一個(gè)鰓-耳-腎綜合征家系EYA1基因新致病性變異△

王賀賀 孫敬武 萬光倫，2 陳浩，2 李萬舉，2 趙婉，2 潘春晨，2

鰓-耳-腎綜合征(branchio-oto-renal，BOR)是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病，發(fā)病率約為1/40 000，占重度聽力損失兒童的2%[1]。BOR綜合征外顯率高，主要的臨床癥狀是聽力損失，鰓瘺和耳前瘺管、外耳、耳道和中耳或內(nèi)耳的畸形以及從發(fā)育不全到雙側(cè)的腎異常。最常見的表現(xiàn)是聽力損失，可以是傳導(dǎo)性、感音性或混合性[2]?；颊咄ǔ１憩F(xiàn)為鰓、耳和腎的異常結(jié)合，臨床表型多樣，診斷非常困難[3]。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，多種基因檢測工具相繼出現(xiàn)，BOR綜合征的致病基因相繼被發(fā)現(xiàn)，目前已明確的BOR綜合征致病基因有EYA1(8q13.3)、SIX1(14q23.1)和SIX5(19q13.32)[4]。在受影響的人群中，約40%是由EYA1基因突變引起的，因此常將EYA1基因檢測作為BOR基因篩查的第一步。目前認(rèn)為由于EYA1蛋白與SIX1蛋白相互作用形成保守的轉(zhuǎn)錄輔激活復(fù)合物，其作用是胎兒的鰓弓、聽覺系統(tǒng)和腎臟發(fā)育所必需的，所以EYA1基因突變會導(dǎo)致胎兒上述系統(tǒng)的異常發(fā)育，從而導(dǎo)致BOR綜合征的發(fā)生[5,6]。

本研究通過對一個(gè)BOR綜合征家系進(jìn)行Sanger法測序和蛋白功能預(yù)測軟件進(jìn)行遺傳學(xué)分析，首次檢測出中國人群中EYA1基因c.889C>T(p.R297X)位點(diǎn)的致病性突變，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 家系資料調(diào)查由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科家系采集小組完成，本研究中先證者(III-3)為男性,2歲7個(gè)月，因頸部瘺管和耳前瘺管至我院耳鼻咽喉頭頸外科就診，家系成員包括三代9名成員(圖1)。本次調(diào)查研究獲得醫(yī)院倫理委員會認(rèn)可，所有研究對象均簽署了知情同意書，未成年人由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2病史采集和全身體格檢查 對先證者及家族成員進(jìn)行完整病史(出生史、耳聾病史、家族史、外傷史、耳毒性藥物應(yīng)用史等)采集和系統(tǒng)的全身體格檢查。

1.3聽力學(xué)檢測及其他檢查 對II代及III代所有家系成員進(jìn)行常規(guī)純音測聽及聲導(dǎo)抗檢測，耳聾患者進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)(ABR)、耳聲發(fā)射以及40 Hz聽覺相關(guān)電位檢測。根據(jù)WHO(1997)的聽力損失標(biāo)準(zhǔn)評估聽力損失程度：輕度聽力損失(26～40 dB HL)、中度聽力損失(41～60 dB HL)、重度聽力損失(61～80 dB HL)及極重度聽力損失(>80 dB HL)。家系中患病個(gè)體做了其他相關(guān)檢查，包括血液學(xué)檢查、中耳乳突CT、心臟彩超、腎臟B超、碘油造影等。

1.4遺傳性耳聾基因芯片篩查 對II代及III代家系成員采集其外周血(EDTA采血管抽取外周靜脈血3～8 ml)，用于基因組DNA提取與保存。運(yùn)用遺傳性聾基因芯片對先證者、III-1及III-2進(jìn)行常見的遺傳性耳聾基因GJB2(135 del G、176 del 16、299 del AT、235 del C)、GJB3(538 c>T)、SLC26A4(2168A>G、IVS7-2A>G)及mtDNA12S rRNA基因(1494C>T、1555C>T)的共9個(gè)位點(diǎn)檢測。

1.5Sanger基因測序及變異致病性分析 經(jīng)過DNA提取及質(zhì)檢，基因組文庫構(gòu)建，目標(biāo)區(qū)域捕獲測序及生物信息分析后得到候選變異位點(diǎn)，利用PCR和Sanger測序驗(yàn)證經(jīng)分析篩選后得到的候選變異位點(diǎn)。EYA1基因擴(kuò)增的引物如下：正向：5＇GCATCTGATACCTTAACCACTGC3＇；反向：5＇AACCTGTTGCCTCTCACCTTC3＇。使用貝克曼自動化工作站預(yù)設(shè)程序配置PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，并按如下步驟運(yùn)行程序：96 ℃ 1 min30 s；96 ℃ 15 s，50 ℃ 6 s，60 ℃3 min30 s，28個(gè)循環(huán)；4 ℃ Holds。PCR產(chǎn)物使用3130XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳測序并在ABI 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)上進(jìn)行分析，再在家系成員中進(jìn)行共分離驗(yàn)證。采用Human Splicing Finder預(yù)測剪接軟件對異?；蛲蛔冞M(jìn)行功能驗(yàn)證，利用美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)指南對基因變異進(jìn)行致病性分析。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化與測序工作由北京邁基諾檢驗(yàn)所完成。

2 結(jié)果

2.1家系表型及聽力檢查結(jié)果 該家系共3代9人，4人發(fā)病，表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，均為語前聾，出生時(shí)即伴不同程度的聽力損失，呈漸進(jìn)性加重。先證者及家系中其他患病個(gè)體均表現(xiàn)為聽力損失、頸前瘺管、外耳異常、腎異常及淚道溢液中的兩種及以上的混合癥狀，癥狀輕重不等(表1)；先證者為III-3，男，2歲7個(gè)月，聲導(dǎo)抗檢查鼓室導(dǎo)抗圖為雙側(cè)B型，III-2為右側(cè)A型，左側(cè)B型，其余家系成員鼓室導(dǎo)抗圖均為雙側(cè)A型。

2.2影像學(xué)檢查及血液學(xué)檢測 4例患者中耳乳突CT及心臟彩超均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。先證者(III-3)腎臟B超提示左腎發(fā)育良好，右腎發(fā)育不全伴旋轉(zhuǎn)不良；患者III-2腎臟B超提示雙腎發(fā)育良好；患者III-1腎臟B超和腹部CT提示左腎發(fā)育良好，右腎異位發(fā)育不全伴旋轉(zhuǎn)不良；患者II-2腎臟B超提示左腎發(fā)育良好，盆腔部位見大小約83 mm×46 mm的右側(cè)異位腎(圖2)；患者III-1及III-3的尿液檢測結(jié)果正常，血液學(xué)檢查結(jié)果見表2。

圖2 該家系4例患者的腎臟影像學(xué)檢查圖像

表2 患者III-1及III-3的血液學(xué)檢查結(jié)果

2.3遺傳性耳聾基因芯片檢測結(jié)果 患者III-1、III-2及先證者(III-3)的遺傳性耳聾基因芯片檢測結(jié)果均為野生型，未發(fā)現(xiàn)攜帶中國人最常見的4個(gè)耳聾基因突變。

2.4Sanger基因測序及變異致病性分析結(jié)果 Sanger基因測序峰圖結(jié)果提示，先證者、患者II-2、III-1及III-2的EYA1基因c.889C>T(p.R297X)為突變型，且為無義突變，均為雜合變異，變異來源于II-2，II-1未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的變異，為野生型(圖3)。利用蛋白功能預(yù)測軟件SIFT、PolyPhen_2和REVEL進(jìn)行EYA1基因變異致病性的分析，結(jié)果分別為未知、未知、未知(表3)，根據(jù)ACMG指南，該變異初步判定為致病性變異。

表3 該家系EYA1基因的致病性變異特點(diǎn)

圖3 該家系4例患者EYA1基因突變的測序峰圖

2.5先證者及患者III-1頸部瘺管及耳前瘺管的外科治療 利用術(shù)前瘺管碘油造影和術(shù)中從頸部瘺管插入金屬導(dǎo)絲的方法將瘺管完整切除；利用顯微外科手術(shù)切除耳前瘺管，術(shù)后瘺管病理均提示符合鰓裂瘺管改變。

3 討論

BOR綜合征的患者通常表現(xiàn)為傳導(dǎo)性、感音神經(jīng)性或混合性聽力損失，也可能有外耳、中耳或內(nèi)耳畸形；其他癥狀包括鰓裂囊腫和頸部瘺管，以及腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常[7]。由于廣泛的表型和家系之間以及家系內(nèi)部的表型變異，Chang等[8]提出了BOR綜合征臨床診斷的表型標(biāo)準(zhǔn)。BOR綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為主要標(biāo)準(zhǔn)和次要標(biāo)準(zhǔn)，主要標(biāo)準(zhǔn)包括第二鰓弓異常、聽力損失、耳前凹、耳廓畸形和腎異常；次要標(biāo)準(zhǔn)包括外耳道異常、中耳異常、內(nèi)耳異常、耳前標(biāo)記物、面部不對稱和腭部異常。BOR綜合征的診斷：有三個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)或兩個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)加上兩個(gè)次要標(biāo)準(zhǔn)或一個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)和家族史。本研究先證者及家系中其他患者均表現(xiàn)為聽力損失、頸前瘺管、外耳異常、腎異常及淚道溢液中的兩種及以上的混合癥狀，癥狀輕重不等，符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，與已知BOR綜合征的臨床表型相符，未發(fā)現(xiàn)新的臨床表型。

先證者及患者III-1的血液學(xué)檢查結(jié)果除血糖略低外，余基本正常，可能一側(cè)腎臟發(fā)育不良在BOR患者中早期表現(xiàn)并不明顯，建議每半年或一年復(fù)查一次腎功能和腎臟B超，因?yàn)槟I臟疾病是影響患者生活質(zhì)量的最重要的預(yù)后因素[9]。患者II-2右側(cè)腎異位，III-1右腎異位發(fā)育不全伴旋轉(zhuǎn)不良，先證者右腎發(fā)育不全伴旋轉(zhuǎn)不良，異常腎均在右側(cè)，而不是左側(cè)或者雙側(cè)。目前關(guān)于BOR綜合征腎異常的報(bào)道中，腎異常的側(cè)別未被具體分析,本研究考慮在BOR綜合征家系中，如果兩個(gè)及以上的變異個(gè)體存在腎臟異常，那么極大概率是在同側(cè)，即腎異常的側(cè)別在BOR綜合征的遺傳中保持著穩(wěn)定性，當(dāng)然這需要更多的BOR綜合征家系來驗(yàn)證。

BOR綜合征即使在同一家族，不同患病個(gè)體之間的臨床表型變異較大，如本研究中各患病個(gè)體臨床表型不盡相同，這也給BOR綜合征的診斷帶來了困難[10]。如本研究中先證者，首先考慮了遺傳性耳聾，所以利用遺傳性耳聾基因芯片檢測，但結(jié)果均為野生型，待其余各項(xiàng)檢查結(jié)果出來后，才考慮BOR綜合征，利用Sanger法進(jìn)行基因測序，最終發(fā)現(xiàn)EYA1基因c.889C> T(p.R297X)突變，確診為BOR綜合征。Orten等[11]在散發(fā)的家族中首次報(bào)道了該位點(diǎn)的突變，但是并未對該位點(diǎn)的致病性進(jìn)行預(yù)測，他們從表型與基因突變類型的方面分析認(rèn)為表型的嚴(yán)重程度與突變類型無關(guān)，即使在家系內(nèi)部亦不穩(wěn)定，并認(rèn)為該位點(diǎn)可能為BOR綜合征的突變熱點(diǎn)。

盡管基因檢測技術(shù)發(fā)展很快，但并不是所有的BOR綜合征患者都能檢測到基因突變，據(jù)報(bào)道，通過傳統(tǒng)的基因檢測，仍有約50%的BOR綜合征患者未發(fā)現(xiàn)EYA1、SIX1和SIX5的致病性變異，可能是因?yàn)檫@些患者存在位于這些基因的未發(fā)現(xiàn)區(qū)域或新基因中的變異[12]。自Abdelhak等[13]發(fā)現(xiàn)EYA1基因突變可導(dǎo)致BOR綜合征以來，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200多個(gè)不同的EYA1突變可以導(dǎo)致BOR綜合征；在導(dǎo)致BOR綜合征的已知突變中，在中國人群中目前僅發(fā)現(xiàn)c.466C>T、c.1735delG、c.1381delA、c.967A>T和c.1493insat等少數(shù)的幾種突變[14～18]，本研究首次在中國人群中發(fā)現(xiàn)EYA1基因 c.889C> T(p.R297X)突變，擴(kuò)展了中國BOR綜合征人群的疾病基因譜。

綜上所述，本研究首次在中國BOR綜合征人群中檢測到EYA1基因 c.889C> T(p.R297X)突變，且在該BOR綜合征家系中，腎異常的遺傳似乎保持著穩(wěn)定性。建議在條件允許的情況下運(yùn)用臨床表型診斷標(biāo)準(zhǔn)與基因診斷相結(jié)合的方法對BOR綜合征進(jìn)行診斷，以降低BOR的漏診率。