參附強(qiáng)心丸對心腎綜合征模型大鼠心腎組織自噬蛋白Beclin-1 和LC3 表達(dá)的影響

商丹丹，李 旭，郝 迪，王 蕾，劉 淑

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617； 2.天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠，天津 300457； 3.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020）

心腎綜合征是心臟或腎臟由于急性或慢性功能障礙而導(dǎo)致另一器官急性或慢性功能損傷的臨床綜合征，多以難糾正的心力衰竭或腎功能衰竭為特點(diǎn)［1-2］。中醫(yī)認(rèn)為慢性心臟衰竭發(fā)展到終末期與心、腎兩臟關(guān)系最為緊密［3-4］。臨床研究顯示，從補(bǔ)氣溫陽角度實(shí)現(xiàn)對患者的治療，從而能夠延緩疾病的發(fā)展進(jìn)程［5］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用實(shí)驗(yàn)性CRS 動物模型作為研究對象，采用“益氣溫陽、活血利水”法代表方參附強(qiáng)心丸作為受試藥物，求證了該藥調(diào)控心腎細(xì)胞自噬作用來延緩心腎共損疾病的發(fā)展進(jìn)程。

1 材料

1.1 儀器 電子天平（BSA124S-CW Sartorius 公司，德國），移液槍（Eppendorf 公司，法國），微量加樣吸頭（北京中衫金橋生物有限公司），－80 ℃低溫冰箱（青島海爾），4 ℃低溫冰箱（青島海爾），高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國），電泳儀、凝膠玻璃板、固定夾、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠），轉(zhuǎn)移脫色搖床NMYC-60（泰州諾米醫(yī)療科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑 參附強(qiáng)心丸（天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠，藥品規(guī)格：鋁塑薄膜袋，密封包裝，陰涼干燥貯藏，每袋裝2.7 g，批號7668002；大黃素和大黃分含量不得少于0.21 mg/g；有效期18 個月）；雷帕霉素（1 g，源葉生物，批號 H12J10J79598）；大鼠血管 緊 張 素 轉(zhuǎn) 換 酶 ELISA 試 劑 盒（SAB，EK1009，9J281l）；精氨酸加壓素 ELISA 試劑盒（SAB，EK2822，9J281l）；甲 狀 腺 素 ELISA 試 劑 盒（SAB，EK1787，9J281l）；細(xì)胞裂解液試劑盒（碧云天，產(chǎn)品編號：P00138）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型，碧云天，產(chǎn)品編號：P0010）；5X 蛋白上樣緩沖液（碧云天，產(chǎn)品編號：P0015）；Western 一抗稀釋液（碧云天，產(chǎn)品編號 ：P0023A）；Beclin -1 抗 體 （ABcloned， 批 號3507223001）；MAPLC3B 抗體（SAB，批號 6N26）；山羊抗兔抗體（博士德，批號201806）；山羊抗鼠抗體（博士德，批號201806）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（萬類生物，批號 17122220）。

1.3 動物 SD 種大鼠，60 只，雄性，體重 220～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，試驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。購入后動物活動正常，毛發(fā)柔順，飲食、飲水均正常。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組與給藥 采用腹主動脈縮窄合并腎臟急性缺血再灌注損傷制備心腎綜合征大鼠模型［6］。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射45 mg/kg 麻醉后，行腹部正中切開，沿腹白線進(jìn)入腹腔，暴露分離左、右側(cè)腎蒂，阻斷結(jié)扎30 min 后，解除阻斷，恢復(fù)血流，造成急性缺血再灌注損傷。隨后暴露分離后腹膜，在左腎動脈上方游離腹主動脈。沿游離腹主動脈長軸置一折彎的7 號針頭，以3-0 的絲線繞腹主動脈后與7 號針頭一起結(jié)扎，隨后立即抽出針頭，使腹主動脈殘留直徑為0.7 mm 的殘腔，造成腹主動脈狹窄。假手術(shù)組只分離肌肉、血管，但不縮窄。術(shù)后腹腔內(nèi)滴入青霉素預(yù)防感染，分層關(guān)閉腹腔。將造模后12 周將存活動物按體重隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組（n=10）、模型對照組（n=10）、參附強(qiáng)心丸高劑量組（n=10；灌胃劑量為3.24 g/kg，相當(dāng)于臨床用量12 倍）、參附強(qiáng)心丸低劑量組（n=10；灌胃劑量為1.62 g/kg，相當(dāng)于臨床用量6 倍）和雷帕霉素組（n=10；灌胃劑量為2 mg/kg）。灌胃體積10 ml/kg，假手術(shù)組和模型組灌胃同體積飲用水。所有組別均從手術(shù)后8 周開始給藥，1 次/d，持續(xù)4 周。參附強(qiáng)心丸和雷帕霉素均采用純凈水進(jìn)行配制，每天配制1 次。

2.2 指標(biāo)檢測

2.2.1 血清中血管緊張素、甲狀腺激素及精氨酸加壓素測定的影響 于末次給藥24 h 后大鼠經(jīng)麻醉，腹主動脈取血，于3 500 r/min 離心10 min 后，取血清測定血管緊張素、甲狀腺激素及精氨酸加壓素的含量。

2.2.2 心室及腎臟重量指數(shù)的影響 取血完成后，分別將大鼠心臟及左腎臟取出，分離心室，稱量心室濕質(zhì)量、全心濕質(zhì)量、左腎臟濕質(zhì)量，計算心室指數(shù)、全心指數(shù)、左側(cè)腎臟指數(shù)。計算公式如下：心室指數(shù)=心室肌濕重/體質(zhì)量×100%，全心指數(shù)=全心肌濕重/體質(zhì)量×100%，左腎指數(shù)=左腎臟濕重/體質(zhì)量×100%。

2.2.3 心臟、腎臟LC3 和Beclin-1 蛋白的表達(dá) 取血完成后，分別將大鼠心臟及左腎臟取出，分離心室和左腎，切半，一半凍存于-80 ℃冰箱中，待測備用，采用蛋白質(zhì)印跡法（western blotting）進(jìn)行測定。具體步驟：提取心室和左腎的總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，充分勻漿，取上清液加入緩沖液，加熱。取等量蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜，7% 脫脂奶粉封閉后，一抗4 ℃孵育過夜，洗滌，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育1 h，洗滌，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑，顯影，定影，分析條帶光密度值。以目的條帶與內(nèi)參β-action 條帶的光密度值的比值作為衡量參數(shù)，分析LC3 和Beclin-1 蛋白的表達(dá)量［7］。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s 表示。假手術(shù)組和模型對照組比較采用t 檢驗(yàn)，模型對照組與給藥各組之間比較采用方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清中血管緊張素、甲狀腺激素及精氨酸加壓素測定結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠血清中血管緊張素（ACE）水平顯著增加，甲狀腺激素（fT3）及精氨酸加壓素（AVP）水平顯著降低（P＜0.01）。與模型對照組比較，參附強(qiáng)心丸高劑量組大鼠血清中激素水平均明顯改善（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠血清血管緊張素、甲狀腺素和精氨酸加壓素含量測定結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠血清血管緊張素、甲狀腺素和精氨酸加壓素含量測定結(jié)果（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) ACE（ng/ml） fT3（pg/ml） AVP（pg/ml）假手術(shù) 10 0.086±0.020 2.214±1.114 2 532.468±1 442.549模型對照 7 0.432±0.184** 0.743±0.322** 517.236±203.246**參附強(qiáng)心丸高劑量 8 0.214±0.043# 1.871±0.386## 2 183.680±1 481.680##參附強(qiáng)心丸低劑量 8 0.280±0.080 1.415±0.439 1 665.222±1 157.243雷帕霉素（RP） 8 0.285±0.126 1.153±0.484 1 442.334±1 263.106

3.2 各組動物心臟及腎臟重量指數(shù) 與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠全心指數(shù)和左腎指數(shù)均顯著增加（P＜0.05），說明該模型方法對心腎組織病理的發(fā)生進(jìn)程均有影響。與模型對照組比較，參附強(qiáng)心丸高劑量組大鼠全心指數(shù)和左腎指數(shù)均降低顯著（P＜0.01，P＜0.05），說明給藥后可明顯改善心肌肥厚，腎臟腫大的狀態(tài)。見表2。

3.3 心臟、腎臟LC3 和Beclin-1 蛋白的表達(dá) 與假手術(shù)組（Sham）比較，模型對照組（model）心腎組織中LC3的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），給予參附強(qiáng)心丸高劑量組后，心腎組織中LC3 的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)（P＜0.05）。而對于Beclin-1 的表達(dá)，心腎組織中的表達(dá)明顯不同，模型對照組心臟中的Beclin-1 表達(dá)較假手術(shù)組明顯上調(diào)（P＜0.05），而腎臟中的 Beclin-1 的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），說明在心腎同病的病理狀態(tài)下，Beclin-1 的調(diào)控在兩種組織中有所不同。給予參附強(qiáng)心丸高劑量（SFQX-H）組后，Beclin-1 的表達(dá)與假手術(shù)組相近，與模型對照組具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。數(shù)據(jù)見圖1。

表2 各組大鼠心臟腎臟組織重量指數(shù)結(jié)果（±s）

表2 各組大鼠心臟腎臟組織重量指數(shù)結(jié)果（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) 心臟指數(shù)（g/100 g） 腎臟指數(shù)（g/100 g）假手術(shù) 10 0.247±0.537 0.268±0.066模型對照 7 0.430±0.089** 0.341±0.034*參附強(qiáng)心丸高劑量 8 0.299±0.022## 0.268±0.022#參附強(qiáng)心丸低劑量 8 0.346±0.020# 0.310±0.042雷帕霉素（RP） 8 0.352±0.051# 0.323±0.070

圖1 各組大鼠心臟、腎臟LC3、Beclin-1 蛋白的表達(dá)結(jié)果

3 討論

心腎綜合征是心臟和腎臟由于一種器官急性或慢性功能不全而導(dǎo)致另一器官急性或慢性功能損害的臨床綜合征，以尿量顯著減少、頑固性水腫、喘憋不能平臥等為主要臨床表現(xiàn)，多以難糾正的心力衰竭或腎衰竭為其主要特點(diǎn)［8］。參附強(qiáng)心丸是天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠研制的國家中藥保護(hù)品種，具有益氣助陽，強(qiáng)心利水功效，臨床用于慢性心力衰竭，屬心腎陽衰者治療藥物［9-10］。本實(shí)驗(yàn)旨在闡明“益氣溫陽，活血利水”治法對心腎共損后治療機(jī)制與調(diào)控心腎組織細(xì)胞自噬通路有關(guān)。并為CRS 臨床用藥提供了重要的藥理學(xué)參考。

研究表明，肌體組織受到損傷后，會通過激活自噬或者凋亡來維持內(nèi)環(huán)境的氧化還原穩(wěn)態(tài)［11］。細(xì)胞中的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵因子［12］。mTOR 的活化狀態(tài)抑制細(xì)胞的自噬作用。Beclin-1 也是近年發(fā)現(xiàn)參與自噬調(diào)控的蛋白之一［13-15］，Beclin-1 表達(dá)的增加被認(rèn)為是一種應(yīng)激反應(yīng)，其作為自噬表達(dá)產(chǎn)物的變化反映了細(xì)胞代謝的異常，Beclin-1 也成為人工干預(yù)自噬活性的靶點(diǎn)之一。本研究采用參附強(qiáng)心丸對實(shí)驗(yàn)性心腎綜合征大鼠模型進(jìn)行了調(diào)控細(xì)胞自噬作用機(jī)制的探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該藥明顯改善模型大鼠心腎組織中自噬相關(guān)因子LC3 和自噬基因Beclin-1 的表達(dá)，這也進(jìn)一步詮釋參附強(qiáng)心丸在治療心腎共損疾病中的作用機(jī)制，明確揭示了“益氣溫陽、活血利水”的方藥能通過調(diào)控細(xì)胞自噬以達(dá)到抑制心腎衰竭的作用。這為參附強(qiáng)心丸調(diào)控心腎組織細(xì)胞自噬作用治療機(jī)制提供了基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)支持。