以鉤端螺旋體重組蛋白為包被抗原的間接ELISA 檢測(cè)試劑盒的研制與性能評(píng)測(cè)

錢(qián) 杰，楊 堅(jiān)，張 玥，張 蓉，張湘燕，郭曉奎，

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海200025；2.上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司，上海201203；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院-國(guó)家熱帶病研究中心全球健康學(xué)院，衛(wèi)生部寄生蟲(chóng)病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200025

鉤端螺旋體病是一種由致病性鉤端螺旋體（簡(jiǎn)稱鉤體）感染而引起的人獸共患病。該疾病在我國(guó)多省市均有流行，被列為法定報(bào)告?zhèn)魅静?。其好發(fā)于雨季及洪澇災(zāi)害地區(qū)，嚙齒類動(dòng)物、犬、豬等為重要傳染源［1-2］，對(duì)人畜危害較大［3］。鉤體病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、黃疸、出血、肝脾腫大、腎功能衰竭等，與流行性感冒、病毒性出血熱、腦膜炎、登革熱、瘧疾等傳染性疾病及腎盂腎炎、化學(xué)中毒和食物中毒等非傳染性疾病相類似。目前，實(shí)驗(yàn)室鉤體培養(yǎng)法和基于活的鉤體標(biāo)準(zhǔn)菌株的顯微鏡凝集試驗(yàn)（microscopic agglutination test，MAT）仍是診斷和監(jiān)測(cè)鉤體病的金標(biāo)準(zhǔn)［2］，且國(guó)內(nèi)尚無(wú)對(duì)鉤體感染者進(jìn)行鉤體抗體檢測(cè)的成品試劑盒。

鉤體外膜具有抗原性，是抗體和補(bǔ)體的作用部位。鉤體外膜蛋白（outer membrane proteins，OMPs）參與鉤體與宿主黏附，在引起宿主免疫和致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［4］。2003—2004 年中國(guó)問(wèn)號(hào)鉤體賴型賴株與巴西鉤體哥本哈根型的全基因組測(cè)序完成，共報(bào)道了數(shù)百種可能與OMPs 相關(guān)的基因［5-6］，該項(xiàng)工作為遴選鉤體保守的OMPs及免疫檢測(cè)靶抗原提供了可能。

本研究選擇我國(guó)主要致病性鉤體流行株的高度保守的OMP 重組蛋白作為包被抗原，經(jīng)臨床樣本測(cè)試后建立敏感性與特異性較為理想的檢測(cè)方法，并研制鉤體特異性抗體間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒（下文簡(jiǎn)稱“試劑盒”），用于鉤體病患者血清中的鉤體IgG抗體的檢測(cè)，從而為鉤體病的診斷、監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查提供有利工具。

1 材料與方法

1.1 血清樣本、主要儀器及試劑

本研究檢測(cè)的血清樣本來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室血清庫(kù)，包括40 例經(jīng)MAT 測(cè)定的鉤體病患者、50 例經(jīng)MAT 測(cè)定的其他感染類疾病患者和391例健康對(duì)照者的血清樣本。

Mastercycler personal PCR 儀（Eppendorf，德國(guó)），PowerPac Universal 電泳儀（Bio-Rad，美國(guó)），5800 MALDI-TOF/TOF 串聯(lián)質(zhì)譜儀（ABI，美國(guó)），MK3 酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)），Savant 冷凍干燥離心濃縮儀（Thermo，美國(guó)），SPX-808SH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），96孔酶標(biāo)板（Greiner，德國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG 抗體（Sigma，美國(guó)）。其他酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑均由上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司制備。

1.2 主要材料制備

1.2.1 包被抗原的制備與鑒定

根據(jù)前期研究［7］，鉤體OMP 重組蛋白以問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴株的基因組為模板，表達(dá)載體為Pet28b，表達(dá)菌株為E. coil BL21。用1 mmol/L IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）于22 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h 后收集菌體，超聲裂解該菌體后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)OMP 重組蛋白的表達(dá)，并采用Ni-NTA 親和層析法進(jìn)行純化，最終獲得的OMP 重組蛋白即為包被抗原。將包被抗原送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析離子化串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定。

1.2.2 試劑盒對(duì)照品及參考品的制備及用途

（1） 陽(yáng)性對(duì)照品及陽(yáng)性參考品的制備及用途 從鉤體病確診患者血清中選擇經(jīng)MAT 與ELISA 檢測(cè)為鉤體抗體強(qiáng)陽(yáng)性的血清若干份，將其混合后制備成高效價(jià)混合陽(yáng)性血清。用含1% 牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液（PBST）按一定比例稀釋該陽(yáng)性血清，得到試劑盒陽(yáng)性對(duì)照品。該陽(yáng)性對(duì)照品為試劑盒的組成成分，用于試劑盒的質(zhì)量控制。從鉤體病確診患者的血清中選擇經(jīng)MAT與ELISA檢測(cè)為鉤體抗體陽(yáng)性的血清（5份）作為試劑盒陽(yáng)性參考品，為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部參考品，用于試劑盒穩(wěn)定性評(píng)估中的真陽(yáng)性率（即陽(yáng)性參考品在當(dāng)次檢測(cè)中被判斷為陽(yáng)性的例數(shù)與陽(yáng)性參考品總例數(shù)的比值）的評(píng)估。

（2） 陰性對(duì)照品及陰性參考品的制備及用途 從健康對(duì)照者血清中選擇經(jīng)MAT 和ELISA 檢測(cè)為鉤體抗體陰性的血清，用PBST 按1∶100 對(duì)陰性血清進(jìn)行稀釋即為試劑盒陰性對(duì)照品。該陰性對(duì)照品為試劑盒的組成成分，用于試劑盒的質(zhì)量控制。從健康對(duì)照者血清中選擇經(jīng)MAT 和ELISA 檢測(cè)為鉤體抗體陰性的血清（5 份）作為試劑盒陰性參考品，為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部參考品，用于試劑盒穩(wěn)定性評(píng)估中的真陰性率（即陰性參考品在當(dāng)次檢測(cè)中被判斷為陰性的例數(shù)與陰性參考品總例數(shù)的比值）的評(píng)估。

（3） 弱陽(yáng)性對(duì)照品（臨界參考品）及靈敏度參考品 的 制 備 及 用 途 用PBST 按1∶6 000、1∶6 100、1∶6 200、……、1∶8 900、1∶9 000 的比例將高效價(jià)混合陽(yáng)性血清進(jìn)行梯度稀釋，與391 例健康對(duì)照者血清行ELISA 同批檢測(cè)。將檢測(cè)獲得的健康對(duì)照者血清的D（450 nm/630 nm）的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差記為臨界值（99% CI），確定檢測(cè)值與該臨界值相當(dāng)?shù)母咝r(jià)混合陽(yáng)性血清的稀釋比例，而后將高效價(jià)混合陽(yáng)性血清按此比例進(jìn)行稀釋，制備得到弱陽(yáng)性對(duì)照品（即臨界參考品）。該弱陽(yáng)性對(duì)照品為試劑盒的組成成分，其檢測(cè)D（450 nm/630 nm）相當(dāng)于在血清樣本中鉤體抗體濃度為25 RU/mL（RU 為relative unit，即相對(duì)單位）。將弱陽(yáng)性對(duì)照品在每次實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的D（450 nm/630 nm）作為定性檢測(cè)的臨界值，以判斷待檢血清中的抗體濃度。用PBST對(duì)弱陽(yáng)性對(duì)照品進(jìn)行5倍稀釋得到靈敏度參考品，該參考品為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部參考品，用于對(duì)試劑盒的檢測(cè)限進(jìn)行評(píng)估。

（4） 精密度參考品的制備及用途 從鉤體病確診患者血清中選擇強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性血清各1份，分別作為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性精密度參考品。該參考品為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部參考品，用于對(duì)試劑盒的精密度評(píng)估。

1.3 包被抗原的抗原性檢測(cè)

將包被抗原用0.05 mol/L、pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液分別稀釋成1、2、5、10 μg/mL包被酶標(biāo)板，用陽(yáng)性參考品（包括強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性）和陰性參考品對(duì)包被抗原酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 試劑盒檢測(cè)體系的建立

試劑盒的主要工藝包括酶標(biāo)板的包被、封閉、干燥等，反應(yīng)體系包括包被抗原濃度和二抗最佳比例、樣本稀釋比例、二抗孵育時(shí)間、顯色時(shí)間、反應(yīng)溫度等，試劑配方包括樣本緩沖液、二抗稀釋液、顯色底物液、終止液等。通過(guò)對(duì)該試劑盒的檢測(cè)體系進(jìn)行摸索、優(yōu)化及驗(yàn)證，最終選擇出試劑盒的最佳制備工藝及反應(yīng)條件。

1.5 試劑盒的性能指標(biāo)評(píng)估

1.5.1 分析性能評(píng)估 主要性能指標(biāo)包括：精密度、敏感性和特異性。精密度包括批內(nèi)精密度、批間精密度。敏感性和特異性包括分析敏感性和分析特異性、臨床樣本檢測(cè)敏感性和臨床樣本檢測(cè)特異性。具體檢測(cè)步驟如下。

（1） 精密度檢測(cè) 選擇強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性精密度參考品進(jìn)行精密度檢測(cè)。①批內(nèi)精密度：在同一批試劑盒的同一次檢測(cè)中重復(fù)測(cè)定上述精密度參考品各10 次，分別計(jì)算測(cè)定結(jié)果的均值（x）及標(biāo)準(zhǔn)差（s）；通過(guò)均值/標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variance，CV），以評(píng)估該試劑盒的批內(nèi)精密度（批內(nèi)重復(fù)性），CV<15%即為批內(nèi)精密度良好。②批間精密度：分別在3批試劑盒中重復(fù)測(cè)定上述精密度參考品各10 次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的均值（x）及標(biāo)準(zhǔn)差（s）；通過(guò)均值/標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算批間CV，以評(píng)估該試劑盒的批間精密度（批間重復(fù)性），CV<20%即為批間精密度良好。

（2） 敏感性和特異性檢測(cè) 采用試劑盒對(duì)40 份鉤體病患者血清、50 份其他感染類疾病患者血清和50 份健康對(duì)照者血清進(jìn)行檢測(cè)，并與MAT 檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，分析試劑盒的檢測(cè)敏感性和特異性。公式如下：

臨床樣本檢測(cè)敏感性=（鉤體病患者樣本中檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本數(shù)/鉤體病患者的樣本總數(shù)）×100%；

臨床樣本檢測(cè)特異性=（其他感染類疾病患者和健康對(duì)照者中檢測(cè)為陰性的樣本數(shù)/其他感染類疾病患者和健康對(duì)照者的樣本總數(shù)）×100%；

分析敏感性=（鉤體病患者樣本中由MAT 與試劑盒共同檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本數(shù)/MAT 檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本數(shù)）×100%；

分析特異性=（其他感染類疾病患者和健康對(duì)照者中由MAT 與試劑盒共同檢測(cè)為陰性的樣本數(shù)/MAT 檢測(cè)為陰性的樣本數(shù)）×100%。

符合率=（共同檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本數(shù)+共同檢測(cè)為陰性的樣本數(shù)/總樣本數(shù)）×100%。

1.5.2 穩(wěn)定性評(píng)估 評(píng)估試劑盒在實(shí)際儲(chǔ)存條件下（2～8 ℃）和加速條件下［（37±1）℃］的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性），主要評(píng)估的技術(shù)指標(biāo)包括陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性對(duì)照品D（450 nm/630 nm），陰性、陽(yáng)性參考品的真陰性率和真陽(yáng)性率，靈敏度參考品D（450 nm/630 nm）及試劑盒的批內(nèi)精密度。試劑盒需同時(shí)滿足以下4項(xiàng)即被認(rèn)定是穩(wěn)定的：①陽(yáng)性對(duì)照品D 值/陰性對(duì)照品D 值≥4.0，弱陽(yáng)性對(duì)照品D 值/陰性對(duì)照品D 值≥2.0。②陽(yáng)性參考品的真陽(yáng)性率和陰性參考品的真陰性率均達(dá)到100%。③靈敏度參考品D值≥0.100。④試劑盒批內(nèi)CV<15%。

對(duì)3批試劑盒行實(shí)際儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性評(píng)估，即每批試劑盒在2～8 ℃條件下分別存放0、6、9、12、14、18個(gè)月后對(duì)上述各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。其中，批內(nèi)CV的測(cè)定方法為：選擇3份精密度參考品（即強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性和弱陽(yáng)性各1 份）作為測(cè)定樣本，用每1 批試劑盒對(duì)該3 份精密度參考品分別重復(fù)測(cè)定10 次。計(jì)算測(cè)定結(jié)果D（450 nm/630 nm）的均值及標(biāo)準(zhǔn)差，求出CV。

對(duì)其中1批試劑盒進(jìn)行加速條件下的穩(wěn)定性評(píng)估，即ELISA 試劑盒有效期（即穩(wěn)定性）的最低要求為2～8 ℃下穩(wěn)定12 個(gè)月。將試劑盒置于（37±1）℃條件下，設(shè)定在加速6 d 后對(duì)上述各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試，合格后繼續(xù)加速測(cè)試。比較分析加速實(shí)驗(yàn)前（37 ℃）及加速6、7、8 d 后試劑盒的上述各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)，具體方法同試劑盒在實(shí)際儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性評(píng)估。

同時(shí)，對(duì)3批試劑盒開(kāi)封后的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，即于2～8 ℃條件下開(kāi)封后6 個(gè)月，對(duì)其各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行分析，方法同試劑盒在實(shí)際儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 包被抗原的鑒定

經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)，包被抗原相對(duì)分子質(zhì)量為31 000，符合預(yù)期。包被抗原經(jīng)質(zhì)譜鑒定顯示其為一種OMP（圖1）；將質(zhì)譜分析得到的氨基酸序列和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示測(cè)得的氨基酸序列同目的蛋白序列一致，符合率為100%。

圖1 包被抗原的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig 1 Tandem mass spectrum of coated antigen

2.2 臨界值的確定與臨界參考品的制備

對(duì)391例健康對(duì)照者的血清檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（圖2）顯示，檢測(cè)D（450 nm/630 nm）平均值為0.121、標(biāo)準(zhǔn)差為0.040 3。經(jīng)計(jì)算其臨界值為0.241 9，與稀釋比例為1∶8 100的高效價(jià)混合陽(yáng)性血清的檢測(cè)值相當(dāng)。因此，將高效價(jià)混合陽(yáng)性血清按此比例稀釋，即得到臨界參考品。

圖2 ELISA檢測(cè)391例健康對(duì)照者血清的D（450 nm/630 nm)分布Fig 2 Distribution of D(450 nm/630 nm)detected with 391 healthy serum controls by ELISA

2.3 包被抗原的抗原性檢測(cè)分析

將純化后的重組OMP 作為包被抗原，陽(yáng)性參考品和陰性參考品的檢測(cè)結(jié)果為弱陽(yáng)性參考品檢測(cè)D（450 nm/630 nm） 值大于0.3、強(qiáng)陽(yáng)性參考品檢測(cè)D （450 nm/630 nm） 值大于1.0、陰性參考品檢測(cè)D （450 nm/630 nm）值小于0.2，表明該蛋白作為包被抗原具有較強(qiáng)的抗原性（靈敏度）和較低的陰性參考品檢測(cè)值（特異性），且從4 種包被濃度的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看1 μg/mL 的包被濃度已可明顯區(qū)分陽(yáng)性參考品（包括強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性）和陰性參考品（表1）。

表1 包被抗原的抗原性檢測(cè)Tab 1 Detection of antigenicity of the coating antigen

2.4 試劑盒檢測(cè)體系的建立

本研究經(jīng)過(guò)摸索、驗(yàn)證及優(yōu)化，檢測(cè)體系建立如下：以0.05 mol/L、pH 9.6 的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，稀釋包被抗原為2μg/mL，并于2～8 ℃包被酶標(biāo)板18 h 以上。用PBST 作為封閉液，于37 ℃下封閉2 h。用含1%牛血清白蛋白、0.05%吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液將待檢血清按1∶101 稀釋后加入酶標(biāo)板中（100 μL/孔），37 ℃下溫育30 min，洗板3 遍后拍干；加100 μL 二抗，37 ℃下溫育30 min，洗板4 遍后拍干；加100μL 底物和50μL 顯色劑，37 ℃下溫育30 min，加50 μL 終止液。而后，分別于450 nm和630 nm波長(zhǎng)下讀取D值。

表2 試劑盒的批內(nèi)精密度及批間精密度檢測(cè)結(jié)果Tab 2 Results of intra and inter batch precision test of the kit

2.5 試劑盒的批內(nèi)精密度和批間精密度的檢測(cè)分析

采用精密度參考品對(duì)試劑盒進(jìn)行精密度分析，結(jié)果（表2）顯示，精密度參考品的批內(nèi)CV均小于15%，即試劑盒的批內(nèi)精密度較好；精密度參考品的批間CV 均小于20%，即試劑盒的批間精密度亦較好。

2.6 試劑盒的敏感性和特異性的檢測(cè)分析

采用試劑盒對(duì)40 份鉤體病患者血清、50 份其他感染類疾病患者血清、50 份健康對(duì)照者血清進(jìn)行檢測(cè)，并于MAT 檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，試劑盒的臨床樣本檢測(cè)敏感性為95.0%、臨床樣本檢測(cè)特異性為95.0%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，試劑盒的分析敏感性為91.1%、分析特異性為97.9%、符合率為95.7%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3、4。

表3 試劑盒檢測(cè)鉤體病患者、其他感染類疾病患者及健康對(duì)照者的血清樣本的結(jié)果Tab 3 Results of serum samples from patients with leptospirosis，patients with other infectious diseases and healthy controls detected by the kit

表4 試劑盒檢測(cè)結(jié)果與MAT檢測(cè)結(jié)果的比較（N=140）Tab 4 Comparison of kit test results and MAT test results（N=140）

2.7 實(shí)際儲(chǔ)存條件下試劑盒的穩(wěn)定性評(píng)估

基于穩(wěn)定性評(píng)估中各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)較多，且ELISA試劑盒有效期的一般要求為2～8 ℃下穩(wěn)定12個(gè)月，因此本研究?jī)H針對(duì)2～8 ℃條件下存放12個(gè)月后的試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進(jìn)行展示。對(duì)每批試劑盒的多個(gè)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示，3批試劑盒的陰、陽(yáng)性對(duì)照品D（450 nm/630 nm）（表5）、陽(yáng)性參考品的真陽(yáng)性率、陰性參考品的真陰性率（表6）及靈敏度參考品D（450 nm/630 nm）（分別為0.121、0.123和0.110）、批內(nèi)CV（表7）均符合要求；繼而表明，在上述條件下該試劑盒的穩(wěn)定性良好。

表5 2～8 ℃條件下存放12個(gè)月后3批試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照品的結(jié)果Tab 5 Results of positive and negative internal control detected by three batches of the kit after storage for 12 months at 2-8 ℃

在2～8 ℃條件下對(duì)存放14 個(gè)月后的試劑盒穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)仍較好（數(shù)據(jù)略）；而存放18 個(gè)月后，3 批試劑盒對(duì)弱陽(yáng)性精密度參考品檢測(cè)的批內(nèi)CV 均超過(guò)15%（分別為15.2%、18.1%和17.9%），即批內(nèi)精密度不符合要求（數(shù)據(jù)略）。

2.8 加速穩(wěn)定條件下試劑盒的穩(wěn)定性評(píng)估

加速條件下對(duì)試劑盒的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)評(píng)，結(jié)果（表8）顯示加速6 d后試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照品D（450 nm/630 nm）/陰性對(duì)照品D（450 nm/630 nm）=10.42、弱陽(yáng)性對(duì)照品D（450 nm/630 nm）/陰性對(duì)照品D（450 nm/630 nm）=3.15，陽(yáng)性參考品的真陽(yáng)性率和陰性參考品的真陰性率均為100%，靈敏度參考品D（450 nm/630 nm）不小于0.1，均符合試劑盒穩(wěn)定性要求。

37 ℃加速6、7 d 后，采用3 份精密度參考品（強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性和弱陽(yáng)性）檢測(cè)試劑盒的精密度，顯示試劑盒的批內(nèi)CV 均低于15%；而加速8 d 后試劑盒對(duì)弱陽(yáng)性精密度參考品的批內(nèi)CV為18.7%，即為不合格（表9）。

表6 2～8 ℃下存放12個(gè)月后3批試劑盒檢測(cè)陰性、陽(yáng)性參考品的結(jié)果及判斷Tab 6 Results and evaluation of the coincidence rate of negative and positive reference for internal control detected by three batches of the kits after storage for 12 months at 2-8 ℃

Kit batch Precision reference for internal control of the kit Intra batch precision Average D（450 nm/630 nm）SD CV/%The first batch The second batch The third batch Weak positive precision reference Positive precision reference Strong positive precision reference Weak positive precision reference Positive precision reference Strong positive precision reference Weak positive precision reference Positive precision reference Strong positive precision reference 0.255 0.731 1.317 0.238 0.695 1.183 0.265 0.753 1.366 0.025 0.047 0.050 0.026 0.050 0.065 0.027 0.058 0.088 9.79 6.47 3.77 11.08 7.18 5.47 10.08 7.74 6.46

表7 2～8 ℃下存放12個(gè)月后3批試劑盒的批內(nèi)精密度檢測(cè)結(jié)果Tab 7 Intra batch precision results of three batches of the kits after storage for 12 months at 2-8 ℃

表8 加速實(shí)驗(yàn)前、后試劑盒檢測(cè)陰性、陽(yáng)性參考品的結(jié)果及判斷Tab 8 Results and evaluation of negative and positive reference for internal control detected by kit before and after accelerated experiment

表9 加速6～8 d后試劑盒的批內(nèi)精密度檢測(cè)結(jié)果Tab 9 Intra batch precision results of the kit 6-8 d after accelerated experiment

2.9 試劑盒開(kāi)封后的穩(wěn)定性檢測(cè)

將試劑盒開(kāi)封后于2～8 ℃條件下存放6個(gè)月，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照品D（450 nm/630 nm）/陰性對(duì)照品D（450 nm/630 nm）、弱陽(yáng)性對(duì)照品D（450 nm/630 nm）/陰性對(duì)照品D（450 nm/630 nm）、陽(yáng)性參考品的真陽(yáng)性率、陰性參考品的真陰性率、靈敏度參考品D（450 nm/630 nm）、批內(nèi)精密度均符合要求合格，即在開(kāi)封后6個(gè)月試劑盒依然有效。具體數(shù)據(jù)略。

3 討論

目前，國(guó)外已有將鉤體保守的OMPs用于鉤體感染患者行血清抗體檢測(cè)［8］、將提純的鉤體抗原用于感染犬的血清學(xué)抗體檢測(cè)［9］等的相關(guān)研究，但上述研究并未在臨床上廣泛應(yīng)用；而在國(guó)內(nèi)，類似上述研究仍處于起步階段［10-11］。研究［12-13］顯示，針對(duì)血清樣本中的鉤體特異性核酸常采用PCR 進(jìn)行檢測(cè)，但該方法對(duì)儀器設(shè)備、樣本預(yù)處理的要求較高，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。截至目前，鉤體培養(yǎng)法和MAT仍是診斷和監(jiān)測(cè)鉤體病的金標(biāo)準(zhǔn)［3，14］。其中，鉤體培養(yǎng)法需在生物安全實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)鉤體活菌培養(yǎng)2 周以上［1］；MAT 則需將活的鉤體標(biāo)準(zhǔn)株與感染者血清進(jìn)行孵育培養(yǎng)，且需在暗視野顯微鏡下長(zhǎng)時(shí)間觀察［15］。因此，該2 種方法均無(wú)法對(duì)人群行大規(guī)模的快速篩查，亦無(wú)法對(duì)鉤體病行早期診斷。

近期，本研究對(duì)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局的醫(yī)療器械數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索后發(fā)現(xiàn)，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)已獲得醫(yī)療器械注冊(cè)許可證的鉤體感染診斷試劑應(yīng)用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的鉤體感染檢測(cè)。在國(guó)外，鉤體感染商品化檢測(cè)試劑盒主要有Lepto-LAT、Lepto Rapid Test、Lepto Dri Dot Test，而上述試劑盒均未在國(guó)內(nèi)上市。

目前，國(guó)外實(shí)驗(yàn)室較常采用ELISA 對(duì)鉤體患者血清的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，但由于檢測(cè)使用的鉤體抗原存在地區(qū)流行差異，國(guó)外ELISA 試劑盒對(duì)我國(guó)的鉤體感染檢測(cè)效果并不理想。在本研究中，我們選擇國(guó)內(nèi)鉤體流行株中高度保守的OMPs［7］的重組蛋白作為包被抗原，并采用間接ELISA 檢測(cè)鉤體感染者血清樣本中的IgG 抗體。結(jié)果顯示，我們研制的鉤體特異性抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒的物理性狀、陰性符合率、陽(yáng)性符合率、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性等的技術(shù)指標(biāo)表現(xiàn)良好，符合定性檢測(cè)試劑盒的技術(shù)要求；穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明，3批試劑盒的穩(wěn)定性均達(dá)到12 個(gè)月以上。同時(shí)，該試劑盒的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，能夠在2～3 h 內(nèi)完成對(duì)上百份樣本的檢測(cè)，操作快速、簡(jiǎn)便，因此其可適用于國(guó)內(nèi)臨床檢驗(yàn)科室、臨床實(shí)驗(yàn)室及疾控中心等的鉤體病輔助診斷、鉤體病防控哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。

參·考·文·獻(xiàn)

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