鉤端螺旋體EMJH培養(yǎng)基實驗室應用

潘敏楠，徐國英

鉤端螺旋體病是一種自然疫源性疾病，其宿主多樣性，該病世界各地都有散在發(fā)生，甚至呈現(xiàn)局部暴發(fā)流行。培養(yǎng)和分離鉤體對于防治鉤體病至關(guān)重要[1]。目前，鉤體培養(yǎng)基主要為柯氏培養(yǎng)基和EMJH培養(yǎng)基，目前美國BD公司推出改良EMJH培養(yǎng)基[2-3]，配制簡單，本文在鉤體病防治實踐中對這2種培養(yǎng)基進行比較，探討其應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗菌種 鉤體15群15型標準菌株1套，來自中國CDC。

1.1.2培養(yǎng)基 柯氏培養(yǎng)基：按國標配制，加10%滅活兔血清，分裝無菌試管中，6 mL/支。EMJH培養(yǎng)基：將BD公司提供的鉤體基礎EMJH和鉤體增菌液配制液體培養(yǎng)基，分裝無菌試管中，6 mL/支。

1.1.3血清標本 健康人63 份，近2年臨床鉤體疑似病人189 份和保存的2008年本省鉤體暴發(fā)流行病人29 份[4]。

1.2 試驗方法

1.2.12種培養(yǎng)基培養(yǎng)鉤體生長比較 同時接種0.6 mL鉤體菌液(1套鉤體標準菌株)于相同體積的2種培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)；每2 d在暗視野顯微鏡下(10×40)觀察生長情況，連續(xù)觀察3周，結(jié)果判定：以+～++++記錄鉤體生長狀況，其每視野下鉤體數(shù)分別為50～100條(+)、100～200條(++)、200～400條(+++)、400條以上(++++)。

1.2.2鉤體抗體測定:鉤體顯微鏡凝集試驗(MAT)同時采用培養(yǎng)6 d的2組鉤體標準培養(yǎng)物對不同人群血清標本進行MAT試驗，血清預先經(jīng)56 ℃ 30 min滅活處理后，血清稀釋度從1∶50到1∶1 600。結(jié)果判定：健康人群血清抗體滴度≥1∶100(++)為陽性，病人單份血清抗體滴度≥1∶400(++)為陽性，比較其檢測的敏感性.

2 試驗結(jié)果

2.1不同培養(yǎng)基培養(yǎng)鉤體生長情況 用柯氏培養(yǎng)基培養(yǎng)15群15型鉤體，暗視野顯微鏡下觀察各群鉤體都能生長，培養(yǎng)第6 d達到高峰(+++)，第14 d菌體密度下降(++以下)，鏡下可見雜質(zhì)和鉤體自凝現(xiàn)象。用EMJH培養(yǎng)基培養(yǎng)鉤體視野清晰，各菌群生長良好，運動活潑，沒有出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。培養(yǎng)第2 d就達高峰(+++)，并一直維持到第20 d(+++)。不論是常見流行的黃疸出血群、犬群、秋季群、波摩那群、流感傷寒群、七日熱群和巴達維亞群，還是罕見的爪哇群、澳洲群、賽羅群和明尼群等，都是一致的結(jié)果。以黃疸出血群鉤體為例，見表1。

表1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)黃疸出血群鉤體結(jié)果
Tab.1 Grow condition of Icterohaemorrhagiae leptospira in different medium

培養(yǎng)時間(d)246810121416182022柯氏培養(yǎng)基+++++++++++++++++++++EMJH培養(yǎng)基++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

2.2不同人群血清鉤體顯微鏡凝集試驗(MAT)

2.2.1健康人群血清MAT 63份健康人血清以1∶50稀釋度檢測抗體，采用上述2種培養(yǎng)基的6 d培養(yǎng)物進行MAT，鉤體抗體均陰性。

2.2.2疑似病人血清鉤體抗體檢測 共收集189份醫(yī)院送檢疑似鉤體病人血清，經(jīng)2種培養(yǎng)基培養(yǎng)后抗體檢測結(jié)果也完全一致，主要流行的菌群為秋季群、波摩那群、七日熱群等，2種培養(yǎng)基的培養(yǎng)物均檢出45份陽性血清[≥1∶400(++)]，陽性率23.8%，皆為相同的病人。

2.2.3鉤體病暴發(fā)流行病人血清抗體檢測 從本省霞浦秋季群鉤體病爆發(fā)流行收集到29份病人血清[4]，用柯氏培養(yǎng)基培養(yǎng)物進行鉤體MAT，4份陰性、8份1∶400陽性、14份1∶800陽性、3份1∶1600陽性，用EMJH培養(yǎng)基培養(yǎng)物試驗，4份陰性、2份1∶400陽性、13份1∶800陽性、10份1∶1600陽性，抗體效價多數(shù)較柯氏培養(yǎng)基培養(yǎng)物至少高一個稀釋度，見表2。

表2 2種培養(yǎng)基鉤體培養(yǎng)物MAT比較
Tab.2 Antibody titer comparison of MAT test in two kinds of Leptorpira media

檢測數(shù)血清MAT凝集效價1∶400(-)1∶400 (++)1∶800(++)1∶1600(++)合計χ2P*柯氏培養(yǎng)基48143297.860.0408EMJH培養(yǎng)基42131029

注：*似然比卡方檢驗，df=3

3 討 論

2種培養(yǎng)基都適用于培養(yǎng)鉤體，但配制柯氏培養(yǎng)基需要添加兔血清，由于兔血清成分復雜，采集過程批次間差異大，用來培養(yǎng)鉤體生長不穩(wěn)定，鏡下觀察呈雜質(zhì)多，其鉤體培養(yǎng)高峰出現(xiàn)在6～14 d，晚期出現(xiàn)鉤體自凝現(xiàn)象。EMJH培養(yǎng)基改用BSA替代兔血清，配方也有調(diào)整，制備簡便，發(fā)現(xiàn)有助鉤體生長，鉤體形態(tài)正常運動活潑，鏡下清晰并無自凝現(xiàn)象，培養(yǎng)第2 d觀察到大量鉤體菌，并且其密度維持到第20 d。盡早分離培養(yǎng)到鉤體菌在鉤體病流行病學調(diào)查中與檢測中十分重要，這為早期防治鉤體病提供科學依據(jù)。在鉤體陽性血清驗證試驗中，由于血清保存時間長(10年前的病人血清)，抗體效價有所下降，EMJH培養(yǎng)基培養(yǎng)的鉤體MAT試驗同樣都測出抗體，但多數(shù)較柯氏培養(yǎng)基培養(yǎng)菌效價高，說明EMJH培養(yǎng)基培養(yǎng)菌有較高的抗原性。BD公司生產(chǎn)的EMJH培養(yǎng)基完全可用于快速分離鉤體，有利早期確定鉤體病的流行和實驗室研究。

利益沖突：無