陜西省鼠疫耶爾森菌間區(qū)規(guī)律短回文重復(fù)序列基因分型研究及流行病學(xué)分析

聶守民，羅波艷，孫養(yǎng)信，范鎖平，常文輝，孫 杰，安翠紅

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的一種傳染性強(qiáng)、病死率高的烈性傳染病，是我國(guó)法定的甲類(lèi)1號(hào)傳染病[1]。陜西省鼠疫疫源地位于榆林市定邊縣， 1987年5月被判定為鼠疫疫源地，為鄂爾多斯高原長(zhǎng)爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分。1987-1988年、2000-2001年、2006年先后發(fā)生3次動(dòng)物間鼠疫流行。

CRISPR(間區(qū)規(guī)律短回文重復(fù)序列)是存在于細(xì)菌等原核生物基因中的能夠抵御外源DNA入侵的重復(fù)序列，因此也是一種免疫系統(tǒng)[2]。CRISPR由前導(dǎo)區(qū)(Leader)、正向重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和間隔區(qū)(Spacer)組成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。前導(dǎo)區(qū)種內(nèi)保守，種間差異顯著；正向重復(fù)序列被間隔序列隔開(kāi)形成一種重復(fù)，間隔序列的排布具有種群對(duì)應(yīng)關(guān)系[3-5]。CRISPR技術(shù)簡(jiǎn)便而且實(shí)用，在很多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。鼠疫菌基因中存在3個(gè)重復(fù)保守的CRISPR位點(diǎn)，利用這3個(gè)位點(diǎn)可對(duì)鼠疫菌進(jìn)行基因分型及進(jìn)化研究[6]。Cui等[7]利用CRISPR技術(shù)將我國(guó)分離自不同類(lèi)型自然疫源地的鼠疫菌進(jìn)行了基因分型，為我國(guó)更好的開(kāi)展鼠疫菌CRISPR分型工作起到了極大的推動(dòng)作用。為明確陜西省鼠疫菌基因分型及流行病學(xué)特征，對(duì)本省3次動(dòng)物間鼠疫流行期間分離的66株鼠疫菌進(jìn)行了CRISPR分型工作。

1 材料與方法

1.1 鼠疫菌菌株 66株鼠疫菌分離自1987-1988年、2000-2001年、2006年在陜西省定邊縣發(fā)生的3次動(dòng)物間鼠疫流行期間(表3)。

1.2 儀器設(shè)備 高速離心機(jī)，PCR擴(kuò)增儀，水平電泳儀，凝膠成像儀，移液器。

1.3 試劑耗材 超純水；2×PCR擴(kuò)增混合液(Taq Mix，全式金生物技術(shù)有限公司)；瓊脂糖；5×TBE電泳緩沖液；DNA染料；DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.4 3對(duì)引物 參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)3對(duì)CRISPR位點(diǎn)引物：YPa、YPb、YPc序列見(jiàn)表1，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 CRISPR引物名稱(chēng)及序列

1.5 PCR方法 30 μL體系：2×PCR Supermix 15 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，20 ng/μL DNA模板1 μL，超純水13 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.6 基因測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定后送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因雙向測(cè)序，獲得拼接序列。

1.7 數(shù)據(jù)分析 進(jìn)入http://minisatellites.u-psud.fr/，點(diǎn)擊“CRISPRfinder”，輸入拼接序列后點(diǎn)擊“FinderCRISPR”得到DR序列與Spacer序列的結(jié)果。根據(jù)Cui等[7]的方法進(jìn)行命名及分型，將結(jié)果匯總至Excel進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 間隔序列及陣列結(jié)果 陜西省分離的66株鼠疫菌的間隔序列為12種：al′、a2′、a3′、b1′、b2′、b29′、b1″、b2″、c1、c2、c3、c3′(表2)；陣列結(jié)果為5種：YPa位點(diǎn)：al′-a2′-a3′，YPb位點(diǎn)：b1′-b2′-b29′、b1″-b2″，YPc位點(diǎn)：c1-c2-c3、c1-c2-c3′(表3)。

表2 12個(gè)間隔序列堿基序列

2.2 CRISPR分型結(jié)果 66株鼠疫菌為2個(gè)基因型：1′(a1′-a2′-a3′-b1″-b2″-c1-c2-c3)和4′(a1′-a2′-a3′-b1′-b2′-b29′-c1-c2-c3′)，24株菌為1′，42株菌為4′(表3)。

表3 宿主、媒介信息及CRISPR基因分型結(jié)果

2.3 分離菌株比對(duì)結(jié)果 66株菌的分離宿主及媒介包括長(zhǎng)爪沙鼠、三趾跳鼠、荒漠毛庶鼠、黑線(xiàn)倉(cāng)鼠、禿病蚤蒙冀亞種、同形客蚤、二齒新蚤等。CRISPR結(jié)果顯示，陜西省菌株的間隔序列沒(méi)有出現(xiàn)新序列，但本研究所獲得間隔序列除c1、c2、c3、c3′有文獻(xiàn)[8]記載外，al′、a2′、a3′、b1′、b2′、b29′、b1″、b2″均無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。al′、a2′、a3′比al、a2、a3序列缺少后面T堿基，b1′比b1缺少前面T堿基，b1″與b1比缺少前面TC堿基，與b1′比缺少C堿基，b2′與b2比缺少前面G堿基，b2″與b2比缺少前面AG堿基，與b2′比缺少前面A堿基，b29′與b29比缺少前面A堿基，可以認(rèn)為前者是后者的變異體[17]。66株鼠疫菌Ypa序列均為al′-a2′-a3′，YPb 序列分為2種，為b1′-b2′-b29′和b1″-b2″2種，YPc 序列分為2種，c1-c2-c3和c1-c2-c3′，且YPb 序列b1′-b2′-b29′和c1-c2-c3′組合，b1″-b2″和c1-c2-c3組合。

1987-1988年流行年份，檢測(cè)10株菌，其中7株為a1′-a2′-a3′-b1″-b2″-c1-c2-c3，來(lái)自長(zhǎng)爪沙鼠、禿病蚤蒙冀亞種及同形客蚤，3株為a1′-a2′-a3′-b1′-b2′-b29′-c1-c2-c3′，均來(lái)自長(zhǎng)爪沙鼠；2000-2001年流行年份，檢測(cè)41株菌，其中39株為a1′-a2′-a3′-b1′-b2′-b29′-c1-c2-c3′，長(zhǎng)爪沙鼠、黑線(xiàn)倉(cāng)鼠、禿病蚤蒙冀亞種、二齒新蚤、荒漠毛庶鼠、三趾跳鼠，2株為a1′-a2-′a3′-b1″-b2″-c1-c2-c3，來(lái)自長(zhǎng)爪沙鼠、禿病蚤蒙冀亞種；2006流行年份，檢測(cè)15株菌，全為a1′-a2′-a3′-b1″-b2″-c1-c2-c3，長(zhǎng)爪沙鼠、禿病蚤蒙冀亞種及同形客蚤。不同年份，主導(dǎo)的基因型不同，1987-1988年、2000-2001年流行年份，2種基因型都有，1987-1988年，2006年以基因型1′為主，2000-2001年以基因型4′為主。

2.4 流行病學(xué)特征分析 登錄中國(guó)疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)的鼠疫防治管理信息系統(tǒng)，匯總2005-2020年的鼠疫監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，并與2005年之前的留存資料進(jìn)行鼠種及媒介種類(lèi)的比較，發(fā)現(xiàn)定邊縣鼠疫自然疫源地多年來(lái)的優(yōu)勢(shì)鼠種及主要媒介種類(lèi)并沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明生態(tài)環(huán)境一直保持在動(dòng)態(tài)平衡中。每年度的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)只在鼠密度和蚤指數(shù)上進(jìn)行波動(dòng)，這2個(gè)指標(biāo)對(duì)動(dòng)物間鼠疫的發(fā)生有很好的指示作用。本研究的3次動(dòng)物間鼠疫流行，菌株的優(yōu)勢(shì)基因型別有所不同，定邊鼠疫自然疫源地自2006年后未再發(fā)生鼠間疫情也未再分離到鼠疫菌株，所以菌株基因型別是否會(huì)再發(fā)生變化有待驗(yàn)證。2005-2020年鼠疫監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表4。

表4 2005-2020年定邊縣鼠疫疫源地鼠種及媒介種類(lèi)變化

3 討 論

陜西省鼠疫疫源地屬于長(zhǎng)爪沙鼠疫源地的一部分，分布于榆林市定邊縣，該縣地處陜西省西北角，是黃土高原與內(nèi)蒙古鄂爾多斯荒漠草原過(guò)渡地帶，系陜、甘、寧、蒙四省區(qū)交界地，1987-2006年發(fā)生過(guò)3起動(dòng)物鼠疫疫情，流行鼠疫菌生態(tài)型為鄂爾多斯高原型[9-10]，與內(nèi)蒙古、河北長(zhǎng)爪沙鼠鼠疫菌生態(tài)型一致。內(nèi)蒙古長(zhǎng)爪沙鼠鼠疫疫源地近2年比較活躍，2019年、2020年該疫源地先后出現(xiàn)了人間鼠疫病例，陜西鼠疫疫源地加強(qiáng)監(jiān)測(cè)外，開(kāi)展對(duì)歷次流行鼠疫菌基因分析和流行病學(xué)深入研究有重要意義。

CRISPR(間區(qū)規(guī)律短回文重復(fù)序列)作為一種實(shí)用且簡(jiǎn)便的基因分型技術(shù)，在鼠疫研究領(lǐng)域也得到了應(yīng)用。國(guó)內(nèi)，Cui等[7]利用CRISPR技術(shù)將我國(guó)鼠疫菌定為37種基因型，楊光璨等[11]利用該技術(shù)對(duì)云南省鼠疫菌進(jìn)行了分型研究，賀金榮等[12]對(duì)新疆鼠疫菌也進(jìn)行了CRISPR基因分型研究，甘肅省、四川省和河北省也相繼對(duì)本省鼠疫菌進(jìn)行了分型研究[13-15]；國(guó)外，Riehm等[16]利用CRISPR及MLVA技術(shù)對(duì)馬達(dá)加斯加的鼠疫分離菌株進(jìn)行了基因分型，Barros等[17]研究了CRISPR基因座在鼠疫菌微進(jìn)化過(guò)程中的動(dòng)態(tài)。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，已有越來(lái)越多的技術(shù)用于鼠疫菌的基因分型及溯源方面，差異片段分析(DFR)、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列分析(CRISPR)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)、單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(PFGE)、插入序列分析(IS)等。目前CRISPR技術(shù)在鼠疫菌基因分型研究中的應(yīng)用已經(jīng)淡化，可能原因是鼠疫菌存在的自然環(huán)境相對(duì)比較穩(wěn)定，菌株、噬菌體等外源性DNA及生態(tài)環(huán)境處于一種相對(duì)穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，所以CRISPR位點(diǎn)較難發(fā)生變化，而MLVA技術(shù)因其在眾多分型技術(shù)當(dāng)中具有很高的分辨性并且結(jié)果重復(fù)性也很穩(wěn)定，已經(jīng)越來(lái)越多應(yīng)用到鼠疫菌的基因分型當(dāng)中[18-20]。本文選用CRISPR基因分型技術(shù)，旨在建立陜西省鼠疫菌的基因數(shù)據(jù)庫(kù)，掌握66株鼠疫菌分離株的基因特征并與已報(bào)道的長(zhǎng)爪沙鼠疫源地的鼠疫菌分離株的CRISPR結(jié)果進(jìn)行比較，為陜西省更好地防控鼠疫提供科學(xué)依據(jù)。

長(zhǎng)爪沙鼠疫源地是內(nèi)蒙古乃至全國(guó)動(dòng)物疫情最為活躍的地區(qū)之一，一種生態(tài)型可以有不同的基因型[23]，本研究結(jié)果顯示，陜西省鼠疫菌CRISPR分型與內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原長(zhǎng)爪沙鼠疫源地鼠疫菌基因型相一致[21]，但不完全一樣，發(fā)現(xiàn)了al′、a2′、a3′、b1′、b2′、b29′、b1″及b2″8種變異體，提示疫情處置應(yīng)將生態(tài)分型與基因分型的聯(lián)合應(yīng)用可以更好地對(duì)疫情進(jìn)行溯源。目前，這8種變異體在已發(fā)表的內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原長(zhǎng)爪沙鼠疫源地鼠疫菌CRISPR基因分型并未出現(xiàn)，其他陣列結(jié)果與內(nèi)蒙古鄂爾多斯高原長(zhǎng)爪沙鼠疫源地鼠疫菌結(jié)果完全一致，變異體是否為陜西省特有有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。陜西省第1次動(dòng)物間鼠疫流行期間，雖然只分離到10株菌，但包含了2種基因型(1′和4′，以1′基因型為主)、12種間隔序列；第2次流行期間分離得到41株菌，以基因型4′為主，僅有2株菌為基因型1′；第3次流行期間分離得到15株菌，全部為基因型1′，說(shuō)明3次動(dòng)物間鼠疫是相互獨(dú)立的事件并不是疫情的延續(xù)，同時(shí)也說(shuō)明2種基因型是交替活躍的，可能與當(dāng)時(shí)的生態(tài)環(huán)境有關(guān)系。本研究在媒介分離得到的菌株基因型別與宿主分離得到的型別相一致。長(zhǎng)爪沙鼠疫源地包括陜西、河北、內(nèi)蒙古、寧夏、山西等疫源地，該疫源地面積大，北與蒙古、俄羅斯接壤，不同地區(qū)之間存在宿主及媒介之間的交流，容易導(dǎo)致輸入性疫情的發(fā)生并且還會(huì)使鼠疫耶爾森菌發(fā)生基因突變。長(zhǎng)爪沙鼠疫源地內(nèi)帶菌宿主與媒介種類(lèi)繁多，長(zhǎng)爪沙鼠作為主要宿主其繁殖能力強(qiáng)，鼠密度常年居高不下；跳蚤作為鼠疫傳播的主要媒介其種類(lèi)較多、數(shù)量巨大，為鼠疫耶爾森菌在自然界中的保存與傳播及菌株變異都提供了便利條件。

本研究確定了陜西省鼠疫疫源地鼠疫菌的CRISPR基因型，豐富了長(zhǎng)爪沙鼠鼠疫疫源地鼠疫耶爾森菌分離菌株的基因型，為進(jìn)一步做好陜西鼠疫防控工作提供了科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：聶守民，羅波艷，孫養(yǎng)信，等. 陜西省鼠疫耶爾森菌間區(qū)規(guī)律短回文重復(fù)序列基因分型研究及流行病學(xué)分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(2)：182-186. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.018