間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡骨質(zhì)疏松效果分析

劉瑞霞，許文英（通訊作者）

（蘇州市立醫(yī)院本部 江蘇 蘇州 215000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是可累積全身各系統(tǒng)的自身免疫病，累及骨骼肌肉系統(tǒng)可導(dǎo)致骨量流失出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。由研究證實(shí)初發(fā)SLE 患者也可存在骨質(zhì)疏松[1]，現(xiàn)階段研究證實(shí)SLE 患者體內(nèi)的炎癥因子在其骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中尤為重要[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，SLE 患者體內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-6 等炎癥因子水平異常[3-4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)T 細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17 在多種自身免疫性疾病中起重要作用[5-7]。在SLE 患者TNF-α可促進(jìn)破骨前體細(xì)胞的增值，活化NF-KB 受體活化因子（RANK）促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，促進(jìn)破骨細(xì)胞分泌RANK和成骨細(xì)胞分泌RANKL，二者結(jié)合可激活進(jìn)一步NF-KB及其下游相關(guān)蛋白，這些蛋白分子促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化及分化成熟，從增加骨吸收[8-10]。目前研究已發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)通路參與MSCs 成骨分化，如Wnt/β-catenin、BMP-Smads、Notch、Hedgehog、FGF，且相互調(diào)節(jié)，其中BMP/Smad 信號(hào)通路最早發(fā)現(xiàn)且最為重要[11]。間充質(zhì)干細(xì)胞有多向分化潛能，具有免疫調(diào)控作用，通過(guò)臨床行USMSCs 輸注后評(píng)估骨代謝相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)水平的變化。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月—2016 年1 月住院SLE 并發(fā)骨質(zhì)疏松患者8 例，均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）1997 年SLE 分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，其中女性7 例，男性1 例，年齡30 ～50歲。入組患者分別與移植前、移植后1 月、3 月、6 月隨訪，使用PCR 方法檢測(cè)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞骨代謝基因表達(dá)水平。

1.2 方法

（1）分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），提取測(cè)定RNA。

（2）設(shè)計(jì)及合成引物：應(yīng)用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參基因GAPDH 及目的基因的引物序列，上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

（3）反轉(zhuǎn)錄及熒光定量：PCR 對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，同時(shí)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)引物特異性并選取最佳退火溫度。對(duì)各組標(biāo)本的基因行熒光定量PCR。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0 軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示計(jì)量資料，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布與方差齊性，采用單向方差分析進(jìn)行多組之間的均數(shù)比較。P＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

（1）對(duì) 比 移 植 后1 月、3 月SLE 患 者PBMC 的TNF-α、NF-κBp50 和NF-κBp65 mRNA 水平下降（P＜0.05），移植后6 月NF-κBp65 mRNA 水平仍較處于低水平，逐漸接近移植前水平且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 移植前后TNF/NFκB 信號(hào)通路mRNA 表達(dá)水平（± s）

表1 移植前后TNF/NFκB 信號(hào)通路mRNA 表達(dá)水平（± s）

TNFα NFκBp50 NFκBp65移植前 0.41±0.35 0.58±0.32 0.56±0.31移植后1 月 0.31±0.10 0.28±0.14 0.16±0.09移植后3 月 0.28±0.11 0.31±0.12 0.11±0.03移植后6 月 0.37±0.05 0.48±0.08 0.28±0.06 F 4.43 4.81 5.70 P 0.04 0.03 0.00

（2）移植前后BMP2、Smad1、Smad5 和Smad8 的mRNA 水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），移植后6 個(gè)月逐漸接近移植前水平。詳見(jiàn)表2。

表2 移植前后BMP/Smad 信號(hào)通路mRNA 表達(dá)水平（± s）

表2 移植前后BMP/Smad 信號(hào)通路mRNA 表達(dá)水平（± s）

BMP2 Smad1 Smad5 Smad8移植前 0.50±0.29 0.73±0.21 0.58±0.26 0.51±0.24移植后1 月 0.78±0.83 0.98±0.25 0.73±0.15 0.71±0.12移植后3 月 0.80±0.28 0.82±0.21 0.69±0.21 0.63±0.21移植后6 月 0.51±0.27 0.77±0.15 0.48±0.18 0.47±0.19 F 0.53 1.36 1.31 0.77 P 0.66 0.29 0.31 0.54

3.討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是以T、B 淋巴細(xì)胞等免疫功能異常為主要發(fā)病機(jī)制[12-13]，近年來(lái)隨著SLE 生存率的增加，繼發(fā)骨質(zhì)疏松已成為影響患者生活質(zhì)量的嚴(yán)重并發(fā)癥[14-15]。

目前的研究認(rèn)為T(mén)NF-α 水平異常誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化和成熟是導(dǎo)致SLE 患者發(fā)生炎癥介導(dǎo)骨質(zhì)疏松的重要因素。本研究擬通過(guò)檢測(cè)移植前后TNF-α/NF-κB 信號(hào)通路基因表達(dá)水平的變化評(píng)估臍帶間充干細(xì)胞移植治療SLE 骨質(zhì)疏松有效性。在骨代謝中，偶聯(lián)骨形成和骨吸收兩個(gè)過(guò)程的重要信號(hào)通路是OPG/RANK/RANKL[17]，RANK/RANKL 在破骨細(xì)胞的生成調(diào)節(jié)中起重要作用，二者結(jié)合后入核啟動(dòng)NF-κB 的活化，進(jìn)一步與NFAT-c1 結(jié)合啟動(dòng)破骨基因活化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟[18]，而OPG與RANKL 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合科阻斷上述過(guò)程，抑制下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制破骨細(xì)胞分化成熟。

已有研究證實(shí)狼瘡患者M(jìn)SCs 成骨分化能力較正常人減弱[16]，近年來(lái)行MSCs 移植治療難治性SLE 已有研究，本次試驗(yàn)我們經(jīng)外周靜脈移植，意在探討MSCs治療SLE 骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在靜脈輸注MSCs 后的狼瘡患者體內(nèi)BMP/Smad 中基因表達(dá)水平變化雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但整體水平有升高，且TNF-α/NF-κB 通路中各基因表達(dá)下降；據(jù)此有理由推測(cè)，UCMSCs 移植可能通過(guò)調(diào)節(jié)BMP/Smad 及TNF/NF-κB 信號(hào)通路治療骨質(zhì)疏松。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了UCMSCs 移植對(duì)骨代謝信號(hào)通路調(diào)節(jié)，一定程度上說(shuō)明MSCs 移植治療骨質(zhì)疏松可能是通過(guò)抑制TNF-α，作用于MSCs BMP/Smad 信號(hào)通路。