脂質(zhì)體主動載藥技術(shù)研究進展

顧華芳，徐 歌，朱柯武，沈潤溥，席眉揚，周艷艷，駱 翔*

（1. 紹興文理學院，浙江 紹興，312000；2. 浙江創(chuàng)新生物有限公司，浙江 紹興，312000）

自從 1964 年 Bangham 發(fā)現(xiàn)并報道了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)以來[1-2]，由于其良好的生物相容性[3-5]、體內(nèi)可降解性[6-8]與腫瘤靶向性[9-13]等優(yōu)點，已經(jīng)越來越被視為靶向藥物傳遞系統(tǒng)的理想載體。然而，在當前產(chǎn)業(yè)化過程中，影響脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)的主要障礙是穩(wěn)定性不理想、載藥量不夠高、藥物易滲漏等[14-19]。另外，脂質(zhì)體主動載藥技術(shù)易于實現(xiàn)，其制備工藝簡單。兩親性藥物通過主動載藥的方式被包封后，其包封率一般 ＞ 80 %，因此無需清除游離藥物。此法適合于在生理 pH 條件下具有一定脂溶性的兩親性藥物，其 pKa 應(yīng)在人生理 pH 范圍之內(nèi)，以便能夠得到較高的包封率。跨膜梯度主動載藥法主要有 pH 梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度法、離子載體建立梯度法。近年來，隨著對脂質(zhì)體主動載藥技術(shù)（Remote/Active loading）的深入研究和廣泛應(yīng)用，研究人員發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能夠制備高載藥量和高包封率的脂質(zhì)體，并顯著提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，減少藥物泄露[20-25]。如圖1所示，采用 PubMed 數(shù)據(jù)庫，以“remote loading”or“active loading”為關(guān)鍵詞進行搜索，相關(guān)文獻數(shù)量呈現(xiàn)增長趨勢。因此，脂質(zhì)體主動載藥技術(shù)的優(yōu)越性已經(jīng)引起了越來越多研究者的關(guān)注，并成為制備脂質(zhì)體過程的首選方法[26-30]。

1 主動載藥簡介

1.1 主動載藥歷史

眾所周知，弱酸或弱堿的中性分子形式可以跨越脂質(zhì)雙層膜，而其解離形式卻不能。早期研究中，Jacobs 等對紅細胞膜滲透性的研究，以及 Chappel 和 Crofts 對線粒體膜和葉綠體膜的研究，論證了當膜兩側(cè)存在跨膜 pH 梯度時，羧酸、醋酸和胺等以中性分子形式可以快速穿越磷脂雙分子層促使跨膜濃度梯度的形成和維持[31-33]。1976 年，Nichols 和 Deamer 等[34]首次采用 pH 梯度法主動載藥技術(shù)制備了兒茶酚胺脂質(zhì)體。1989 年，Gabizon 等[35]利用硫酸銨梯度法主動載藥技術(shù)制備了兩種不同膜材的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體。此后，有研究者采用了 Ca2+[36-38]、Mg2+[39-41]、Mn2+[42-44]、Cu2+[45-47]、Na+-K+[48-51]等一系列離子梯度主動載藥技術(shù)制備脂質(zhì)體。

Fig. 1 Statistical results of literatures on active drug delivery technology of liposomes, 1973-2020 圖 1 1973-2020年脂質(zhì)體主動載藥技術(shù)相關(guān)文獻數(shù)統(tǒng)計結(jié)果

1.2 主動載藥主要方法

1.2.1 pH 梯度法[52]

pH 梯度法（pH gradient method）是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)體內(nèi)外水相的酸堿性，從而建立一定的跨膜 pH 梯度差，利用弱酸或弱堿性藥物在不同 pH 環(huán)境中解離狀態(tài)的差異，使藥物在外水相中以分子型低極性狀態(tài)存在。當建立了 pH 梯度的脂質(zhì)體在接近或超過相變溫度時，磷脂雙分子層由排列有序的“膠晶態(tài)”（Gel crystalline phase）向無序的“液晶態(tài)”（Liquid crystalline phase）過渡中，磷脂脂肪鏈中的“全反式構(gòu)象”碳-碳單鍵轉(zhuǎn)換為“鄰位交叉式構(gòu)象”，使脂肪鏈轉(zhuǎn)動半徑大幅增加，導(dǎo)致脂質(zhì)體膜流動性與通透性增大，有利于分子型藥物滲透穿過磷脂雙分子層，以高極性的離子型藥物穩(wěn)定包封于脂質(zhì)體的內(nèi)水相中[53]。

Fig. 2 Principle of active drug loading by pH gradient method (D, weak alkaline drug; H+, hydrogen ion) 圖 2 pH 梯度法主動載藥原理（D，弱堿性藥物；H+，氫離子）

1.2.2 硫酸銨梯度法[35]

硫酸銨梯度法（Ammonium sulfate gradient method）適用于兩親弱堿性藥物，特別是蒽醌類抗腫瘤藥物（如多柔比星[54]、表柔比星[55]、柔紅霉素[56]、米托蒽醌[57]）。硫酸銨梯度法的作用機理較復(fù)雜，現(xiàn)主要有兩種解釋[58]：①化學平衡驅(qū)動。由于硫酸銨電離和水解產(chǎn)生的分子及離子對磷脂雙分子層的滲透系數(shù)不同，H＋的滲透系數(shù)較?。?0-3～10-5cm·s-1），而 NH3具備較大的滲透系數(shù)（0.13 cm·s-1），因此，NH3能快速擴散至外水相，而 H＋的幾乎不能通過磷脂雙分子層，滯留在內(nèi)水相。通過降低外水相 NH3的濃度，促使內(nèi)水相的 NH3不斷外溢和 H＋逐漸累積，間接形成“內(nèi)酸外堿”的 pH 梯度，通過控制[NH4＋]out/ [NH4＋]in可以調(diào)整梯度大小。當兩親性弱堿藥物進入脂質(zhì)體內(nèi)水相后，弱堿性藥物離子化過程消耗大量 H＋，促使內(nèi)水相 pH 升高，導(dǎo)致更多 NH3外溢，不斷推動藥物載入脂質(zhì)體，直至脂質(zhì)體內(nèi)水相 NH4＋耗竭；②擴散電勢驅(qū)動。隨著內(nèi)水相 NH3的快速溢出，H＋也能夠產(chǎn)生向外水相擴散的趨勢，形成“內(nèi)正外負”的跨膜擴散電勢，驅(qū)動弱堿性藥物跨膜并聚集在內(nèi)水相，這可以部分解釋用硫酸銨梯度法使蒽醌類藥物聚集到脂質(zhì)體中的動力學過程為什么比單純使內(nèi)水相酸化的脂質(zhì)體（pH 梯度法）包封慢。近年來，以硫酸銨梯度法為基礎(chǔ)的銨梯度法發(fā)展迅速，并且逐漸衍生出蔗糖八硫酸酯三乙胺梯度法[59]、NH4EDTA 梯度法[60]等。

Fig. 3 Principle of active drug loading with ammonium sulfate gradient 圖 3 硫酸銨梯度法主動載藥原理

1.2.3 醋酸鈣梯度法[36]

醋酸鈣梯度法（Calcium acetate gradient method）通過透析、超濾、離子交換等方法將外水相中的醋酸鈣除去，形成跨膜醋酸鈣濃度梯度，通過醋酸鈣電離和水解，促使大量醋酸分子（HAc）從濃度較高脂質(zhì)體內(nèi)水相擴散至濃度較低的外水相，升高脂質(zhì)體內(nèi)水相 pH，間接產(chǎn)生跨膜 pH 梯度。HAc 的滲透參數(shù)（6.6 × 10-4cm·s-1）是 Ca2+（2.5 × 10-11cm·s-1）的 2 640 萬倍，所以相較于 HAc，Ca2+幾乎不能穿越磷脂雙分子層，而保留在脂質(zhì)體內(nèi)部，HAc 則參與了質(zhì)子轉(zhuǎn)運。醋酸鈣跨膜濃度梯度的建立（內(nèi)部的濃度高于外部），導(dǎo)致 HAc 攜帶大量質(zhì)子從脂質(zhì)體的內(nèi)部轉(zhuǎn)運到外部產(chǎn)生內(nèi)堿外酸的 pH 環(huán)境，而該 pH 環(huán)境為裝載和聚集弱酸藥物提供了高效的驅(qū)動力。

Fig. 4 Principle of active drug loading with calcium acetate gradient 圖 4 醋酸鈣梯度法主動載藥原理

1.2.4 離子載體建立梯度法

纈氨霉素（Valinomycin）能夠使 K+擴散系數(shù)提高，而不提高 Na+的擴散系數(shù)來形成 Na+/ K+梯度[61]；尼日利亞菌素（Nigrericin）專一性催化 K+和質(zhì)子間的轉(zhuǎn)化[45]；卡西霉素 A23187（Calcimycin）[46,62,63]和離子霉素（Ionomycin）[64]選擇性的催化二價金屬離子（Ca2+，Mg2+，Mn2+，F(xiàn)e2+等）和質(zhì)子間的交換；拉沙里菌素（lasolocid A）可以催化從一價到三價的各種離子與質(zhì)子間的交換[65]。

Fig. 5 Principle of active drug loading by ion carrier gradient method 圖 5 離子載體梯度法主動載藥原理

2 主動載藥的影響因素

眾多研究者為了尋找最優(yōu)的主動載藥條件，針對不同的主動載藥方法和條件進行了考察。通過對近年來國內(nèi)外脂質(zhì)體主動載藥的文獻進行分析，我們歸納出以下一些共性的關(guān)鍵條件。

2.1 跨膜梯度

根據(jù) Henderson-Hasselbalch 理論[66-67]，每個 pH 單位的變化，會產(chǎn)生分子型與離子型藥物濃度比值 10 倍的變化，當脂質(zhì)體存在 3 個單位的跨膜 pH 梯度時，理論上能夠維持藥物分子與離子濃度的 1 000 倍之差。同理，對于硫酸銨梯度和醋酸鈣梯度也符合此理論。

有文獻報道[36,58,68]，跨膜梯度是影響脂質(zhì)體包封率的最主要因素，通常梯度越大，產(chǎn)生的跨膜驅(qū)動力越大，載入脂質(zhì)體內(nèi)的藥物越多，脂質(zhì)體包封率也越高。制備馬來酸匹杉瓊脂質(zhì)體時，當跨膜 pH 梯度差為 3～4 時，脂質(zhì)體包封率達到 80% 以上；但當跨膜 pH 梯度差 ≤ 2 時，脂質(zhì)體包封率不足 40%[69]；多柔比星脂質(zhì)體也具有相似的包封效果，當跨膜 pH 梯度差達到 3.5 時，藥物包封率超過 98%[68]。適當降低內(nèi)水相緩沖液的 pH 可增大 pH 梯度，但過強的酸性環(huán)境易造成藥物和磷脂的水解，導(dǎo)致脂質(zhì)體的不穩(wěn)定[70]。

2.2 孵育溫度和時間

雖然 Arrhenius 方程[71]常用于解釋化學動力學過程，但是對于脂質(zhì)體主動載藥過程同樣適用?？捎?lnk = -Ea/RT + lnA 式中，k 為速率常數(shù)，R 為摩爾氣體常數(shù)，T 為熱力學溫度，A 為指前因子（也稱頻率因子），Ea 為表觀活化能。對于脂質(zhì)體主動載藥過程，k 可視為脂質(zhì)體裝載藥物的速率常數(shù)，Ea 可認為是藥物跨越磷脂雙分子層的活化能，即跨膜活化能。對于確定的脂質(zhì)體處方組成和裝載藥物，Ea（跨膜活化能）為定值，當T（孵育溫度）升高時，k（載藥速率）增大，載藥時間縮短，脂質(zhì)體也較快達到載藥平衡[72]。

當孵育溫度大于脂質(zhì)體的相變溫度時，磷脂雙分子層的通透性增加，可以促進載藥。但通透性的增加也造成了載藥時 pH 梯度的破壞。因此，國外有人加入乙醇，并在 37 ℃ 條件下進行載藥，最終取得了良好的效果[73]。

王紹寧等[74]考察了在不同溫度條件下孵育對鹽酸環(huán)丙沙星脂質(zhì)體包封率的影響。實驗結(jié)果表明，當孵育時間固定時，鹽酸環(huán)丙沙星脂質(zhì)體的包封率隨孵育溫度的升高而增大，但當溫度超過50 ℃ 以后，其包封率便趨于穩(wěn)定。

鄧意輝等[75]研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體進行鹽酸小檗堿 pH 梯度載藥時，當孵育溫度為 60～70 ℃ 時，脂質(zhì)體包封率隨著孵育溫度升高而增大，當孵育溫度達到 80 ℃ 時，脂質(zhì)體包封率下降。隨著孵育時間的延長，脂質(zhì)體包封率逐漸增大，當孵育時間超過 20 min，脂質(zhì)體包封率趨于穩(wěn)定。

Chou 等[76]采用 pH 梯度法制備伊立替康脂質(zhì)體，在 40 ℃ 時孵育 5 min，脂質(zhì)體中伊立體康的裝載量即達到最大值，當孵育時間為 30 min 時裝載量趨于平衡，脂質(zhì)體包封率達 97% 以上。

2.3 藥脂比

藥脂比與脂質(zhì)體的包封率存在密切聯(lián)系，通常隨著藥脂比的降低，單個脂質(zhì)體內(nèi)裝載的藥物減少，藥物更容易包封入脂質(zhì)體[74]。

王紹寧等[74]采用硫酸銨梯度法制備鹽酸環(huán)丙沙星脂質(zhì)體，當藥脂比小于 0.2（w / w）時，加入的鹽酸環(huán)丙沙星較少，對內(nèi)水相中 H+和 SO42-的濃度改變較小，硫酸銨梯度法制備了高包封率的鹽酸環(huán)丙沙星脂質(zhì)體；但繼續(xù)增大藥脂比后，硫酸銨梯度不能有效維持，導(dǎo)致脂質(zhì)體包封率顯著下降。

Tatsuaki 等[77]分別采用硫酸銨梯度法和 pH 梯度法（枸櫞酸緩沖液）制備多柔比星溫敏脂質(zhì)體。硫酸銨梯度法制備的多柔比星脂質(zhì)體隨著藥脂比的降低而增加，當藥脂比為 1/40（w/w）時，多柔比星包封率接近 100%；利用 pH 梯度法制備多柔比星脂質(zhì)體時，藥脂比為 1/20（w/w）時，多柔比星包封率達到最大值，當包封率繼續(xù)增加至 1/40（w/w）時，其包封率反而降低至 80% 左右。

牟琳琳等[78]研究發(fā)現(xiàn)藥脂比在 1/20～1/10（w/w）時，鹽酸小檗堿脂質(zhì)體包封率達 98% 以上；當藥脂比增大至 1/8（w/w）時，脂質(zhì)體包封率下降至 87%；當藥脂比增大至 1/5（w/w）時，脂質(zhì)體包封率僅為 62%。

Stensrud 等[79]研究發(fā)現(xiàn)，以 200 mmol·L-1枸櫞酸緩沖液（pH 4）作為水化介質(zhì)，采用 pH 梯度法制備伯氨喹脂質(zhì)體時，藥脂比對脂質(zhì)體包封率影響較大。當藥脂比低于 0.15（mol/mol）時，脂質(zhì)體包封率才能維持在 95% 以上。

王宇等[80]考察了不同質(zhì)量濃度的氫化大豆卵磷脂（Hydrogenated soy phosphatidylcholine， HSPC）對吉非替尼脂質(zhì)體包封率和穩(wěn)定性的影響，當 HSPC 在質(zhì)量濃度為 50g·L-1時，藥脂比為1/10（w/w），脂質(zhì)體的包封率最高，當磷脂濃度更高時脂質(zhì)體不穩(wěn)定，容易形成沉淀。

2.4 外水相 pH 調(diào)節(jié)劑

外水相 pH 調(diào)節(jié)劑通過中和外水相弱酸或弱堿，使外水相保持中性狀態(tài)。由于磷脂分子中存在對堿性條件敏感的酯鍵，因此不宜將外水相 pH 調(diào)至堿性。

鄧意輝等[81]嘗試采用 NaOH 或 Na2CO3作為外水相 pH 調(diào)節(jié)劑，由于 NaOH 是一元強堿，加入脂質(zhì)體外水相時，易造成局部堿性過高，導(dǎo)致磷脂快速降解，不利于脂質(zhì)體的穩(wěn)定；而 Na2CO3調(diào)節(jié)過程中易產(chǎn)生 CO2，造成藥物損失；因此，研究者選擇采用 Na2HPO4作為外水相 pH 調(diào)節(jié)劑。牟琳琳等[78]采用 pH 梯度法制備鹽酸小檗堿脂質(zhì)體時，以 NaHCO3調(diào)節(jié)外水相 pH 至 7.0（跨膜 pH 梯度為 3.0），由于其緩沖能力小，加入鹽酸小檗堿溶液（顯酸性）后，跨膜 pH 梯度減小，無法有效驅(qū)動藥物進入脂質(zhì)體，鹽酸小檗堿脂質(zhì)體包封率僅為 85 ± 1.52%。最終，研究者采用 Na3PO4緩沖液調(diào)節(jié)外水相 pH 至 7.0 進行載藥，結(jié)果脂質(zhì)體包封率達 95% 以上。

鄧意輝研究團隊后續(xù)多篇研究報道，均采用 Na3PO4溶液調(diào)節(jié)脂質(zhì)體外水相 pH 至中性，然后進行孵育載藥，獲得了高包封率的馬來酸匹杉瓊脂質(zhì)體[69,82,83]、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體[84-85]、鹽酸表柔比星脂質(zhì)體[86-87]等。

2.5 內(nèi)水相緩沖能力

隨著脂質(zhì)體主動載藥過程的進行，跨膜離子梯度會逐漸被消耗。因此，內(nèi)水相緩沖能力對載藥過程中跨膜離子梯度的維持具有重要作用，并顯著影響藥物的包封率。

She 等[69]制備馬來酸匹杉瓊脂質(zhì)體時，當枸櫞酸緩沖液濃度從 100 增至 300 mmol·L-1時，脂質(zhì)體包封率先升高后下降；當枸櫞酸緩沖液濃度為 200 mmol·L-1時，脂質(zhì)體包封率超過 97%，達到最大值。這說明枸櫞酸緩沖液濃度不宜過大，一方面，外水相大量的枸櫞酸根離子易與藥物形成低溶解度復(fù)合物，導(dǎo)致載藥過程受阻，脂質(zhì)體包封率下降；另一方面，高濃度的枸櫞酸易與血漿中 Ca2＋形成配合物，影響機體正常生理功能。

劉漢清等[88]考察了不同濃度硫酸銨溶液對苦參堿脂質(zhì)體主動載藥的影響。研究發(fā)現(xiàn)，硫酸銨濃度能夠顯著影響苦參堿脂質(zhì)體包封率，兩者之間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。必須注意的是，由于硫酸銨具有較高離子強度，當其濃度達到 250 mmol·L-1時，易破壞脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，導(dǎo)致脂質(zhì)體聚集。

李哲等[89]選用不同濃度的 NH4EDTA 作為水化介質(zhì)制備鹽酸伊立替康脂質(zhì)體。結(jié)果表明，當NH4EDTA 濃度在 200 mmol·L-1以下時，脂質(zhì)體包封率隨濃度的增大而增大，最高達到 91.23%；繼續(xù)增加 NH4EDTA 的濃度，脂質(zhì)體包封率基本不變，但粒徑增大并出現(xiàn)沉淀，穩(wěn)定性較差。Ma 等[60]同樣用 NH4EDTA 梯度法制備拓撲替康脂質(zhì)體，結(jié)果表明水化介質(zhì)濃度為 200 mmol·L-1時，脂質(zhì)體包封率達到最大。

2.6 藥物 Log P 值和 pKa 值

在確定脂質(zhì)體處方和制備工藝的情況下，藥物的性質(zhì)對脂質(zhì)體的包封率有重要影響，主要包括：（1）油水分配系數(shù)（Log P），指示藥物在脂-水兩相中的溶解度[90-91]；（2）解離常數(shù)（pKa），指示藥物的解離能力和極性[92-93]。

Haran 等[58]比較了吖啶橙、柔紅霉素、表柔比星和多柔比星 4 種化合物制備成脂質(zhì)體后的包封率。結(jié)果表明，吖啶橙 pKa 較高（約 9.25），外水相中性條件下，其多以分子型存在，能迅速穿越磷脂雙分子層并在內(nèi)水相酸性條件下離子化，穩(wěn)定包封于脂質(zhì)體；其他 3 種藥物的脂溶性與 Log P值正相關(guān)，脂質(zhì)體包封率隨 Log P 值的增大而升高。

鄧英杰等[94]指出一般只有 Log P ＞ 4.5 的脂溶性藥物或者 Log P ＜ -0.3 的水溶性藥物，才能包封成具有穩(wěn)定高包封率的脂質(zhì)體。Log P ＞ 5 的油酸為包封脂質(zhì)體的理想藥物，油酸多相脂質(zhì)體貯存超過兩年，其包封率基本不變。

鄭慶忠等[95]研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿水溶性較強，脂溶性較弱，其 Log P 僅為 -0.66[96]，該藥物的分子型也不能輕易通過磷脂雙分子層，因此采用 pH 梯度法制備脂質(zhì)體包封率只有 50%。

3 結(jié)語

總之，通過研究主動載藥技術(shù)的跨膜 pH 梯度、合適的孵育時間和孵育溫度、合適的外水相pH 調(diào)節(jié)劑、控制內(nèi)水相緩沖能力、調(diào)整類脂的組成和比例等方法，篩選盡可能安全與溫和的主動載藥離子梯度，提高脂質(zhì)體的包封率，為主動載藥脂質(zhì)體制劑產(chǎn)業(yè)化提供強有力的保障。

綜上所述，脂質(zhì)體主動載藥技術(shù)經(jīng)過 40 多年的研究和發(fā)展，其在藥學領(lǐng)域已經(jīng)取得了長足的進步，包括在主動載藥的方法拓展、機制研究、條件優(yōu)化和產(chǎn)品開發(fā)等方面。隨著脂質(zhì)體主動載藥技術(shù)的成熟，該技術(shù)已成為脂質(zhì)體制備的主流趨勢。其中，F(xiàn)DA 批準上市的產(chǎn)品包括：多柔比星脂質(zhì)體（Doxil?/Caelyx?[97]，Myocet?[98]）、柔紅霉素脂質(zhì)體（DaunoXome?[99]）、長春新堿脂質(zhì)體（Marqibo?[100]）、伊立替康脂質(zhì)體（Onivyde?[101]）等。通過漫長而又曲折的發(fā)展，主動載藥技術(shù)勢必將脂質(zhì)體藥物日臻完善，拓展主動載藥技術(shù)應(yīng)用范圍和領(lǐng)域，為新型納米藥物遞送系統(tǒng)的開發(fā)奠定堅實的基礎(chǔ)，同時也為脂質(zhì)體藥物的臨床轉(zhuǎn)化提供了強大技術(shù)保障。