ⅠκBαSer 32 protein in bronchial epi-thelial cells under LPS condition after transfection with TIPE2 overexpression vector

表2 TIPE2過表達載體對LPS條件下支氣管上皮細胞中TIPE2 mRNA、蛋白表達、分泌IL-6、IL-8、IL-1β和細胞中NFκBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達影響（±s，pg/ml）Tab.2 Effect of TIPE2 over expression vector on the expression of TIPE2 mRNA，protein，secretion of IL-6，IL-8，IL-1β，NF-κBp65 and p-ⅠκBαSer 32 protein expression in bronchial epithelial cells under LPS condition（±s，pg/ml）

表2 TIPE2過表達載體對LPS條件下支氣管上皮細胞中TIPE2 mRNA、蛋白表達、分泌IL-6、IL-8、IL-1β和細胞中NFκBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達影響（±s，pg/ml）Tab.2 Effect of TIPE2 over expression vector on the expression of TIPE2 mRNA，protein，secretion of IL-6，IL-8，IL-1β，NF-κBp65 and p-ⅠκBαSer 32 protein expression in bronchial epithelial cells under LPS condition（±s，pg/ml）

Note：Compared with LPS+vector group，1）P＜0.05.

cell nucleus?NF-κBp65 0.49±0.06 0.63±0.041）Groups TIPE2 mRNA TIPE2 protein IL-6 IL-8 IL-1β NF-κBp65 p-ⅠκBαSer 32 LPS+vector LPS+TIPE2 1.00±0.11 2.35±0.211）0.24±0.05 0.45±0.041）376.54±39.15 264.22±20.831）72.06±5.83 40.59±3.021）354.87±34.96 227.14±20.481）0.57±0.04 0.39±0.041）0.58±0.05 0.33±0.031）

2.3 NF-κB激活劑對過表達TIPE2的支氣管上細胞中IL-6、IL-8、IL-1β、NF-κBp65、p-ⅠκBα的影響NF-κB激活劑PMA處理過表達TIPE2的支氣管上細胞，經LPS處理，細胞中的NF-κBp65、p-ⅠκBαSer32蛋白水平升高，細胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β增多（表3，圖3）。NF-κB激活劑逆轉過表達TIPE2對LPS條件下支氣管上細胞分泌炎癥因子的影響。

表3 NF-κB激活劑對TIPE2過表達載體影響LPS條件下支氣管上皮細胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達和分泌IL-6、IL-8、IL-1β作用（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of NF-κB activator on NF-κBp65，p-ⅠκBαSer 32expression and secretion of IL-6，IL-8 and IL-1βin LPS treated bronchial epithelial cells（±s，pg/ml）

表3 NF-κB激活劑對TIPE2過表達載體影響LPS條件下支氣管上皮細胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達和分泌IL-6、IL-8、IL-1β作用（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of NF-κB activator on NF-κBp65，p-ⅠκBαSer 32expression and secretion of IL-6，IL-8 and IL-1βin LPS treated bronchial epithelial cells（±s，pg/ml）

Note：Compared with LPS+TIPE2 group，1）P＜0.05.

Groups LPS+TIPE2 LPS+TIPE2+PMA NF-κBp65 0.40±0.05 0.84±0.091）p-ⅠκBαSer 32 0.37±0.05 0.77±0.061）IL-1β 220.53±25.87 372.96±31.521）IL-6 269.12±22.84 374.25±38.021）IL-8 43.55±4.18 76.83±5.561）

圖3 Western blot測定LPS條件下NF-κB激活劑處理后過表達TIPE2的支氣管上皮細胞中NF-κBp65、p-ⅠκBαSer 32蛋白表達Fig.3 Western blot analysis of expression of NF-κBp65 and p-ⅠκBαSer 32in bronchial epithelial cells under LPS condition of overexpression of TIPE2 after treatment with NF-κB activator

3 討論

呼吸道以及肺組織中失控炎癥是急性肺損傷發(fā)生的主要原因之一，其炎癥初期往往由革蘭氏陰性菌感染導致［9］。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，也是常見的誘導急性肺損傷發(fā)生的誘導因子［10］。LPS可以促進支氣管上皮細胞產生炎癥介質，從而加快急性肺損傷進程。IL-6、IL-8、IL-1β是常見的炎癥因子，在炎癥反應中發(fā)揮促進作用［11-12］。本次實驗結果證實LPS處理后的支氣管上皮細胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β含量升高，說明LPS誘導炎癥反應，這與之前的研究報道結果一致，提示成功構建了支氣管上皮細胞損傷模型。

TIPE2是目前為止研究最多的TNFAIP8家族成員，其是在探討自身免疫腦脊髓炎過程中發(fā)現(xiàn)的，優(yōu)先表達于炎癥組織和免疫器官［13-14］。TIPE2表達下調常常與多種炎癥相關疾病如糖尿病腎炎、哮喘、肝纖維化等有關［15-17］。TIPE2可以通過影響下游基因和信號通路的表達發(fā)揮抗炎功效［18］。研究表明，過表達TIPE2可以顯著降低哮喘過程支氣管上皮細胞相關炎癥介質的釋放，TIPE2對于肺組織炎癥可能具有抑制作用［8］。本實驗結果表明，LPS處理后的支氣管上皮細胞中TIPE2表達下調，而過表達TIPE2可以明顯抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞釋放炎癥因子，提示TIPE2在支氣管上皮細胞炎癥反應中發(fā)揮負調控作用。

目前對于TIPE2在炎癥反應中的作用機制還不明確，已知其可以通過多種方式調控多種信號通路的激活水平，從而發(fā)揮多重生物學功效，進而參與疾病進展［19］。在缺血再灌注損傷研究過程中發(fā)現(xiàn)TIPE2可以抑制心肌炎癥細胞浸潤，抑制NF-κB信號通路的激活［20］。NF-κB是一個轉錄調節(jié)因子，其可以被多種因子刺激而激活，NF-κB是一個由Rel家族成員構建的二聚體蛋白，其中NF-κBp65和p-ⅠκBαSer32是NF-κB信號激活水平的標志蛋白［21］。NFκB信號與炎癥反應有關，其激活后可促進炎癥反應［22-23］。研究顯示，LPS可以誘導支氣管上皮細胞中NF-κB信號激活，NF-κB信號在急性肺損傷中發(fā)揮促進作用［24］。本實驗表明，過表達TIPE2可以明顯抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞中NF-κB信號激活，并且NF-κB信號激活劑能夠逆轉TIPE2的抗炎因子釋放作用，這說明TIPE2在支氣管上皮細胞釋放炎癥因子與NF-κB信號有關。

總而言之，TIPE2在急性肺損傷中可能發(fā)揮保護作用，TIPE2在LPS誘導的支氣管上皮細胞炎癥因子釋放中發(fā)揮抑制作用，其作用機制與下調NFκB信號激活程度有關。本次實驗結果為研究急性肺損傷發(fā)生機制及TIPE2作用機制提供參考及依據(jù)。在后期的實驗中會繼續(xù)研究TIPE2在急性肺損傷中的作用以及其對下游信號通路的影響。