• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    致病性鉤端螺旋體的多位點(diǎn)序列分型研究

    2022-03-18 10:07:22杜宗利辛?xí)苑?/span>徐穎華
    關(guān)鍵詞:鉤體問(wèn)號(hào)致病性

    李 喆,張 影,杜宗利,辛?xí)苑?,葉 強(qiáng),徐穎華

    鉤端螺旋體病(簡(jiǎn)稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)引起的人獸共患傳染病[1]。盡管隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和衛(wèi)生條件改善,在過(guò)去幾十年世界各國(guó)鉤體病的發(fā)病率大幅降低,但據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),每年仍有約200萬(wàn)鉤體感染病例,一些地區(qū)甚至還發(fā)生暴發(fā)流行。因此,鉤體病仍是當(dāng)前全球的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。

    病原體的監(jiān)測(cè)和溯源是預(yù)防和控制傳染性疾病的最關(guān)鍵步驟之一。國(guó)際和國(guó)內(nèi)對(duì)鉤體菌株的分類從最早血清學(xué)分類法,到各型不同原理的分子分型方法[3-5]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,自20世紀(jì)90年代起,研究人員就開(kāi)始應(yīng)用16SRNA基因測(cè)序方法對(duì)鉤體進(jìn)行分子分型,并將致病性鉤體中包括問(wèn)號(hào)(Leptospirainterrogans)、波氏(L.borgpetersenii)、衛(wèi)氏(L.weilii)等10個(gè)基因種[6-7]。此外,Ahmed等[8]于2006年首次將基于多種管家基因的多位點(diǎn)序列分型法(Multi-Locus Sequence Typing, MLST)技術(shù)用于鉤體的分子分型,由于該方法簡(jiǎn)單、快捷、結(jié)果易于比較,被廣泛用于不同致病性基因型的分子分型、進(jìn)化溯源和種群結(jié)構(gòu)等研究[9-10]。而目前對(duì)全球致病鉤體菌株進(jìn)行系統(tǒng)性MLST分析的研究較少。此外,中國(guó)致病性鉤體菌株MLST研究多用于黃疸出血群的型群結(jié)構(gòu)分型[6,9],而其他血清群致病性鉤體分型和遺傳多樣性的研究報(bào)道也較少。因此,在本研究應(yīng)用16SRNA基因測(cè)序和MLST分析方法對(duì)不同來(lái)源、不同時(shí)期的21種不同血清群的國(guó)內(nèi)鉤體分離菌株與國(guó)際參考菌株進(jìn)行分析,并與國(guó)內(nèi)7株疫苗株結(jié)果平行比較[4]。同時(shí)基于PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)和已有的文獻(xiàn)報(bào)道[4,6,9],共收集來(lái)自世界7大洲不同國(guó)家和不同時(shí)期1 238株致病性鉤體基因種和MLST數(shù)據(jù)(含236株中國(guó)致病性鉤體MLST數(shù)據(jù))。探討分析致病性鉤體MLST基因多態(tài)性,以其系統(tǒng)性了解中國(guó)境內(nèi)和全球致病鉤體菌株種群結(jié)構(gòu)和遺傳進(jìn)化關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 菌株 致病性鉤體國(guó)際和國(guó)內(nèi)參考菌株均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

    1.2 主要試劑及儀器 DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Ex Taq DNA聚合酶和DNA marker DL1000購(gòu)自大連TaKaRa公司;其他化學(xué)試劑均為分析純;2400型基因擴(kuò)增儀為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

    1.3 細(xì)菌培養(yǎng)和DNA提取 將鉤體菌株接種于含10%兔血清的磷酸鹽培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)14 d。離心收集菌體,按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行菌體基因組的提取,基因組DNA樣品放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 16SrRNA基因序列分析 以提取的鉤體菌株基因組DNA為模板,通過(guò)擴(kuò)增和測(cè)序近全長(zhǎng)16SrRNA基因(擴(kuò)增引物見(jiàn)表1),進(jìn)行鉤體基因型的鑒定。將測(cè)序結(jié)果與參考序列(GenBank: AY631894.1)進(jìn)行比對(duì),參考文獻(xiàn)[7], 根據(jù)位點(diǎn)差異判定菌株基于16SrRNA序列的基因型。

    1.5 MLST分析 參考文獻(xiàn)[10],選擇7個(gè)國(guó)際通用的MLST位點(diǎn),已提取基因組DNA為模板,應(yīng)用7種不同管家基因引物(見(jiàn)表1)進(jìn)行MLST不同位點(diǎn)的擴(kuò)增及測(cè)序。將管家基因測(cè)序結(jié)果上傳PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org/),獲得待檢測(cè)鉤體菌株MLST型(ST)。

    表1 本研究所用引物序列

    1.6 MLST數(shù)據(jù)收集和系統(tǒng)發(fā)育分析 從PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org/)下載已明確MLST型(scheme 1)數(shù)據(jù)及其菌株信息,同時(shí)從國(guó)內(nèi)已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)[4,6,9]收集中明確MLST型(scheme 1)的鉤體菌株信息。使用Bionumerics軟件v7.5 (Applied-Maths)對(duì)本研究所有鉤體菌株MLST信息進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,并構(gòu)建最小生成樹(shù),并以此探討致病性鉤體種群結(jié)構(gòu)與菌株分離宿主來(lái)源、區(qū)域等流行病學(xué)信息的相關(guān)性。

    2 結(jié) 果

    2.1 致病性鉤體16SrRNA基因序列分析 16SrRNA基因測(cè)序分析結(jié)果顯示(圖1),5株鉤體國(guó)際參考菌株為問(wèn)號(hào)基因種,其他2株國(guó)際菌株為L(zhǎng).kirschneri基因種;而在47株鉤體中國(guó)分離株中,分別包含28株(59.6%)問(wèn)號(hào)基因種、8株(17.0%)波氏基因種、6株(12.8%)衛(wèi)氏基因種、4株(8.5%)L.alexanderi基因種和1株(2.1%)L.kirschneri基因種。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)6株衛(wèi)氏基因種菌株除了來(lái)源人以外,還來(lái)自3種不同動(dòng)物宿主(圖1)。不同菌種的血清群與其基因種沒(méi)有明顯的相關(guān)性。

    2.2 致病性鉤體MLST分型 通過(guò)對(duì)54株鉤體菌株進(jìn)行7個(gè)管家基因位點(diǎn)的擴(kuò)增、測(cè)序及與PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)參考序列進(jìn)行比對(duì),確定了每個(gè)菌株每個(gè)管家基因位點(diǎn)的基因型,通過(guò)組合不同位點(diǎn)基因型最終確定了每個(gè)菌株的MLST型(圖1)。7株國(guó)際參考菌株呈現(xiàn)7種不同ST型。

    在47株中國(guó)鉤體分離株中,發(fā)現(xiàn)15種ST型以及24種尚未報(bào)道的新ST型(圖1)。其中56620、56666、56679和56660菌株均為ST1型,與疫苗株黃疸出血群賴株(56001)相同,這5種ST1型菌株均為問(wèn)號(hào)基因種,56620和56679均為黃疸出血群。此外,還發(fā)現(xiàn)56003和56626菌株的ST型與疫苗株犬群611菌株相同,均為ST37型(圖1)。

    上述菌株MLST分析結(jié)果的UPGMA發(fā)現(xiàn),屬于問(wèn)號(hào)、波氏和衛(wèi)氏基因種菌株均各自形成單獨(dú)聚類分支。而4株L.alexanderi基因種聚類分支中包含一株L.kirschneri基因種菌株。在問(wèn)號(hào)基因種中,7株不同ST的疫苗株也位于不同亞分支中(圖1)。

    紅色下劃線標(biāo)注的為中國(guó)鉤體疫苗生產(chǎn)菌株。

    2.3 致病性鉤體基因種與MLST型的多態(tài)性分析 共收集(數(shù)據(jù)庫(kù)下載、文獻(xiàn)引用和本研究結(jié)果)1 238株鉤體MLST數(shù)據(jù)。對(duì)每一個(gè)菌株來(lái)源、分離時(shí)間、基因種和MLST型進(jìn)行匯總分析(表2),世界范圍內(nèi)近百年分離的1 238株鉤體菌株共分為8個(gè)基因型,而中國(guó)236株鉤體菌株共分為5個(gè)基因型,不同國(guó)家流行菌株的基因種和ST型不盡相同(表2)。在鉤體流行疫情比較嚴(yán)重的亞太地區(qū)和南美區(qū)域,在過(guò)去60多年中,分離鉤體菌株基因種主要為問(wèn)號(hào)基因種。例如1962-2016年巴西分離的113株鉤體菌株中,83株為問(wèn)號(hào)基因種,相類似,在泰國(guó)分離的125株菌株中,92%(115株)的菌株基因種同為問(wèn)號(hào)基因種。而在疫情較輕的非洲國(guó)家剛果分離的16株菌株中,12株為L(zhǎng).kirschneri基因種和4株為波氏基因種(表2)。

    在不同國(guó)家分離菌株中所含有ST型數(shù)量也不同,導(dǎo)致其多態(tài)性指數(shù)也不同,例如在中國(guó)和泰國(guó),分別在236株和125株分離菌株發(fā)現(xiàn)82種和51種ST型,多態(tài)性指數(shù)分別為0.35和0.41,而在馬來(lái)西亞,31株菌株中含有30種ST型,多態(tài)性指數(shù)為0.97。在澳大利亞分離的16株菌株中發(fā)現(xiàn)12株ST型,多態(tài)性指數(shù)為0.75(表2)。

    2.4 致病性鉤體種群結(jié)構(gòu)分析 基于MLST系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,世界范圍內(nèi)1 238株鉤體菌株包含16個(gè)主要的進(jìn)化簇(不少于10菌株/簇),共計(jì)669個(gè)菌株(54.0%),主要包括ST17、ST34、ST149、ST1和ST37等(表3),其中ST17和ST149遍布全球多個(gè)洲分布。236個(gè)中國(guó)鉤體菌株包含4個(gè)主要的進(jìn)化簇(不少于10菌株/簇),分別為ST1、ST128、ST17、ST143,共計(jì)120個(gè)菌株(50.9%)(表2),ST1與ST128僅有ptnA管家基因不同,其余6個(gè)管家基因型均為1型。

    表2 不同國(guó)家鉤體分離菌株的基因種與MLST型

    表3 主要流行MLST型鉤體菌株的分布

    此外,MLST分型與16SrRNA序列分析結(jié)果具有較好的一致性,而與血清群分型結(jié)果一致性較差,相同的血清群菌株內(nèi)ST型眾多。相同ST型菌株具有不同血清群。進(jìn)化樹(shù)分析也顯示致病性鉤體菌株在不同宿主物種廣泛地交叉感染,不同國(guó)家間存在廣泛傳播。分離時(shí)間與鉤體種群結(jié)構(gòu)分布并不具有明顯的相關(guān)性(圖2)。

    每個(gè)圓代表一個(gè)MLST型(ST),圓的大小代表一個(gè)給定ST的菌株數(shù)量。A為MLST與鉤體基因型的相關(guān)性,不同顏色代表了鉤體菌株基于16S RNA測(cè)序的不同基因型;B為MLST與鉤體血清群的相關(guān)性,不同顏色代表了不同的血清群;C為MLST與鉤體菌株宿主/媒介的相關(guān)性,不同顏色代表了不同的宿主/媒介;D為MLST與鉤體分離地區(qū)的相關(guān)性,不同顏色代表了不同的分離地區(qū);E為MLST與鉤體分離時(shí)間的相關(guān)性,不同顏色代表了不同的分離時(shí)間段;F為中國(guó)鉤體菌株MLST型別的分布。

    3 討 論

    目前,全球已發(fā)現(xiàn)了近30個(gè)血清群300多個(gè)型不同血清型鉤體,至今仍不斷有新的血清型鉤體報(bào)道[4-5]。在中國(guó),已發(fā)現(xiàn)的致病性鉤體有18個(gè)血清群76個(gè)血清型,但目前主要流行血清群仍是黃疸出血群[5-6]。但由于血清學(xué)方法檢測(cè)時(shí)需要一系列的標(biāo)準(zhǔn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)分群(型)血清,操作繁瑣,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,僅在部分鉤體參考實(shí)驗(yàn)室方可開(kāi)展,從而限制鉤體的分型分析廣泛應(yīng)用。本研究應(yīng)用簡(jiǎn)單快捷的16SrRNA和MLST分析方法對(duì)不同來(lái)源、不同時(shí)期的多種不同血清群國(guó)內(nèi)分離菌株和國(guó)際菌株進(jìn)行分析,本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)16SrRNA和MLST方法不僅可以用于鉤體的分子分型研究,還同樣適用于不同基因型菌株的進(jìn)化關(guān)系。

    我們分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在47株國(guó)內(nèi)分離的鉤體菌株中,多數(shù)(59.6%)菌株均為問(wèn)號(hào)基因種,進(jìn)一步支持在中國(guó)過(guò)去60多年中分離鉤體菌種主要以問(wèn)號(hào)基因種為流行趨勢(shì)現(xiàn)狀[6,11]。同時(shí),還發(fā)現(xiàn)在波氏基因種的菌株來(lái)自多種動(dòng)物宿主。以前研究結(jié)果證實(shí)波氏致病性基因種的基因組含有大量的假基因,較問(wèn)號(hào)等基因種菌株基因組小400~800 kb[11-12],提示其經(jīng)歷不同進(jìn)化歷程,喪失近祖先在普通環(huán)境生存的能力,僅能在動(dòng)物宿主體內(nèi)寄生,這些分析結(jié)果也解釋了為什么波氏基因種鉤體可在多種動(dòng)物宿主分離的原因之一。

    MLST分析結(jié)果證實(shí)47株國(guó)內(nèi)分離菌株存在39種ST型,其中包括24種新型ST型,也進(jìn)一步表明中國(guó)鉤體菌株資源豐富、菌型復(fù)雜,種群結(jié)構(gòu)獨(dú)特[6,11,13]。此外,盡管當(dāng)前國(guó)內(nèi)鉤體疫苗生產(chǎn)用菌種是依據(jù)主要流行血清群的選擇代表性菌株,通過(guò)MLST系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)7株疫苗株位于不同進(jìn)化亞分支上,從分子水平層面分析,作為疫苗株也具有一定代表性。

    由于鉤體病屬于人獸共患的自然疫源性疾病。其動(dòng)物宿主的種類繁多,當(dāng)?shù)貐^(qū)域性的氣候、環(huán)境變遷可能會(huì)影響致病性鉤體菌株的遺傳變異和進(jìn)化,表明鉤體菌株的基因型與地域具有一定相關(guān)性[14-15]。本研究MLST分析也證實(shí)不同國(guó)家流行不同的ST型,例如鉤體疫情嚴(yán)重的泰國(guó)和巴西主要流行型分別為ST34和S17,而在中國(guó)主要為ST1。由于分型原理不同,血清群與MLST分型沒(méi)有明顯的相關(guān)性,相同的血清群菌株具有不同的ST型,反之亦然。中國(guó)疾控中心傳染病預(yù)防控制所收集過(guò)去50多年國(guó)內(nèi)5個(gè)不同省市的120株黃疸出血群鉤體菌株進(jìn)行MLST多態(tài)性分析,證實(shí)黃疸出血群群內(nèi)分化明顯,呈現(xiàn)17種不同ST基因型;盡管其中69株鉤體為ST1型,但隨著時(shí)間推移,菌株基因多態(tài)性呈現(xiàn)逐漸增多,國(guó)際主要流行ST17型占比呈上升趨勢(shì)[6]。研究人員應(yīng)用MLST方法對(duì)近些年泰國(guó)持續(xù)暴發(fā)鉤體疫情進(jìn)行分子流行病回顧性研究證實(shí),盡管在泰國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)主要流行鉤體菌株的血清型并沒(méi)有明顯改變,但在暴發(fā)區(qū)域感染病人分離鉤體菌株及同時(shí)期其他泰國(guó)省市的人和動(dòng)物宿主分離的MLST型主要為ST34型(分別占比76%、71%和88%),然而在泰國(guó)以前分離菌株中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ST34型,表明流行菌株管家基因發(fā)生變異,呈克隆性擴(kuò)張,形成主要新ST34基因型,在鉤體動(dòng)物宿主中具有較強(qiáng)的傳播能力,從而引起鉤體病的流行暴發(fā)[16]。因此,這些研究結(jié)果提示我們?cè)诋?dāng)前流行趨勢(shì)下,不僅要對(duì)鉤體流行菌株的血清群(型)進(jìn)行監(jiān)控,同時(shí)也應(yīng)加強(qiáng)鉤體分子流行病學(xué)的研究,掌握鉤體主要流行菌株基因型的動(dòng)態(tài)變化,從而為鉤體流行病暴發(fā)以及突發(fā)公共衛(wèi)生事件菌株溯源和疾病控制提供技術(shù)支撐。

    利益沖突:無(wú)

    引用本文格式:李 喆,張 影,杜宗利,等. 致病性鉤端螺旋體的多位點(diǎn)序列分型研究[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(2):95-101. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.024

    猜你喜歡
    鉤體問(wèn)號(hào)致病性
    好孩子畫(huà)報(bào)(2025年3期)2025-03-10 00:00:00
    淺析鉤端螺旋體菌種的長(zhǎng)期保存
    問(wèn)號(hào)君
    鉤端螺旋體EMJH培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用
    問(wèn)號(hào)和嘆號(hào)
    重載貨車車鉤鉤體的強(qiáng)度校核及抗疲勞設(shè)計(jì)
    膠體金在鉤體病監(jiān)測(cè)中相關(guān)因素的研究
    一例高致病性豬藍(lán)耳病的診治
    高致病性藍(lán)耳病的診斷和治療
    難纏的“小問(wèn)號(hào)”
    女性生殖器流出的白浆| 国产精品久久久久久精品古装| 一区二区三区四区激情视频| 男女国产视频网站| 性少妇av在线| 久久青草综合色| 国产乱来视频区| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲中文av在线| 国产极品天堂在线| 男女国产视频网站| 少妇 在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 日韩大码丰满熟妇| 久久综合国产亚洲精品| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品美女久久av网站| 国产成人精品久久二区二区91 | 宅男免费午夜| 国产精品三级大全| 国产成人欧美在线观看 | 午夜日韩欧美国产| 成人三级做爰电影| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产视频首页在线观看| 色视频在线一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲综合精品二区| a级毛片黄视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 丝袜在线中文字幕| 老熟女久久久| 国产精品久久久av美女十八| 免费在线观看完整版高清| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| netflix在线观看网站| 三上悠亚av全集在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 午夜日本视频在线| av网站在线播放免费| 最近手机中文字幕大全| 日本91视频免费播放| 90打野战视频偷拍视频| 一区二区av电影网| 丝袜美足系列| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线天堂中文资源库| 午夜av观看不卡| 成人影院久久| 婷婷色av中文字幕| 黄色视频不卡| 最新在线观看一区二区三区 | netflix在线观看网站| 悠悠久久av| kizo精华| 一区二区三区精品91| 伦理电影免费视频| 韩国av在线不卡| 久久婷婷青草| 丝袜人妻中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 人妻 亚洲 视频| 男的添女的下面高潮视频| 中文字幕色久视频| 亚洲综合精品二区| tube8黄色片| 国产成人精品在线电影| 中国三级夫妇交换| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 黑丝袜美女国产一区| 日本一区二区免费在线视频| 一级毛片我不卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日韩av免费高清视频| 99久国产av精品国产电影| 国产一区有黄有色的免费视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 曰老女人黄片| 男女无遮挡免费网站观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久久人妻精品一区果冻| 飞空精品影院首页| 国产探花极品一区二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 午夜激情av网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 九草在线视频观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产免费视频播放在线视频| 乱人伦中国视频| 天天添夜夜摸| 亚洲国产中文字幕在线视频| 最近的中文字幕免费完整| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品视频女| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲,欧美,日韩| 国产极品天堂在线| 大片免费播放器 马上看| 新久久久久国产一级毛片| 51午夜福利影视在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| a级毛片黄视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 综合色丁香网| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| av网站在线播放免费| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲,欧美精品.| 香蕉国产在线看| 久久99热这里只频精品6学生| 男人舔女人的私密视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品一区二区在线不卡| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲视频免费观看视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 卡戴珊不雅视频在线播放| 老熟女久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 天美传媒精品一区二区| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美精品一区二区大全| 黄色怎么调成土黄色| 国产一级毛片在线| 男女免费视频国产| 亚洲,欧美精品.| 免费观看a级毛片全部| 欧美久久黑人一区二区| 97在线人人人人妻| 男女边摸边吃奶| 国产人伦9x9x在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久99热这里只频精品6学生| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产深夜福利视频在线观看| 在线天堂中文资源库| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久久久久久久久大奶| 久久久久视频综合| 亚洲国产欧美网| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久亚洲国产成人精品v| 久久99一区二区三区| 七月丁香在线播放| 看免费av毛片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品免费久久久久久久清纯 | 丝袜美足系列| 国产一卡二卡三卡精品 | 99热全是精品| 人体艺术视频欧美日本| 久久久久久久久免费视频了| 国产色婷婷99| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 九草在线视频观看| 国产片内射在线| 亚洲国产成人一精品久久久| 伊人亚洲综合成人网| 人人澡人人妻人| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人黄色视频免费在线看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 两个人免费观看高清视频| 一区在线观看完整版| 亚洲综合精品二区| 亚洲精品一二三| 日本wwww免费看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲少妇的诱惑av| 视频在线观看一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 亚洲欧美色中文字幕在线| 成人手机av| 丰满少妇做爰视频| 人妻一区二区av| 极品人妻少妇av视频| 97精品久久久久久久久久精品| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲成国产人片在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| av.在线天堂| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产乱人偷精品视频| 精品福利永久在线观看| 丝袜美足系列| 高清视频免费观看一区二区| 多毛熟女@视频| 免费黄网站久久成人精品| 中文天堂在线官网| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 午夜福利一区二区在线看| 欧美日韩福利视频一区二区| 青春草国产在线视频| 国产男女超爽视频在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久热这里只有精品99| 99香蕉大伊视频| 在线 av 中文字幕| 国产一区二区激情短视频 | 日本wwww免费看| 免费黄色在线免费观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久久精品94久久精品| 少妇精品久久久久久久| 日本色播在线视频| 丝袜脚勾引网站| 岛国毛片在线播放| 久久热在线av| 两个人免费观看高清视频| 少妇人妻 视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 黄频高清免费视频| 大片免费播放器 马上看| 蜜桃在线观看..| 国产97色在线日韩免费| 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲av综合色区一区| 男女免费视频国产| 亚洲国产最新在线播放| 大香蕉久久网| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲欧洲国产日韩| 丝袜在线中文字幕| 在线观看免费日韩欧美大片| 水蜜桃什么品种好| 中文字幕人妻丝袜制服| 9191精品国产免费久久| 美女高潮到喷水免费观看| 男女国产视频网站| avwww免费| 亚洲伊人久久精品综合| 飞空精品影院首页| 街头女战士在线观看网站| 超碰成人久久| 国产av码专区亚洲av| 久久青草综合色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品免费大片| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲成人一二三区av| 一级片免费观看大全| 国产1区2区3区精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品久久蜜臀av无| 国产在线一区二区三区精| 街头女战士在线观看网站| a级毛片黄视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 精品人妻在线不人妻| 99久久精品国产亚洲精品| 黄色 视频免费看| 美女大奶头黄色视频| 91精品伊人久久大香线蕉| kizo精华| 国产探花极品一区二区| 制服人妻中文乱码| 国产xxxxx性猛交| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 丝袜喷水一区| 国产成人91sexporn| 婷婷成人精品国产| 黄片无遮挡物在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 一级片免费观看大全| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 波野结衣二区三区在线| 大片电影免费在线观看免费| 少妇人妻精品综合一区二区| 一区福利在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 婷婷成人精品国产| 国产av精品麻豆| 亚洲综合色网址| 欧美成人精品欧美一级黄| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜免费鲁丝| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av日韩在线播放| 激情五月婷婷亚洲| 免费看av在线观看网站| 国产免费现黄频在线看| xxx大片免费视频| 丝袜脚勾引网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 免费不卡黄色视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| h视频一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 午夜福利视频精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品 国内视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 一区福利在线观看| 国产男人的电影天堂91| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲国产av影院在线观看| 老司机靠b影院| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 老司机亚洲免费影院| 中文字幕人妻丝袜制服| 最近手机中文字幕大全| 精品国产露脸久久av麻豆| av国产久精品久网站免费入址| 女人久久www免费人成看片| 免费观看性生交大片5| 亚洲国产精品999| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久热这里只有精品99| 久久久久视频综合| 欧美 日韩 精品 国产| 黄频高清免费视频| 五月天丁香电影| 黄色视频不卡| 久久久久精品国产欧美久久久 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 男女之事视频高清在线观看 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美激情高清一区二区三区 | 一级,二级,三级黄色视频| 在线观看免费高清a一片| 捣出白浆h1v1| 久久久久久久精品精品| 捣出白浆h1v1| 国产1区2区3区精品| 看免费成人av毛片| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲在久久综合| 精品一区二区三区av网在线观看 | 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产成人一精品久久久| 少妇人妻 视频| 成年av动漫网址| 成人国产麻豆网| 中文字幕制服av| 香蕉国产在线看| 婷婷成人精品国产| 香蕉国产在线看| 在线观看www视频免费| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲精品在线美女| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲伊人色综图| 日本vs欧美在线观看视频| 国产乱人偷精品视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 七月丁香在线播放| 欧美在线黄色| 激情五月婷婷亚洲| 欧美黑人欧美精品刺激| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲成人av在线免费| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| 人妻一区二区av| 一级片'在线观看视频| 久热爱精品视频在线9| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 晚上一个人看的免费电影| 视频在线观看一区二区三区| 丝袜美足系列| 一个人免费看片子| 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美成人午夜精品| 欧美精品一区二区免费开放| 男人舔女人的私密视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 一级片'在线观看视频| 男人添女人高潮全过程视频| 久久ye,这里只有精品| 宅男免费午夜| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 捣出白浆h1v1| 日韩欧美精品免费久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲熟女毛片儿| 成人黄色视频免费在线看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 天天影视国产精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 深夜精品福利| 精品少妇内射三级| 精品免费久久久久久久清纯 | 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品第一国产精品| 伦理电影大哥的女人| netflix在线观看网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 最黄视频免费看| 热re99久久精品国产66热6| 欧美日韩视频精品一区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 免费不卡黄色视频| 国产淫语在线视频| 午夜日韩欧美国产| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产成人91sexporn| www.自偷自拍.com| 欧美日韩一级在线毛片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 五月开心婷婷网| 91老司机精品| 在线观看人妻少妇| 国产熟女午夜一区二区三区| 嫩草影院入口| 1024香蕉在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 9热在线视频观看99| 国产av码专区亚洲av| 丁香六月欧美| a级片在线免费高清观看视频| 大香蕉久久成人网| 在现免费观看毛片| 国产在线免费精品| 免费av中文字幕在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲av国产av综合av卡| 天美传媒精品一区二区| 蜜桃在线观看..| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 成年人午夜在线观看视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品久久蜜臀av无| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品卡一卡二卡四卡免费| 大话2 男鬼变身卡| 性色av一级| 国产一区二区在线观看av| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 99国产精品免费福利视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 满18在线观看网站| 最近的中文字幕免费完整| 黄片无遮挡物在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 免费av中文字幕在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 99久久人妻综合| 精品午夜福利在线看| 熟女av电影| 色播在线永久视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 美女午夜性视频免费| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 丝袜脚勾引网站| 两性夫妻黄色片| 老熟女久久久| 午夜老司机福利片| 天天影视国产精品| 国产成人av激情在线播放| 丝袜美腿诱惑在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久这里只有精品19| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产亚洲欧美精品永久| 在线精品无人区一区二区三| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品.久久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲人成电影观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 高清av免费在线| 亚洲精品一二三| 91精品伊人久久大香线蕉| 叶爱在线成人免费视频播放| 女性被躁到高潮视频| 黄片无遮挡物在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| av一本久久久久| 人妻一区二区av| 国产在视频线精品| a级毛片在线看网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 大码成人一级视频| 国产精品二区激情视频| 午夜91福利影院| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品久久久久久久久免| 精品久久蜜臀av无| 捣出白浆h1v1| av不卡在线播放| 国产 一区精品| 国产免费又黄又爽又色| 久久午夜综合久久蜜桃| videosex国产| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | av一本久久久久| 国产精品.久久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 尾随美女入室| 一区二区三区乱码不卡18| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 一级片'在线观看视频| www.av在线官网国产| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲精品av麻豆狂野| 母亲3免费完整高清在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 日韩av免费高清视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 少妇 在线观看| 国产一区二区在线观看av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 成人黄色视频免费在线看| 久久狼人影院| 丁香六月欧美| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲成人手机| 国产在线一区二区三区精| 美女午夜性视频免费| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩视频在线欧美| 最近最新中文字幕免费大全7| 婷婷色av中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲av综合色区一区| 69精品国产乱码久久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 午夜老司机福利片| 999久久久国产精品视频| 精品一区二区免费观看| videos熟女内射| 成年女人毛片免费观看观看9 | 青草久久国产| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲美女视频黄频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 最新在线观看一区二区三区 | 韩国高清视频一区二区三区| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲av在线观看美女高潮| 成年女人毛片免费观看观看9 | 在线免费观看不下载黄p国产| 极品人妻少妇av视频| 欧美黑人欧美精品刺激| www日本在线高清视频| 最黄视频免费看| 久久久欧美国产精品| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲一区二区三区欧美精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 综合色丁香网| av网站免费在线观看视频| 久久精品国产a三级三级三级| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产成人精品无人区| 免费黄网站久久成人精品| 成人漫画全彩无遮挡| 久久人妻熟女aⅴ| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久久精品94久久精品|