異甘草素通過JAK/STAT途徑治療小鼠特應(yīng)性皮炎的機(jī)制研究

李媛媛，潘新鋒，池麗俏

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院皮膚科，上海 201700)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種常見的皮膚疾病，在嬰兒和兒童中常見，臨床上以慢性炎癥為特征，組織學(xué)上以炎癥細(xì)胞的皮膚浸潤為特征[1]。局部類固醇治療仍然是治療AD的主要方法。然而，這種治療與嚴(yán)重的副作用有關(guān)，包括萎縮、痤瘡、白內(nèi)障、生長遲緩和皮膚紅燒等[2]。因此，需要尋找新的抗皮炎藥物來應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)。異甘草素是從甘草中分離得到的重要生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝、護(hù)心等多種藥理特性[3]。研究顯示，作為炎癥反應(yīng)的有效調(diào)節(jié)劑，異甘草素可抑制活化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)表達(dá)，并減弱腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導(dǎo)的血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1的表達(dá)[4]。在分子水平上，異甘草素通過阻止核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的核轉(zhuǎn)運(yùn)，在轉(zhuǎn)錄水平上消除了TNF-α誘導(dǎo)的VCAM-1積累[5]。然而，異甘草素對(duì)AD的作用研究較少。Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)是許多細(xì)胞因子和生長因子的經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在免疫學(xué)通路中起放大效應(yīng)和相互連接的作用，JAK-STAT抑制劑通過阻斷JAK和STAT磷酸化，起到緩解AD的作用[6]。本研究檢測(cè)異甘草素對(duì)小鼠AD的治療效果，并探討JAK-STAT途徑在其中的作用，為異甘草素治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:60只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠購自國科賽賦河北醫(yī)藥技術(shù)有限公司，8周齡，體質(zhì)量25～30g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2019-0002，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(冀)2019-0004，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：JL2020061302，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度為40～70%、噪音≤50dB，環(huán)境晝夜循環(huán)(12h/12h)的環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行。

1.2主要試劑與儀器:異甘草素(原料藥，純度≥98%，湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司，批號(hào)：961-29-5)；醋酸潑尼松龍片(上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)：20200413)；2,4-二硝基氯苯(DNCB)(美國Sigma公司，批號(hào)：2508193)；白細(xì)胞介素-4(IL-4)、TNF-α和免疫球蛋白E(IgE)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：ml6923215、ml692127、ml692248)；蛋白抽提試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：AR0103)；JAK1、JAK3、STAT3、STAT6和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，批號(hào)：SC-5217、SC-5517、SC-5264、SC-2154、SC-1007)；山羊抗鼠二抗(武漢艾美捷科技有限公司，批號(hào)：C5164)；HBS-1096B型酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；DYCZ-24KF型垂直電泳儀(上海熙浩實(shí)業(yè)有限公司)；GelDoc IT TS2型凝膠成像儀(美國UVP公司)。

1.3分組、造模及給藥:將60只小鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為陰性對(duì)照組、模型組、異甘草素低劑量組、異甘草素高劑量組和陽性對(duì)照組，每組12只。參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行特應(yīng)性皮炎小鼠造模：實(shí)驗(yàn)前1d去除小鼠背部毛發(fā)(面積2cm×3cm)，實(shí)驗(yàn)第1～3天，除陰性對(duì)照組小鼠，其余各組小鼠每天用100μL 1% DNCB涂于小鼠背部脫毛區(qū)及雙耳部，第4d開始改為隔天涂抹一次，直到第28天，小鼠背部出現(xiàn)脫屑、紅斑等情況則表示造模成功，48只小鼠均造模成功。陰性對(duì)照組小鼠用100μL生理鹽水涂抹。造模成功后第1天，異甘草素低劑量組、異甘草素高劑量組小鼠分別灌胃50mg/kg、100mg/kg的異甘草素[8](異甘草素溶于蒸餾水，配制成濃度分別為10mg/mL、20mg/mL的溶液)；陽性對(duì)照組小鼠灌胃10mg/kg的潑尼松龍[9](潑尼松龍溶于蒸餾水，配制成濃度為1mg/mL的溶液)；陰性對(duì)照組和模型組灌胃等量蒸餾水；各組灌胃體積均為10mL/kg，每天1次，連續(xù)給藥14d

1.4小鼠抓撓行為評(píng)價(jià):末次給藥后，把小鼠放在籠子里，適應(yīng)15min，記錄10min內(nèi)抓撓行為的次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)將抓撓行為定義為后爪運(yùn)動(dòng)，記錄用后爪抓鼻、耳和背側(cè)皮膚，所有評(píng)估均以盲法進(jìn)行。

1.5小鼠皮炎評(píng)分[9]:做完抓撓行為評(píng)價(jià)后，觀察各組小鼠背部皮損大體表現(xiàn)，評(píng)估小鼠背部皮膚皮炎的嚴(yán)重程度，四種癥狀(紅斑/出血、水腫、剝蝕/糜爛、瘢痕/干燥)，每種癥狀的嚴(yán)重程度分別為0(無)、1(輕度)、2(中度)、3(重度)。皮炎的總評(píng)分(表示嚴(yán)重程度)定義為所有評(píng)分的總和，評(píng)分區(qū)間為0～12分。

1.6血清中IL-4、TNF-α和IgE水平檢測(cè):小鼠眼球取血，3000×g離心5min，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清中IL-4、TNF-α和IgE含量。

1.7皮膚組織中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平檢測(cè):取一塊致敏部位的皮膚組織，分別進(jìn)行研碎，加入相應(yīng)蛋白抽提試劑，冰浴2h，3000×g離心取上清，進(jìn)行電泳(30μg/孔)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶在室溫下封膜1h，將膜與JAK1(1∶200)、JAK3(1∶200)、STAT3(1∶400)、STAT6(1∶300)和β-actin(1∶1000)抗體進(jìn)行孵育，4℃過夜，將山羊抗鼠二抗(1∶5000)在室溫下孵育30min。進(jìn)行顯色，結(jié)果用Quantitive軟件分析，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠皮損表現(xiàn):實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，陰性對(duì)照組小鼠皮膚正常；模型組小鼠皮膚出現(xiàn)不同程度的紅斑、干燥、抓痕、表皮糜爛脫落，結(jié)痂；異甘草素低、高劑量組癥狀明顯減輕，異甘草素高劑量組療效明顯；陽性對(duì)照組療效較異甘草素高劑量組好。見圖1。

2.2各組小鼠抓撓次數(shù)和皮炎評(píng)分的比較:與陰性對(duì)照組相比，其余各組小鼠抓撓次數(shù)和皮炎評(píng)分增加(P<0.05)；與模型組相比，異甘草素低劑量組、異甘草素高劑量組和陽性對(duì)照組小鼠抓撓次數(shù)和皮炎評(píng)分降低，異甘草素各劑量組呈劑量依賴性，但效果不如陽性對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠抓撓次數(shù)和皮炎評(píng)分的比較

2.3各組小鼠血清中IL-4、TNF-α和IgE水平比較:與陰性對(duì)照組相比，其余各組小鼠血清中IL-4、TNF-α和IgE水平增加；與模型組相比，異甘草素低劑量組、異甘草素高劑量組和陽性對(duì)照組小鼠血清中IL-4、TNF-α和IgE水平降低，異甘草素各劑量組呈劑量依賴性，但效果不如陽性對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-4 TNF-α和IgE水平比較

2.4各組小鼠皮膚組織中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平比較:與陰性對(duì)照組相比，其余各組小鼠皮膚組織中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平增加(P<0.05)；與模型組相比，異甘草素低劑量組、異甘草素高劑量組和陽性對(duì)照組小鼠皮膚組織中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平降低，異甘草素各劑量組呈劑量依賴性，但效果不如陽性對(duì)照組(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組小鼠皮膚組織中JAK1 JAK3 STAT3和STAT6蛋白水平比較

圖2 各組小鼠皮膚組織中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白印跡圖

3 討 論

AD是一種常見的炎癥性皮膚病，以濕疹和抓撓行為為特征，可引起皮膚損傷。雖然潑尼松龍是治療炎癥性疾病(包括接觸性皮炎和AD)最有效的類固醇藥物之一，但可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用[10]。各種實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，從草藥提取物或衍生物中提取的天然免疫調(diào)節(jié)劑可能對(duì)AD有治療作用。異甘草素是從甘草中提取的小酚類生物活性分子，對(duì)炎性疾病和心血管疾病具有多種藥理活性[11]。在本研究中，我們檢測(cè)了異甘草素在DNCB誘導(dǎo)的AD小鼠模型中的作用。結(jié)果表明，異甘草素可以改善AD癥狀，表現(xiàn)為抓撓行為次數(shù)減少和皮炎評(píng)分降低。雖然異甘草素改善程度不如潑尼松龍，但考慮到潑尼松龍的副作用，異甘草素還是有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

血清IL-4、TNF-α和IgE的過度表達(dá)是過敏性疾病(包括哮喘和AD)的標(biāo)志。IL-4有助于從原始T細(xì)胞擴(kuò)增Th2細(xì)胞亞群，并促進(jìn)B細(xì)胞的同種型轉(zhuǎn)換，以產(chǎn)生針對(duì)特定環(huán)境變應(yīng)原的IgE抗體。從幼稚T細(xì)胞向過敏性Th2細(xì)胞的轉(zhuǎn)換中，IL-4也是必不可少的。TNF-α在下調(diào)抗原呈遞細(xì)胞的白細(xì)胞介素-12(IL-12)產(chǎn)生中起作用，并促進(jìn)幼稚Th0細(xì)胞向Th2譜的分化[12]。因此，我們檢測(cè)了異甘草素是否抑制AD小鼠血清IgE。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，異甘草素治療后，血清中IL-4、TNF-α和IgE水平顯著降低。由于AD是一種以Th2細(xì)胞增多為主的疾病，因此研究JAK-STAT通路如何調(diào)節(jié)Th2分化將有助于我們了解JAK-STAT在AD中可能發(fā)揮的作用。

JAK-STAT途徑是皮膚病學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)新興的方向，研究表明，該途徑可能與炎癥性皮膚疾病有關(guān)，特別是關(guān)于牛皮癬、AD和黑色素瘤[13]。JAK-STAT途徑對(duì)免疫系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要，在許多炎癥和自身免疫性疾病的JAK-STAT途徑被破壞。當(dāng)配體與其受體的結(jié)合時(shí)導(dǎo)致JAK活化，進(jìn)而激活STAT，然后激活的STAT易位到細(xì)胞核以調(diào)節(jié)其靶基因[14]。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2(TYK2)，STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT5A/B和STAT6。IL-4是Th2細(xì)胞分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生所必需的，在AD的發(fā)生中，IL-4通過JAK-STAT途徑導(dǎo)致Th1/Th2的失衡，其中STAT6是調(diào)節(jié)IL-4介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，IL-4還可通過JAK1/3-STAT6募集嗜酸性粒細(xì)胞在皮下積聚等。此外，依賴JAK-STAT途徑的細(xì)胞因子還有干擾素γ(IFN-γ)、TNF-α以及與Th2相關(guān)的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)和白細(xì)胞介素-23(IL-23)等。上述細(xì)胞因子最終可以導(dǎo)致涉及JAK-STAT途徑下游的Th2炎癥因子增多，介導(dǎo)AD發(fā)生。在AD的小鼠模型中，B細(xì)胞大量產(chǎn)生IgE和過度的炎癥反應(yīng)歸因于B細(xì)胞中JAK3的強(qiáng)烈磷酸化[15]。泛JAK抑制劑Pyridone 6(P6)延遲了AD小鼠的發(fā)作并減輕了AD皮膚損害的嚴(yán)重性，P6抑制TNF-α/STAT3和IL-4/STAT6途徑。本研究結(jié)果顯示，異甘草素能降低小鼠致敏部位皮膚組織中JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白水平，說明它能抑制JAK-STAT途徑，與上述討論一致。

綜上所述，異甘草素可改善AD小鼠皮損，降低血清IL-4、TNF-α和IgE水平，它的這些抗特應(yīng)性作用可能是通過抑制JAK-STAT途徑來介導(dǎo)，為AD的治療提供了新的策略。