抗VEGF治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性的回顧與展望

王雅芳，劉 洋，羅學(xué)廷

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院眼科，國(guó)家眼部疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市眼底病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海眼視覺(jué)與光醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，上海市眼科疾病精準(zhǔn)診療工程技術(shù)研究中心，上海200080

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是一種導(dǎo)致老年人嚴(yán)重視力減退甚至失明的眼?。?］。AMD 分為干性和濕性，分別以地圖樣萎縮（geographic atrophy，GA）和脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）為特征。由于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是CNV 生成的關(guān)鍵介質(zhì)［2］，阻斷或中和VEGF 表達(dá)的藥物，如貝伐單抗、雷珠單抗、阿柏西普及康柏西普等在近10 年的臨床治療中成為主要選擇。目前，玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物，存在并發(fā)眼內(nèi)炎、葡萄膜炎、醫(yī)源性玻璃體出血及視網(wǎng)膜色素上皮撕裂等風(fēng)險(xiǎn)［3-5］。由于抗VEGF 藥物半衰期短，為了維持功效，需要每4～8周進(jìn)行重復(fù)的眼內(nèi)注射。頻繁注射帶來(lái)的不便及高昂的價(jià)格使患者的依從性降低。VEGF不僅是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的因子，其在視網(wǎng)膜細(xì)胞中也廣泛表達(dá)，故對(duì)維持視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用［6］。長(zhǎng)期的抗VEGF 治療可能會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）萎縮、脈絡(luò)膜萎縮及GA 的發(fā)生率升高［7-9］。多中心臨床研究［10］發(fā)現(xiàn)：部分患者在抗VEGF治療7年后，其視力降至基線甚至基線水平以下，可伴隨黃斑萎縮和纖維化的發(fā)生。因此，使用抗VEGF藥物靶向抑制CNV同時(shí)，需要注重保護(hù)光感受器和RPE功能。為了改善濕性AMD 患者的治療效果，必須開(kāi)發(fā)出替代或補(bǔ)充治療來(lái)降低視網(wǎng)膜的毒性反應(yīng)。本文就抗VEGF治療濕性AMD的研究進(jìn)展做一綜述。

1 Anti-VEGF基因治療

基因治療具備長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)治療性蛋白以治療視網(wǎng)膜疾病的潛力，可以較好地解決抗VEGF 藥物多次注射帶來(lái)的問(wèn)題。腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是用于臨床基因治療較有前景的基因載體之一，其介導(dǎo)的基因遞送可使外源基因在體內(nèi)感染組織長(zhǎng)期表達(dá)。RPE、Muller 及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在病理狀態(tài)下都存在分泌VEGF的可能，這便造成了靶細(xì)胞種類多或難以轉(zhuǎn)染的問(wèn)題。而重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV） 介導(dǎo)的分泌基因療法（secretion gene therapy，SGT）恰好解決這一困擾，其顯著優(yōu)勢(shì)在于轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞不一定是產(chǎn)生VEGF 的細(xì)胞，而是較易獲得和高效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，緊接著借助組織間液流動(dòng)和擴(kuò)散來(lái)促進(jìn)重組病毒產(chǎn)生的治療劑（分泌蛋白）的分布和遞送［11］。

1.1 AAV-sFLT-1

CNV 的治療靶點(diǎn)——VEGF 主要通過(guò)FLT-1（fms 樣酪 氨 酸 激 酶/VEGFR1） 和FLK-1/KDR （胎 肝 激 酶/VEGFR2） 高親和力結(jié)合，介導(dǎo)血管生成［12］。其中，F(xiàn)LT-1 與VEGF 的親和力遠(yuǎn)高于FLK-1/KDR。作為處于胞外結(jié)構(gòu)域的FLT-1 天然存在的截短和分泌形式，sFLT-1 與VEGF 結(jié)合后無(wú)法啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)與FLT-1 和FLK-1/KDR 的胞外結(jié)合區(qū)形成異二聚化復(fù)合物，最終抑制了VEGF的促血管生成的作用［13］。

Lai等［11］在大鼠視網(wǎng)膜下注射編碼sFLT-1的rAAV載體，重組載體于注射區(qū)域轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其分泌的sFLT-1 在視網(wǎng)膜擴(kuò)散并且具備長(zhǎng)期抑制激光誘導(dǎo)的CNV 的能力。為了進(jìn)一步觀測(cè)AAV-sFLT-1 的長(zhǎng)久療效，該團(tuán)隊(duì)使用光感受器特異性VEGF 上調(diào)的Vegf029 轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)AAV 的轉(zhuǎn)基因表達(dá)持續(xù)8 個(gè)月，抑制了新生血管的生成，同時(shí)維持了視網(wǎng)膜的形態(tài)和功能，且沒(méi)有出現(xiàn)臨床或組織學(xué)上可檢測(cè)到的毒性現(xiàn)象［14］。視網(wǎng)膜下注射該病毒載體在眼中誘導(dǎo)瞬時(shí)和自限性炎癥反應(yīng)，但是其對(duì)sFLT-1的表達(dá)并沒(méi)有影響，也未引起局部眼組織以及宿主系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)［15］。Lai等［14］進(jìn)一步選擇激光誘導(dǎo)猴CNV的模型作為治療對(duì)象，因?yàn)楹镅塾幸暰W(wǎng)膜-脈絡(luò)膜循環(huán)和黃斑解剖結(jié)構(gòu)，與人眼更為相似。該研究將AAV 載體注射至黃斑區(qū)，其抗血管療效持續(xù)17 個(gè)月，且未造成視網(wǎng)膜的損傷及炎癥。

鑒于用AAV-sFLT-1 于非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的視網(wǎng)膜下注射并不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不良事件、視力障礙、眼外載體的傳播及對(duì)機(jī)體有害的免疫反應(yīng)［16］，研究者開(kāi)展了相關(guān)的臨床試驗(yàn)。Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，6例繼發(fā)中心凹下活動(dòng)性CNV 的AMD 患者參與視網(wǎng)膜下AAV-sFLT-1的注射研究，在1 年的隨訪期間內(nèi)沒(méi)有發(fā)生歸因于AAV-sFLT-1 的眼部或全身不良事件［17］。該試驗(yàn)再次驗(yàn)證了該基因治療良好的安全性及耐受性。Ⅱa 期試驗(yàn)將32 例活動(dòng)性的濕性AMD 患者以2∶1（基因治療∶對(duì)照）的比例隨機(jī)化分組，進(jìn)行52 周的隨訪。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：sFLT-1 蛋白在靶組織（視網(wǎng)膜）外的生物分布是有限的和短暫的，并沒(méi)有引起機(jī)體的系統(tǒng)性反應(yīng)；同時(shí)，相較于對(duì)照組，基因治療組的雷珠單抗治療（有活動(dòng)性CNV 時(shí)，施行搶救治療）次數(shù)較少［18］。Ⅰ期和Ⅱa期入組人員長(zhǎng)達(dá)3年的隨訪結(jié)果顯示，接受基因治療的患者具備良好的耐受性且發(fā)生GA的傾向性較低，始終保持著較有意義的視覺(jué)改善，極具替代傳統(tǒng)的抗VEGF治療的潛力［19］。

視網(wǎng)膜下注射的方式相較于玻璃體腔注射具有較高的轉(zhuǎn)染效率且不易誘發(fā)抗AAV 血清抗體，但術(shù)中需要切除部分玻璃體，因此術(shù)后視網(wǎng)膜脫離和白內(nèi)障的風(fēng)險(xiǎn)也隨之而至［20］。玻璃體腔注射的侵襲性較小，是長(zhǎng)期以來(lái)抗VEGF 采用的給藥模式，相關(guān)研究同樣有所開(kāi)展。在小鼠高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中，玻璃體腔注射AAV2-sFLT-1有效抑制視網(wǎng)膜血管的生成，同時(shí)表達(dá)期長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月且未檢測(cè)到組織學(xué)的毒性［21］。在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的CNV 模型中，AAV 有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同樣有著抑制血管生成的功效［22］。通過(guò)在食蟹猴眼內(nèi)施用AAV2-sFLT-1后進(jìn)行徹底和廣泛的安全性評(píng)估發(fā)現(xiàn)：AAV 衣殼可誘發(fā)輕度炎癥但可自行消退，而視網(wǎng)膜沒(méi)有組織學(xué)和功能學(xué)上的損害［23］。Heier 等［20］開(kāi)展了玻璃體腔注射AAV2-sFLT-1的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示安全且耐受性良好。

1.2 AAV-VEGF-Trap

研究［24］顯示，與對(duì)照組相比，盡管使用AAV-sFLT-1的治療組的雷珠單抗復(fù)治率較低，但仍需要補(bǔ)充推注抗VEGF 藥物，并不能實(shí)現(xiàn)基因治療單次注射的顯著優(yōu)勢(shì)。這可能是因?yàn)榕c常規(guī)使用的抗VEGF 藥物（阿柏西普或雷珠單抗） 相比，sFLT-1 對(duì)VEGF-A 的親和力較低。Aflibercept是一種重組融合蛋白，由VEGF受體-1和受體-2 的胞外結(jié)構(gòu)域部分同IgG1 的Fc 部分融合而成［25］。有研究［24］發(fā)現(xiàn)：玻璃體腔注射介導(dǎo)aflibercept過(guò)表達(dá)的rAAV能夠有效抑制激光誘導(dǎo)的小鼠模型中CNV 的形成。由于aflibercept 過(guò)表達(dá)可能存在視網(wǎng)膜毒性，需要調(diào)節(jié)應(yīng)用時(shí)間和劑量，為此該研究引入了由適配體結(jié)構(gòu)域（配體傳感原件）與表達(dá)平臺(tái)（核酶）融合而成的核糖開(kāi)關(guān)?；罨潴w與適配體結(jié)構(gòu)域結(jié)合后依次活化核酶，進(jìn)而改變構(gòu)象來(lái)發(fā)揮作用。該開(kāi)關(guān)分為“ON”型及“OFF”型，前者在和適配體結(jié)合后，目的蛋白由低表達(dá)轉(zhuǎn)為高表達(dá)狀態(tài)，“OFF”型則與之相反［26］。Reid 等［24］將“OFF”型TC45 核糖開(kāi)關(guān)（活化配體為四環(huán)素） 摻入rAAVaflibercept 轉(zhuǎn)基因盒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服四環(huán)素可以有效抑制眼內(nèi)aflibercept的表達(dá)，CNV的嚴(yán)重程度也隨之改變。通過(guò)調(diào)節(jié)口服活化配體的劑量和頻率，及時(shí)調(diào)整轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，將產(chǎn)生更強(qiáng)的臨床適應(yīng)性且有望實(shí)現(xiàn)患者的個(gè)性化治療。目前，該研究尚未開(kāi)展相關(guān)的臨床試驗(yàn)。

1.3 RGX-314（AAV-anti-VEGF Fab）

RGX-314 是由Regenxbio 公司研制開(kāi)發(fā)的編碼單克隆抗體片段基因的NAV AAV8 載體，其表達(dá)的抗VEGF 的Fab 結(jié)構(gòu)域可中和VEGF 活性。通過(guò)該基因療法，在動(dòng)物的眼睛中檢測(cè)到抗VEGF 蛋白，抗VEGF Fab mRNA 和蛋白在整個(gè)視網(wǎng)膜中廣泛分布［27］。在具有與黃斑變性相似癥狀的臨床前動(dòng)物模型中，單次視網(wǎng)膜下注射RGX-314后觀察到顯著的劑量依賴性的血管生長(zhǎng)減少，并且延緩了疾病的進(jìn)展［27］。通過(guò)RGX-314 在非靈長(zhǎng)類動(dòng)物依賴于臨床劑量的毒性研究［28］發(fā)現(xiàn)：1×1010vg/眼劑量下的RGX-314 沒(méi)有誘發(fā)任何視網(wǎng)膜功能損傷；而在1×1012vg/眼的高劑量下出現(xiàn)猴的視網(wǎng)膜電圖波幅降低，至3個(gè)月時(shí)視網(wǎng)膜達(dá)到最大程度損害，且穩(wěn)定于該水平。研究人員對(duì)劑量的調(diào)控引起重視。該公司發(fā)布的臨床Ⅰ期試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：所有劑量下的RGX-314注射均安全且耐受良好，其蛋白表達(dá)水平具有劑量依賴性［29］。

2 抗血小板衍生生長(zhǎng)因子和抗VEGF 的聯(lián)合治療

病理性新生血管對(duì)于單一抗VEGF療法存在抗性［30］。血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)分泌血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）募集周細(xì)胞［31］。周細(xì)胞一方面覆蓋內(nèi)皮細(xì)胞給予結(jié)構(gòu)的支持，另一方面通過(guò)自分泌或旁分泌的方式為其提供VEGF 給予功能的支持［31］，由此來(lái)建立成熟的血管系統(tǒng)并減輕了對(duì)外源性VEGF 的依賴［32］。此外，有試驗(yàn)表明：?jiǎn)我坏目筕EGF 治療并不能阻止視網(wǎng)膜下纖維化的發(fā)生，患者最終出現(xiàn)不可逆的視力損害［33］。脈絡(luò)膜周細(xì)胞在損傷早期滲入視網(wǎng)膜下，參與細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，對(duì)于纖維化的形成起著重要作用［34］。從CNV的形成到其愈合反應(yīng)后的纖維化，單一抗VEGF 治療的局限性與周細(xì)胞密切相關(guān)，抗PDGF 的治療也因此逐漸走進(jìn)人們的視野。 E10030 （Fovista，Ophthotech 公司）是一種32 聚乙二醇化的DNA 適配子，分別選擇性結(jié)合PDGF-BB 和PDGF-AB 的同源二聚體及異二聚體，從而破壞與其同源酪氨酸激酶受體的相互作用［35］。E10030 可以減少周細(xì)胞對(duì)血管的覆蓋［36］。也有研究［37］發(fā)現(xiàn)，抗PDGF 與抗VEGF 有協(xié)同抑制小鼠CNV生成的作用。

Jaffe 等［30］進(jìn)行了在玻璃體腔內(nèi)聯(lián)合注射E10030 和雷珠單抗的為期12周的Ⅰ期臨床試驗(yàn)：在E10030劑量遞增下（0.03～3 mg），機(jī)體的耐受性良好，并未檢測(cè)到眼內(nèi)和系統(tǒng)毒性；并且，患者的視敏度（visual acuity，VA）得以提升且中心凹厚度下降，CNV 減退。由此可見(jiàn)，E10030 和雷珠單抗的聯(lián)合治療具有有利的短期安全性［30］。在對(duì)449 例患者為期24 周隨訪的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，從抗VEGF單一療法（平均VA：6.5個(gè)ETDERS字母數(shù)）、0.3 mg E10030 聯(lián)合治療（平均VA：8.8 個(gè)ETDERS字母數(shù)）及1.5 mg E10030 聯(lián)合治療（平均VA：10.6 個(gè)ETDERS 字母數(shù)）的療效來(lái)看，其劑量-反應(yīng)關(guān)系是明顯的；同時(shí)，1.5 mg E10030聯(lián)合治療下患者的VA改善度的相對(duì)大小逐漸增加［35］?；仡櫺匝诒畏治鲲@示E10030聯(lián)合治療與抗VEGF 單藥治療比較，在限制纖維化的發(fā)展方面更有效［35］。然而，Ophthotech 公司發(fā)布Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果：1.5 mg E10030 聯(lián)合阿柏西普或貝伐單抗治療12 個(gè)月后，相較于對(duì)照組，平均VA 變動(dòng)基本少于1 個(gè)ETDERS 字母數(shù)，且記錄數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［38］。有研究［39］發(fā)現(xiàn)：接受抗VEGF 治療后2 年，將近半數(shù)患者出現(xiàn)了眼底纖維化。由此推測(cè)，由于該Ⅲ期試驗(yàn)采用1年作為評(píng)估終點(diǎn)，此時(shí)，患者眼底可能還處于CNV 反復(fù)生成的時(shí)期，尚未進(jìn)入纖維化階段，使得抗PDGF藥物尚且無(wú)法發(fā)揮作用，導(dǎo)致最終試驗(yàn)結(jié)果不甚理想。此外，隨機(jī)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在抗VEGF 治療后第1 年觀測(cè)到VA 的改善，而在第2年VA 的改善度維持或提高［40］。也許Ⅲ期試驗(yàn)的治療效果在短期之內(nèi)無(wú)法體現(xiàn)，適當(dāng)延長(zhǎng)治療終點(diǎn)可能會(huì)觀察到VA較為明顯的改善。

3 補(bǔ)體相關(guān)基因治療

機(jī)體對(duì)抗VEGF 藥物的反應(yīng)性受到了補(bǔ)體因子H（complement factor H，CFH）風(fēng)險(xiǎn)等位基因的影響［41］。CFH 基因負(fù)責(zé)編碼補(bǔ)體旁路途徑的主要調(diào)節(jié)因子。高風(fēng)險(xiǎn)CFH 基因型可能通過(guò)增加老化脈絡(luò)膜毛細(xì)血管周圍的攻膜復(fù)合物（membrane attack complex，MAC）的沉積來(lái)影響罹患AMD 的風(fēng)險(xiǎn)［42］。此外，研究發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)體通路中復(fù)合物的沉積可能通過(guò)破壞脈絡(luò)膜毛細(xì)血管中的內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血管密度降低，進(jìn)而促進(jìn)玻璃膜疣（RPE 異常代謝物沉積）的形成，最終介導(dǎo)GA的發(fā)生［43］。而GA正好是長(zhǎng)期抗VEGF 出現(xiàn)的不良反應(yīng)之一。保護(hù)脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解損傷的方法將有望彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，更有效地治療AMD。在激光誘導(dǎo)的CNV 模型中，MAC 有顯著沉積的現(xiàn)象［44］。CD59，也稱為反應(yīng)性裂解的保護(hù)素或膜抑制劑，可以有效地抑制膜上MAC 的形成［45］。

動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)：視網(wǎng)膜下注射表達(dá)hCD59（human CD59）的重組腺病毒（adenovirus，Ad）載體能夠有效阻礙RPE 細(xì)胞上MAC 沉積及免除MAC 介導(dǎo)的損傷和囊泡化［46］。通過(guò)視網(wǎng)膜下注射的Ad載體或玻璃體腔注射的AAV載體遞送人可溶性CD59（AdCAGsCD59/AAVCAGsCD59）皆能有效地減少小鼠CNV 斑點(diǎn)上MAC 的沉積并抑制CNV［47］。已有研究招募了玻璃體腔注射AAVCAGsCD59的Ⅰ期臨床試驗(yàn)患者（NCT03585556）。

4 總結(jié)

在濕性AMD 的治療中，反復(fù)注射抗VEGF 藥物一方面造成治療的不便，另一方面可能存在視網(wǎng)膜毒性，最終導(dǎo)致患者的視力無(wú)法得到較好的提升。為了彌補(bǔ)該療法的弊端，其相應(yīng)的基因治療聯(lián)合PDGF和補(bǔ)體相關(guān)的治療方法不斷推陳出新，逐漸從臨床前研究走向臨床試驗(yàn)，為AMD 現(xiàn)有的治療提供了新的思路，也給患者帶來(lái)了新的希望。通過(guò)對(duì)注射劑量、注射方式等進(jìn)行充分評(píng)估，抗VEGF 的替代或補(bǔ)充治療的安全性、耐受性及有效性正逐步提高。

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