福建省鼠感染鉤端螺旋體調(diào)查和分離株基因種的鑒定

徐國英，潘敏楠，劉維俊，林代華，韓騰偉，周淑姮，王加熊，劉 菁，肖方震

鉤端螺旋體病是由問號鉤端螺旋體(簡稱鉤體)引起的一種常見的人獸共患傳染病。鼠類是鉤體重要宿主之一，鉤體棲息在宿主的腎小管中，隨尿液排出到環(huán)境中。人通過參加農(nóng)業(yè)勞動、接觸疫水或參加抗洪搶險及涉水，間接接觸污染水源，環(huán)境中的鉤體通過皮膚、黏膜進入機體而感染。福建省曾是我國鉤體病重點流行地區(qū)，疫區(qū)分布廣泛，全省各縣市均有病例報告。20世紀(jì)曾發(fā)生過較大流行，自1992年起，雖疫情較為平穩(wěn)，但仍有局部暴發(fā)流行。近年福建省疫報病例數(shù)居全國前列，關(guān)于福建省鉤體病的基因組學(xué)及分子流行病學(xué)特征尚未見詳細(xì)報道。本研究根據(jù)2015-2019年福建省鉤體病疫情選取14個調(diào)查點進行鼠類鉤端螺旋體的調(diào)查和監(jiān)測，了解福建省不同地區(qū)鼠中鉤體的感染狀況，同時對從宿主動物鼠類監(jiān)測分離的23株鉤體分離株，擴增菌株的16SrRNA基因并對其進行基因種鑒定，初步探討福建省鉤體基因種的特征，為福建省鉤體病預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 2015-2019年在閩東(長樂、福清、閩侯、羅源、連江和霞浦)、閩西(武平、永安、大田和泰寧)、閩南(長泰和德化)和閩北(建陽和邵武)共14個縣市，采用籠夜法捕鼠，對捕獲鼠進行種類、性別、成幼等鑒定，計算鼠捕獲率和鼠種組成，采集鼠腎、鼠心血等進行分離培養(yǎng)，采集鼠血清檢測鉤體抗體。

1.2 菌株來源 本研究選取福建省2005年以來從嚙齒類動物監(jiān)測中分離到的23株鉤體分離株，分別來自漳州(長泰9株)、龍巖(武平7株)、福州(長樂1株、福清1株、閩侯1株和羅源1株)、和南平(建陽2株)、三明(將樂1株)共5個地區(qū)，菌株具體信息見表1。

表1 福建省鉤端螺旋體分離株基本信息

1.3 主要試劑 EMJH鉤體培養(yǎng)基由美國BD公司生產(chǎn)，PCR Premix 和2 000bp DNA Marker(購自 TaKaRa 公司)，基因組提取采用QIAamp DNA Mini Kit(購自QIAGEN公司)。

1.4 血清群鑒定 采用暗視野顯微鏡凝集試驗(Microscopic agglutination test, MAT)，用15群15型鉤體參考菌株診斷血清(來源于中國食品藥品檢定研究所)進行血清凝集試驗，在暗視野顯微鏡下觀察，以出現(xiàn)50%菌體凝集菌群為最終鑒定血清群。

1.5 分離菌株基因組提取 分離菌株在EMJH鉤體液態(tài)培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)7～10 d，達(dá)到對數(shù)生長期提取基因組DNA，操作方法按試劑盒說明書進行，提取的DNA保存于-20 ℃冰箱中。

1.6 16SrRNA基因PCR擴增 參照參考文獻(xiàn)[1]報道的引物序列進行PCR擴增，引物序列如下： fD1: 5′-CCG AAT TCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CCT GGC TCAG -3′rP2: 5′-CCC GGG ATC CAA GCT TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACTT-3′引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用50 μL PCR反應(yīng)體系擴增， Premix Taq 25 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物各2 μL(10 μmol/L)，用雙蒸水補足至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，50 ℃ 5 s，72 ℃ 90 s，共設(shè)35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠在電壓100 V條件下電泳40 min后，在凝膠成像儀中觀察目標(biāo)條帶。

1.7 核酸序列測定及分析 擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序，測序得到的DNA片段序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)BLAST進行同源性分析，同時應(yīng)用MEGA6.0軟件，并以GenBank中已知的17種鉤體菌株基因序列作為參照，以鄰接法(Neighbor -Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用Bootstrap驗證(n=1000)。

2 結(jié) 果

2.1 鼠捕獲率和鼠種構(gòu)成 共布放鼠籠18 040籠次，捕獲鼠類1 221只，鼠平均捕獲率為6.77只/100籠；鼠種構(gòu)成以黃毛鼠、黃胸鼠、針毛鼠及褐家鼠為主，分別占40.87%(499/1 221)、19.57%(239/1 221)、16.79%(205/1 221)及8.85%(108/1 221)。閩東鼠捕獲率最高，為8.95只/100籠，其次是閩西，為6.46只/100籠，閩北最低為5.97只/100籠(表2)。

表2 福建省鼠捕獲率及鼠種構(gòu)成

2.2 不同鼠種鉤體感染狀況 捕獲181 221只鼠中有706只鼠采集心血，其中207只鼠血清感染鉤體，陽性率為29.32%。其中黃毛鼠、褐家鼠和青毛鼠感染率較高，依次為42.16%(121/287)、26.00%(13/50)、22.22%(14/63)。不同鼠種的血清鉤體感染率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher檢驗，P<0.05)(表3)。

2.3 不同地區(qū)鉤體感染狀況 207只感染鉤體的鼠中血主要感染菌群為爪哇群和秋季群，分別占53.62%(111/207)和20.77%(41/207)。表3顯示，不同地區(qū)鼠感染率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.55，P=0.91>0.05)。

表3 福建省不同鼠種血清鉤體抗體檢測及菌群分布

表4 福建省不同地區(qū)鼠血清鉤體抗體檢測及菌群分布

2.4 PCR擴增的結(jié)果 23株鉤體分離株擴增16SrRNA基因，凝膠電泳顯示，條帶處于約1 484 bp位置，與預(yù)期目標(biāo)條帶一致(見圖1)。

M為DL2000 DNA Marker；1～12、14～24為分離菌株；25為陽性對照(黃疸出血群)；13、26為陰性對照。

2.5 基因種的鑒定 23株鉤體分離株的16SrRNA基因測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的鉤體16SrRNA基因序列比對，同源性>99.7%認(rèn)為是同一個基因種，結(jié)果顯示：23株菌株中屬于致病性的有13株，其中隸屬于L.borgpetersenii基因種有8株，分別是編號CL15M6、MH17M38、WP18M7、WP18M30、WP19M35、WP19M51、WP19M37、LY19M8，血清群均為爪哇群。屬于L.interrogans基因種有5株，分別是CT18M1、CT18M41、FQ18M12、JY19M37、JY19M19，其中CT18M41、FQ18M12兩株血清群鑒定為巴達(dá)維亞群，CT18M1為致熱群，其余2株為黃疸出血群。剩余10株屬于非致病的L.meyeri基因種，編號分別是CT05M6、CT07M55、CT08M1、CT08M12、CT12M4、CT13M20、CT14M12、JL12M2、WP14M2、WP14M44，血清群鑒定為不凝集。

2.6 序列分析結(jié)果 采用MEGA6.0軟件，選擇鄰接法建樹(Bootstrap=1000)，結(jié)果顯示：福建省鼠中分離保存的23株鉤端螺旋體，16SrRNA基因與L.borgpetersenii(AY887899)基因種序列處于同一分支的有8株，分別是來自閩東的3株即長樂區(qū)、閩侯區(qū)、羅源縣(各1株)、閩西的武平縣(5株)，與L.interrogans(AY996791)基因種序列在同一分支的有5株，分別是閩南2株即長泰縣(2株)、閩東福清縣(1株)以及閩北建陽區(qū)(2株)，與非致病的L.meyeri(AY631889)基因種處于同一分支的有10株鉤體菌株，分別來自閩南長泰縣(7株)、閩西武平縣(2株)及將樂縣(1株)。見圖2。

圖2 鉤端螺旋體16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討 論

鼠類作為鉤體的重要儲存宿主，在鉤體病的傳播、流行中起著重要作用。福建省是鉤體病的老疫區(qū)，地理環(huán)境復(fù)雜，氣候濕潤，嚙齒類動物豐富，感染鉤體菌群眾多[2]。目前，國際上對鉤端螺旋體的分類方法主要有血清學(xué)分類和基因分類2種[3]。鉤體菌群菌型復(fù)雜，在全球范圍內(nèi)，至少包括24個血清群300多個血清型，基因種至少也有18個。傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法需要保存大量的標(biāo)準(zhǔn)菌株及多種抗血清，存在操作繁瑣，費時費力且難以實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化等不足之處，不能反映菌株之間基因上的聯(lián)系，而基因分類是通過比較基因DNA片段核苷酸序列同源性，繼而從遺傳學(xué)和分子生物學(xué)水平上進一步闡明不同鉤體菌株的差別。細(xì)菌的16SrRNA具有高度的保守性已被廣泛用于鉤體基因種鑒定、分子進化的分析指標(biāo)[4]。

本研究根據(jù)2015-2019年福建省鉤體病疫情選取14個調(diào)查點進行鼠類鉤端螺旋體的調(diào)查和監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)福建省每個調(diào)查點的鼠類均有鉤體的感染，不同鼠種血清均有鉤體抗體檢出，但優(yōu)勢鼠種黃毛鼠、針毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠感染率位于前列，尤以黃毛鼠最高，與2011-2016年福建省[2]的調(diào)查結(jié)果基本一致，與趙明惠[5]調(diào)查江西口岸及國檢監(jiān)管區(qū)鼠類的狀況相似，也是從褐家鼠、社鼠、黃毛鼠及黃胸鼠中檢測出鉤體的感染。不同地區(qū)鼠類鉤體感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與2011-2016年福建省[2]的調(diào)查結(jié)果即閩北最高不吻合，可能與此次閩北采樣數(shù)較少，不能較全面反映該地狀況有關(guān)。

本研究還對自2005年以來在鉤體病嚙齒動物監(jiān)測中分離到且在液體培養(yǎng)基傳代保存的23株鉤體菌株進行基因種鑒定和序列分析，發(fā)現(xiàn)福建省鼠類的鉤體基因種以致病性為主，也存在非致病性基因種。同時發(fā)現(xiàn)基因種的分類與血清群的分類存在著交叉的現(xiàn)象，即致病性基因種含有爪哇群，非致病性基因種也有爪哇群，與嚴(yán)杰[3]描述的情況(不同基因種的鉤體可表達(dá)同一血清型特異抗原)一致。與其它省份的鉤體基因種有所不同，如貴州省李世軍從黑線姬鼠分離的3株菌株均為L．interrogans基因種[6-7]，張翠彩[8]對江西省的2013年以來嚙齒類動物監(jiān)測中分離到的27株鉤體分離株進行基因種的鑒定，發(fā)現(xiàn)江西省菌株隸屬于L.interrogans和L.borgpetersenii2個致病性基因種，其中L.interrogans為江西省主要優(yōu)勢基因種，占77. 78%(21/27)。Florence等[9]對法國里昂城市的鼠類進行鉤體檢測，發(fā)現(xiàn)L.interrogans為主要基因種，Benacer等[10]對馬來西亞半島的城市鼠類進行鉤體檢測，研究發(fā)現(xiàn)：L.interrogans(59%，23/39)和L.borgpetersenii(41%，16/39)2個致病性基因種為主要基因種，Voronina等[11]對俄羅斯29株鉤體分離株進行分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)存在L.interrogans、L.kirschneri和L.borgpetersenii3個基因種。綜上，國內(nèi)及國際鼠類攜帶的鉤體常見致病基因種為L.interrogans和L.borgpetersenii基因種，以L.interrogans基因種為主，但不同地區(qū)和國家還存在一些特定的基因種，比如我省鉤體菌株除致病性基因種外，還存在非致病性基因種10株，且這10株均是2014年及以前分離的菌株，不知是在鉤體液體培養(yǎng)基傳代保存時間較長，使其抗原性及致病性發(fā)生改變，或是某些基因片段發(fā)生變化所致，有待今后繼續(xù)研究。

研究發(fā)現(xiàn)我省優(yōu)勢鼠種攜帶致病性基因種鉤體。這13株致病性基因種鉤體菌株分別是從黃毛鼠(6株)、黃胸鼠(4株)、針毛鼠(2株)、社鼠(1株)分離到，10株非致病性基因種從黃毛鼠分離到5株，黃胸鼠分離到2株，針毛鼠分離到2株，白腹巨鼠分離到1株，說明我省優(yōu)勢鼠種黃毛鼠、黃胸鼠、針毛鼠和白腹巨鼠均攜帶有鉤體。國內(nèi)貴州省劉英是從黑線姬鼠分離到56株菌株[12]，張翠彩[8]從嚙齒類動物監(jiān)測中分離到的27株鉤體分離株中有16株是從黑線姬鼠分離到，9株從黃毛鼠分離得到。Florence等[9]對法國里昂城市的鼠類調(diào)查以及Benacer等[10]對馬來西亞半島的城市鼠類的調(diào)查發(fā)現(xiàn)是以褐家鼠為主，不同國家和地區(qū)，鼠種不同，攜帶的鉤體基因種也會有所差別，因此需要加強監(jiān)測，做好鉤體病的傳染源控制即滅鼠工作。

從攜帶鉤體菌株的地點分布來看，13株致病性鉤體分離地點分布在閩西的武平縣5株，閩南的長泰縣2株和閩北的建陽區(qū)2株，閩東的閩侯區(qū)、羅源縣、長樂區(qū)、福清市各分離出1株。非致病性菌株10株分布的地點是閩南的長泰縣占7株，閩西的武平縣占2株，將樂縣占1株，地點分布比較廣泛即在我省的東部、南部、西部和北部地區(qū)的鼠種中均分離出鉤體菌株，與張翠彩[7]報道的江西省鼠種鉤體基因種的分布存在一定的地域差異，說明我省各地的嚙齒動物均有感染鉤體，應(yīng)加強各地鼠種感染鉤體的監(jiān)測工作。

本研究也存在一定不足，其一是選取的調(diào)查監(jiān)測面還不夠廣泛，選用的鉤體分離菌株來源于監(jiān)測點的不同檢測年份，有些菌株距離現(xiàn)在相對比較久遠(yuǎn)，在液體培養(yǎng)基傳代過程中可能出現(xiàn)抗原性與致病性的改變；其二是菌株數(shù)量相對比較少，今后將繼續(xù)擴大樣本量和不同宿主來源，對鉤體分離株的致病力和遺傳進化特征等進行研究。

利益沖突：無

引用本文格式：徐國英，潘敏楠，劉維俊，等. 福建省鼠感染鉤端螺旋體調(diào)查和分離株基因種的鑒定[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(2)：175-181. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.016