超高效液相色譜法測(cè)定不同廠家丹皮酚軟膏中丹皮酚的含量

張作華，趙新紅，范 姍，李 珂

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 藥學(xué)院，山東 泰安，271016）

丹皮酚是牡丹皮的主要化學(xué)成分之一，具有保肝、護(hù)腎、抗炎、鎮(zhèn)定、降溫、解熱、鎮(zhèn)痛、解痙等多種藥理作用[1]。丹皮酚軟膏是由丹皮酚和丁香油組成的軟膏制劑，其主要成分為丹皮酚，主要用于皮膚濕疹、皮炎、皮膚瘙癢等各種皮膚疾病的治療，具有抗過敏、消炎、止癢等作用[2]。該軟膏制劑在衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十冊(cè)中，采用紫外分光光度法測(cè)定丹皮酚的含量[3]，劉錄等[4]采用高效液相色譜法測(cè)定丹皮酚軟膏中丹皮酚的含量，本實(shí)驗(yàn)則采用超高效液相色譜法測(cè)定丹皮酚軟膏中丹皮酚的含量。該法與高效液相色譜法相比，分析速度更快、時(shí)間更短、靈敏度更高，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，且其實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于丹皮酚軟膏的質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

島津 Nexera X2 型超高效液相色譜儀、LC-30AD 溶液輸送單元、SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、光電二極管陣列紫外可見光檢測(cè)器 SPD-M30A、CTO-20AC 柱溫箱、Labsolutions 色譜工作站，KQ-500E 型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)R224CN 型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司），有機(jī) 0.22μm 微孔過濾膜（津騰）。

Table 1 The compound paeonol cream from different manufacturers and batches 表 1 不同廠家及批次的丹皮酚軟膏

甲醇（色譜純，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司），水（娃哈哈飲用純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），丹皮酚對(duì)照品（批號(hào) 110708-200505，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所），丹皮酚軟膏廠家及批號(hào)見表 1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用 ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（體積比45 : 55），流速為 0.3 mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 274 nm，進(jìn)樣量 1 μL，柱溫 35 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取丹皮酚對(duì)照品約 5 mg，精密稱定，置于 25 mL 棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為 212 mg·L-1的丹皮酚對(duì)照品儲(chǔ)備液，于 4 ℃ 溫度下儲(chǔ)存，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取各批次丹皮酚軟膏約 10 mg，分別置于 10 mL 棕色量瓶中，加適量甲醇溶解搖勻，超聲 30 min，冷卻至室溫，加甲醇定容，搖勻，并用 0.22 μm 濾膜過濾，備用。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

取不含丹皮酚的軟膏約 10 mg，精密稱定，置于 10 mL 棕色量瓶中，同供試品溶液制備方法，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液，備用。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取上述對(duì)照品溶液（21.2 mg·L-1），供試品溶液（9.9 mg·L-1），陰性對(duì)照溶液各 1 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明，在丹皮酚色譜峰位置處，陰性對(duì)照溶液無吸收，說明丹皮酚軟膏中的其他物質(zhì)不干擾丹皮酚的含量測(cè)定，色譜圖見圖 1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 和 4 mL 分別置于 10 mL 棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，得到 1.06、2.12、5.30、10.60、21.20、42.40 和 84.80 mg·L-1的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液各 1 μL，注入液相色譜儀中，記錄峰面積。以系列對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到線性方程為 A = 1.606 8 × 104C + 1.009 9 × 104，r = 0.999 2。結(jié)果表明丹皮酚在濃度為 1.06～84.80 mg·L-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取濃度為 10.60 mg·L-1的對(duì)照品溶液 1 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積，計(jì)算 RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹皮酚峰面積的 RSD 為 0.2%，表明該方法的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取 5 號(hào)丹皮酚軟膏約 10 mg 于 10 mL 棕色量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品處理方 法制得供試品溶液，并吸取制得的供試品溶液 0.5 mL 于 5 mL 量瓶，加甲醇定容至刻度線，搖勻，分別于 2、4、6、8、12 和 24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算 RSD。計(jì)算得到峰面積的 RSD 為 0.3%，表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

Fig. 1 UPLC chromatograms of methanol (A), paeonol reference substance (B), paeonol ointment (C) and negative control solution (D) 圖 1 甲醇（A）、丹皮酚對(duì)照品（B）、丹皮酚軟膏（C）、陰性對(duì)照溶液（D）的UPLC色譜圖

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品 6 份（長(zhǎng)春英平藥業(yè)有限公司，批號(hào)18080547），按“2.2.2”項(xiàng)下供試品處理方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣 1μL，記錄峰面積，將峰面積代入線性方程，計(jì)算丹皮酚軟膏中丹皮酚的含量，得到丹皮酚質(zhì)量濃度的 RSD 為 1.8%，小于 3%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取 3 份已知含量的丹皮酚軟膏（丹皮酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 51.60 mg·g-1）約 15 mg 于 25 mL 棕色量瓶中，分別加入供試品含量 80%、100%、120% 的丹皮酚對(duì)照品，各個(gè)濃度樣品進(jìn)樣 3 針，計(jì)算加標(biāo)回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 2。結(jié)果表明，三個(gè)濃度下的平均回收率分別為 104.3%、100.9%、98.3%，RSD 值均小于 3%，該方法的準(zhǔn)確度較高。

Table 2 The determination results of recovery 表 2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9 含量測(cè)定結(jié)果

精密稱取 1～6 號(hào)丹皮酚軟膏 15.70、13.20、10.10、13.80、12.40 和 13.30 mg，分別置于10 mL 棕色量瓶中，按上述樣品處理方法處理制備供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法測(cè)定各批次丹皮酚的含量，含量測(cè)定結(jié)果如表 3。

Table 3 Contents of paeonol in compound paeonol cream from different manufacturers and batches 表 3 不同廠家及批次丹皮酚軟膏中丹皮酚含量

3 討論

本實(shí)驗(yàn)比較了不同流動(dòng)相比例對(duì)色譜峰的影響，甲醇-水體積比分別為 40 : 60、45 : 55、55 : 45、60 : 40、65 : 35、70 : 30，并對(duì)液相系統(tǒng)的進(jìn)樣量 1、2、5 和 10μL 進(jìn)行比較。結(jié)果表明，流動(dòng)相比例為甲醇-水（體積比 45 : 55），進(jìn)樣量為 1μL 時(shí)，其色譜峰的峰形最好，柱效最高，且丹皮酚軟膏中的其他物質(zhì)與丹皮酚分離良好，不影響丹皮酚的含量測(cè)定。

不同廠家丹皮酚軟膏中丹皮酚含量測(cè)定結(jié)果顯示，山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司所制軟膏中所含的丹皮酚含量較高，長(zhǎng)春普華制藥股份有限公司所制軟膏中所含丹皮酚相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜法測(cè)定丹皮酚軟膏中丹皮酚的含量，大大縮短了分析時(shí)間，提高了分析速度，且該含量測(cè)定方法的重復(fù)性較好，靈敏度也較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。因此，該方法可為丹皮酚軟膏的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供有益參考。