去泛素化酶在喉癌及舌癌中的作用及機(jī)制研究

王潔 華清泉

喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)與舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)是發(fā)生于人體言語發(fā)聲器官中較為常見的腫瘤，其致病因素十分復(fù)雜，包括煙草和酒精攝入、人乳頭瘤病毒(HPV)或EB病毒(EBV)等病毒感染、輻射、牙周疾病、維生素缺乏癥和飲食習(xí)慣(Pezzuto,2015)。在過去的十年中，經(jīng)過分子和細(xì)胞遺傳學(xué)研究證明，各種癌基因和抑癌基因的突變或異常表達(dá)促進(jìn)了喉癌及舌癌的惡性表型，因此，分子水平的深入研究有利于喉癌及舌癌患者的合理治療，為其治療提供了新的思路和方法。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是非溶酶體內(nèi)源性蛋白質(zhì)降解的主要途徑，在真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)調(diào)控意義重大[1]。蛋白質(zhì)的泛素化是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，去泛素化是泛素化的逆過程，由去泛素化酶(DUBs)參與調(diào)控。有研究報(bào)道稱，去泛素化酶可以通過去泛素化過程調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，在維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用[2]，它還參與了細(xì)胞的生長、增殖和分化等。同時(shí)，去泛素化酶會(huì)導(dǎo)致多種人體疾病(如癌癥、免疫性疾病)的發(fā)生，去泛素化酶已成為致癌基因和腫瘤抑制因子的重要調(diào)節(jié)劑，參與體內(nèi)如細(xì)胞周期控制[3]、DNA修復(fù)[4]、染色質(zhì)重塑[5]和信號(hào)傳導(dǎo)途徑[6]等直接或間接反應(yīng)來影響許多癌癥的發(fā)生及發(fā)展。另外，一些可以靶向作用于喉癌與舌癌的去泛素化酶抑制劑具有特異性強(qiáng)、細(xì)胞毒性弱等優(yōu)勢。本文對參與喉癌與舌癌發(fā)生發(fā)展的去泛素化酶及其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行綜述，為其診斷、預(yù)后和治療提供新的方向。

1 去泛素化酶的分類與結(jié)構(gòu)

去泛素化酶可以在底物泛素化過程中的各個(gè)階段起作用，包括底物多泛素鏈的加工，去除泛素底物，或去除殘留的泛素分子以促進(jìn)蛋白酶體降解和泛素蛋白的循環(huán)[7]。目前人類的蛋白酶可分為六個(gè)亞類，共100多位成員，其中五個(gè)為半胱氨酸蛋白酶，分別為泛素羧基末端水解酶家族(UCHs)、泛素特異性加工酶家族(USPs)、MJD結(jié)構(gòu)域蛋白酶家族(MJDs)、卵巢腫瘤(OUT)相關(guān)蛋白酶(OTUs)和單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)的去泛素酶家族(MCPIPs)，Mpr1-Pad1氨基末端結(jié)構(gòu)域(MPN)/JAMM結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白酶家族(JAB1/MPN/Mov34s，JAMMs)為最后一個(gè)亞類，為含Zn2+的金屬蛋白酶。USPs為其中最大的一類，大約有50多種[8]，USPs和UCHs是最具特征性的去泛素化酶。USPs家族的催化結(jié)構(gòu)域分為手掌域(palm)、手指域(finger)和拇指域(thumb)三個(gè)子域，在palm與thumb之間具有催化中心，泛素分子可以被finger子域夾取而被去除，這三個(gè)子域在USPs家族中具有高度的保守性[9]。UCHs家族是巰基蛋白酶，對泛素化底物起修飾作用[10]，其催化核心由230個(gè)氨基酸組成，UCHs家族具有一個(gè)活性位點(diǎn)交叉環(huán)，泛素蛋白的C末端可以從中穿過而發(fā)生去泛素化反應(yīng)(Johnston，1999)。去泛素化酶因從標(biāo)簽蛋白修剪泛素從而回收泛素單體，防止一些體內(nèi)重要的抑癌蛋白如TP53等泛素化降解，從而有潛力成為一類抗癌靶標(biāo)(Ciechanover，2000)。

2 去泛素化酶在喉癌與舌癌發(fā)生發(fā)展中的作用

2.1影響舌癌細(xì)胞與喉癌細(xì)胞的增殖與凋亡 細(xì)胞的周期調(diào)控、增殖失控、抑制凋亡都會(huì)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。泛素特異性蛋白酶22(ubiquitin-specific protease 22，USP22)位于17號(hào)染色體，可通過組蛋白(H2A和H2B)去泛素化間接影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)眾多基因的轉(zhuǎn)錄活化并廣泛影響生物學(xué)功能[11]。同時(shí)，USP22具有癌癥干細(xì)胞的蛋白特征，可以促進(jìn)形成侵襲性腫瘤生長的各種蛋白質(zhì)[12]，因此，USP22是細(xì)胞周期調(diào)控的重要組成部分。在舌癌組織中降低USP22的表達(dá)可影響細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKI/Rb信號(hào)通路，使P21和P27CDKI的表達(dá)水平升高，Rb蛋白的表達(dá)降低，從而抑制舌癌細(xì)胞增殖[13]。免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)USP22在喉癌組織中表達(dá)上調(diào)[14]，且與喉癌的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后緊密相關(guān)。

泛素特異性蛋白酶9X(ubiquitin-specific protease 9X，USP9X)是USPs家族中的一員，它與胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15]。在舌癌細(xì)胞中體外轉(zhuǎn)染siUSP9X后，處于G0/G1期的細(xì)胞的百分比降低，而處于S和G2/M期的細(xì)胞百分比升高。USP9X在體外表達(dá)降低后，癌細(xì)胞增殖會(huì)不同程度的變慢，USP9X水平調(diào)控舌癌細(xì)胞增殖可以通過下游轉(zhuǎn)錄因子HES-1(Notch途徑)[16]，USP9X也可能通過雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑的PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)舌癌的增殖[14，17]，但USP9X的缺失可能對腫瘤細(xì)胞生長有害，其在原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中的丟失可能會(huì)加速繼發(fā)性腫瘤的發(fā)展[18]。

泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)是一種被證實(shí)與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的去泛素化酶。在腫瘤異種移植小鼠中，敲低USP14的舌癌相較對照組生長緩慢。在舌癌組織中，USP14的表達(dá)高于癌旁組織，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低USP14的表達(dá)可以抑制舌癌細(xì)胞的增殖與遷移[19]，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明USP14可以促進(jìn)舌鱗癌的增殖與侵襲。USP14的抑制劑bA-125會(huì)引起泛素化蛋白的大量增加，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase 3)以產(chǎn)生caspase 3與聚二磷酸腺苷核糖聚合酶PARP-1的剪切體，從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。

泛素化蛋白酶4(ubiquitin-specific protease 4)是從靶蛋白上裂解泛素起到去泛素化的作用，參與了體內(nèi)腫瘤形成的多種信號(hào)通路的調(diào)控(Chen,2002;Micheau,2003)。有文獻(xiàn)報(bào)道USP4在舌癌中較癌旁組織的表達(dá)升高，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)USP4與受體相互作用蛋白1(RIPI)可相互作用，以去除RIPI K63連接的泛素分子穩(wěn)定RIPI的表達(dá)，從而負(fù)調(diào)節(jié)RIPI泛素化介導(dǎo)的核因子κB(NF-κB)的活化及促進(jìn)腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)的凋亡(TNF是細(xì)胞凋亡的主要介質(zhì))，起到抑制舌癌細(xì)胞凋亡的作用[21]。

2.2去泛素化酶與喉癌及舌癌的預(yù)后 喉癌和舌癌的預(yù)后與其分期、復(fù)發(fā)及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。泛素特異性肽酶7(ubiquitin-specific protease 7，USP7)是一種去泛素化酶，可參與細(xì)胞內(nèi)的腫瘤調(diào)控、DNA修復(fù)、免疫應(yīng)答和表觀遺傳效應(yīng)[22]。在喉癌組織中，免疫組化顯示USP7的表達(dá)升高與組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(EZH2)相關(guān)[23]，EZH2可以促進(jìn)體內(nèi)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的衰老與分化[24]，EZH2在各種惡性腫瘤中高表達(dá)，包括鼻咽癌[25]。在低分化喉癌組織中USP7的表達(dá)高于高分化癌組織，且USP7的高表達(dá)與淋巴管浸潤程度高(P<0.001)和TNM分期高(P<0.001)皆有明顯的關(guān)系，生存分析發(fā)現(xiàn)USP7表達(dá)的增高與喉癌患者的生存期縮短有關(guān)。

泛素化蛋白酶2a(ubiquitin-specific protease 2a，USP2a)是USP2的兩個(gè)剪接變體之一，調(diào)節(jié)體內(nèi)多種重要的細(xì)胞生長和分化調(diào)節(jié)因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的穩(wěn)定性和功能(Graner，2004)。在舌癌組織中，USP2a升高與其預(yù)后不良、生存期縮短有關(guān)。ErbB2相互作用蛋白(Erbin)與USP2a在舌癌中的表達(dá)均上升，顯示Erbin與USP2a的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，與吸煙也有顯著正向關(guān)系；也有研究表明，在舌癌中，USP2a的表達(dá)與表皮生長因子(EGF)有關(guān)，其表達(dá)高于正常上皮，且與其臨床病理特征有關(guān)[26]。

2.3對喉癌及舌癌放療敏感性的影響 由于部分喉癌或舌癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，因此需要手術(shù)結(jié)合放療的綜合治療來提高患者的生存率；放療實(shí)施時(shí)需根據(jù)原發(fā)腫瘤部位、臨床分期、術(shù)后病理診斷和術(shù)后影像學(xué)評估確定照射靶區(qū)和劑量，喉癌與舌癌對放療的耐受性是影響其預(yù)后的主要因素。乳腺癌易感基因相互作用蛋白1(BRCA1，BAP1，又稱UCHL2)為UCHs家族的去泛素化酶，可以調(diào)節(jié)多個(gè)細(xì)胞過程，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄、DNA損傷反應(yīng)和抵抗腫瘤的放療作用。BAP1的突變可以增加喉癌與舌癌細(xì)胞對于放療的敏感性，導(dǎo)致腫瘤易感綜合征，與體內(nèi)的高危型人乳頭瘤病毒(HPV)和p53抑癌蛋白的狀態(tài)無關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),放療后BAP1敲除的舌癌與喉癌細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)相比對照組顯著降低，其對放療的敏感性升高，并且這種敏感性可通過強(qiáng)制再表達(dá)而逆轉(zhuǎn)[27]。BAP1可通過去泛素化組蛋白H2A增強(qiáng)其穩(wěn)定性使其表達(dá)水平升高，從而干擾雙鏈斷裂處的染色質(zhì)和組蛋白修飾，使細(xì)胞增殖速度降低以增加放療的敏感性[28]。

2.4對喉癌與舌癌內(nèi)免疫機(jī)制的影響 癌癥被認(rèn)為是一種免疫抑制性疾病，其特征在于免疫細(xì)胞功能失調(diào)和細(xì)胞因子排泄障礙[29]。EB病毒(EBV)與喉癌、舌癌的發(fā)生緊密相關(guān)[30,31]，去泛素化酶BPLF1是EBV內(nèi)最大的蛋白質(zhì)，在其它蛋白N端區(qū)域的前205個(gè)氨基酸中存在去泛素化酶活性，它的去泛素化活動(dòng)可以裂解K63和K48多聚泛素鏈，這兩種調(diào)節(jié)功能在防止病毒蛋白質(zhì)降解中發(fā)揮作用[32]。BPLF1敲除的EBV病毒，其基因組的復(fù)制量及傳染性降低。EBV的BPLF1蛋白及其保守的去泛素化活性調(diào)節(jié)細(xì)胞DNA修復(fù)酶聚合酶并將其募集到潛在的病毒破壞和復(fù)制位點(diǎn)，從而增強(qiáng)生產(chǎn)出傳染性病毒的能力。BPLF1可以通過去泛素化穩(wěn)定EBV病毒的聚合酶Pol使得EBV病毒在感染人體DNA后容錯(cuò)率變高，使病毒的DNA在損傷部位可以繼續(xù)復(fù)制，從而增加了病毒的感染性[33]。研究發(fā)現(xiàn)BPLF1能夠與TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)相互作用并使其去泛素化，抑制溶菌性感染期間的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)[34]，增強(qiáng)病毒的傳染性，喉癌與舌癌的形成均與EBV病毒緊密相關(guān)，BPLF1的存在可能促進(jìn)喉癌與舌癌發(fā)展。

在舌癌組織中，泛素特異性肽酶9X(ubiquitin-specific protease 9X,USP9X)上調(diào)可以導(dǎo)致程序性死亡受體-配體1(PD-L1)去泛素化并穩(wěn)定表達(dá)，PD-L1抑制T細(xì)胞的活化和增殖使得癌細(xì)胞逃脫了T細(xì)胞免疫監(jiān)視，阻止USP9X定位PD-L1可能是治療舌癌的有效策略，尤其是轉(zhuǎn)移性腫瘤[35]。

去泛素化酶頭帕腫瘤綜合征蛋白(CYLD)屬于USPs去泛素蛋白酶家族，在舌癌中它的缺失可以激活NF-κB和MAPK信號(hào)通路。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子可促進(jìn)細(xì)胞存活并誘導(dǎo)體內(nèi)對病原體，如：病毒或細(xì)菌病原體，炎性細(xì)胞因子的先天性和適應(yīng)性免疫，使其在癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中被異常激活。CYLD的主要靶標(biāo)是由NF-κB必須調(diào)節(jié)蛋白(NEMO)和細(xì)胞因子反應(yīng)性IκB激酶(IKK)復(fù)合體亞基IKK-γ共同介導(dǎo)的經(jīng)典NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)，CYLD使NEMO去泛素化，阻止了IKK復(fù)合物磷酸化IκB和NF-κB活化[36]，從而降低了腫瘤的異常激活(舌癌)，CYLD的缺失也可以通過促進(jìn)ALK5以穩(wěn)定NF-κB來增加舌癌的侵襲性。

2.5去泛素化酶對于舌癌與喉癌的治療作用 隨著泛素化酶成為臨床中治療腫瘤的靶點(diǎn)，人們越來越關(guān)注去泛素化酶靶向藥物在癌癥治療中的應(yīng)用，由于大多數(shù)去泛素化酶是半胱氨酸酶，使其更易成為候選藥物。去泛素化酶抑制劑的作用在于：①增加多泛素化蛋白分子的聚集；②減少單泛素化的部分；③改變一些分子活性，尤其是去泛素化酶介導(dǎo)的致癌蛋白持續(xù)存在[37]。抑制去泛素化酶會(huì)導(dǎo)致蛋白酶體功能受損和功能折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)聚集，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞毒性和死亡[38]。一些去泛素化酶與癌癥有關(guān)，可用作新型抑制劑的靶標(biāo)[39，40]，目前，通過篩選去泛素化酶抑制劑庫，經(jīng)過測試發(fā)現(xiàn)化合物2X-0324被確認(rèn)對喉癌具有潛在的放射增敏功效(RER>1～1.86)。Vif1和Vif2是去泛素化酶USP7的蛋白酶抑制劑，可以調(diào)節(jié)p53介導(dǎo)的抗癌作用，有潛力成為治療喉癌的分子靶向藥物[41]。氮雜環(huán)庚烷-4-酮(azepan-4-ones)和b-AP15是USP14與UCHL5的一種蛋白酶抑制劑，它們可以誘導(dǎo)高分子量的聚泛素蛋白的積累，從而導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)增強(qiáng)，二者均可以抑制口腔舌癌的發(fā)展[42]。在舌癌中b-AP15可以劑量依賴性顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長并增加細(xì)胞凋亡；在體外條件下，它們可以克服硼替佐米的耐藥性(Chen,2002)。

3 小結(jié)

去泛素化酶可以逆轉(zhuǎn)目標(biāo)蛋白的泛素化，使底物蛋白在泛素化和去泛素化之間保持平衡，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。去泛素化酶具有四種不同的作用機(jī)理：加工泛素蛋白前體，在泛素化過程中回收泛素分子，切割泛素蛋白鏈和逆轉(zhuǎn)泛素蛋白與底物的綴合[38]。去泛素化酶在體內(nèi)調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能，包括蛋白酶體依賴性的蛋白質(zhì)降解[38]、基因表達(dá)[43]、細(xì)胞周期進(jìn)程[44]、染色體分離[45]、DNA修復(fù)[46]以及細(xì)胞凋亡[47]等。USP22、USP7表達(dá)升高與喉癌不良的臨床預(yù)后有關(guān)，可以成為判斷腫瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物；BAP1的表達(dá)可以升高喉癌與舌癌的放療耐受性，是提高頭頸部鱗癌放療敏感性的潛在靶點(diǎn)；USP9X、USP14等去泛素化酶在口腔舌癌中表達(dá)量升高，且有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用；USP4的沉默可以抑制癌細(xì)胞的凋亡，增加了舌癌細(xì)胞持續(xù)存活率；作為免疫抑制性疾病，UXP9X、CYLD1及BPLF1通過免疫細(xì)胞的逃逸抑制機(jī)制或促進(jìn)病毒感染傳播的作用加速喉癌與舌癌腫瘤的發(fā)展；去泛素化酶因其結(jié)構(gòu)優(yōu)勢逐漸被認(rèn)為是癌癥的治療靶標(biāo)，去泛素化酶的抑制劑2X-0324、b-AP15等可能成為喉癌或舌癌新的治療策略。

目前，已有多種文獻(xiàn)報(bào)道去泛素化酶在喉癌與舌癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，包括：在腫瘤細(xì)胞組織中的異常表達(dá)、與放療和免疫機(jī)制緊密的相關(guān)性。雖然去泛素化酶調(diào)控下游效應(yīng)機(jī)制及功能尚不清晰，但作為治療喉癌與舌癌的潛在靶點(diǎn)，更好地研究這種調(diào)節(jié)機(jī)制在產(chǎn)生作用時(shí)的位點(diǎn)與靶向治療腫瘤時(shí)的副作用尤為重要。隨著去泛素化酶在喉癌與舌癌中的作用機(jī)制及功能研究的逐步加深，可以使去泛素化酶作為分子靶點(diǎn)治療癌癥成為可能。