牙周炎患者Hp生長(zhǎng)分布對(duì)口腔環(huán)境及牙周膜細(xì)胞成骨能力影響

鄧文革 張蕾 陳亞飛

(盤錦市中心醫(yī)院，(1.口腔修復(fù)科門診；(2.口腔治療科門診，遼寧 盤錦 124010；3.陳亞飛口腔診所口腔科，遼寧 盤錦 124010)

研究[1]發(fā)現(xiàn)，口腔幽門螺栓菌(Hp)感染與牙周炎病程進(jìn)展關(guān)系密切，牙周炎患者牙菌斑中的Hp檢出率普遍高于健康者。牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)是公認(rèn)的有利細(xì)胞，具有增殖分化能力，但受到基質(zhì)微環(huán)境的影響。成骨相關(guān)鈣化基因ALP、Runx-2表達(dá)，直接反映PDLSCs的成骨分化能力[2]。本文主要探討牙周炎患者Hp生長(zhǎng)分布對(duì)口腔環(huán)境及牙周膜細(xì)胞成骨能力影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年12月我院收治的牙周炎患者120例作為觀察組，另選取30名同期于我院行口腔檢查證實(shí)為牙周健康者作為對(duì)照組。觀察組男68例、女52例，年齡15～45歲，平均(36.3±2.2)歲，按牙周炎程度分為輕度70例、中度27例、重度23例。對(duì)照組男18例、女12例，年齡14～46歲，平均(36.5±2.4)歲。納入者均經(jīng)口腔X線檢查確診為慢性牙周炎；已排除處于妊娠期或哺乳期的婦女；3個(gè)月內(nèi)患有感染性疾病或接受過(guò)抗感染治療；患有心肝腎等重要臟器疾病、惡性腫瘤或自身免疫病的患者。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；颊呔橥狻?/p>

1.2方法 患者使用0.9%氯化鈉溶液含漱20 s，使用1 mL的無(wú)菌EP管收集含漱液，置于-80℃冰箱保存待檢。采用二氧化硅微粒法提取含漱液中的DNA，口腔Hp分布采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)?？谇籋p陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：CagA基因表達(dá)陽(yáng)性為在397 bp處出現(xiàn)特異性條帶(CagA基因表達(dá)陽(yáng)性)或294 bp條帶處出現(xiàn)特異性條帶(尿素酶 C基因表達(dá)陽(yáng)性)，上述位置出現(xiàn)一處特異性條帶即為口腔Hp陽(yáng)性。兩組均選取同側(cè)1、4、6牙位，采用世界衛(wèi)生組織推薦的CPI牙周探針檢測(cè)牙周袋深度，記錄菌斑指數(shù)，采用視診結(jié)合探針的方法進(jìn)行檢查，用探針輕劃牙面，根據(jù)菌斑的量和厚度進(jìn)行計(jì)分，菌斑指數(shù)=各牙齒斑計(jì)分之和與被檢查總牙數(shù)之比。將pH試紙裁剪為直徑6 mm左右的小圓片，插入牙周袋，30 s后取出，記錄牙周袋深度及齦溝液pH值。收集觀察組中因牙周炎拔出的新鮮牙的組織及對(duì)照組中因正畸治療需要拔除新鮮牙的組織，PBS反復(fù)沖洗，在超凈工作臺(tái)中刮取根中1/3牙周膜組織，盡可能剪碎，形成小組織塊，采用組織塊酶消化法分離細(xì)胞，進(jìn)行PDLSCs原代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%左右時(shí)，采用低密度法篩選，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第4代細(xì)胞提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，采用PrimeScript TM RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。采用RT-PCR 法檢測(cè)ALP、Runx-2表達(dá)情況，試劑盒購(gòu)自Takara公司，儀器使用ABI 7000 RT-PCR儀，PCR引物委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

2 結(jié) 果

2.1口腔Hp分布情況的比較 觀察組的口腔Hp陽(yáng)性率為84.17%，顯著高于對(duì)照組的43.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.937，P<0.05)。

2.2不同程度牙周炎的口腔Hp分布情況 隨著牙周炎程度加重，口腔Hp陽(yáng)性率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同程度牙周炎的口腔Hp分布情況[n(%)]

2.3兩組口腔環(huán)境比較 Hp陽(yáng)性者的牙周袋深度、齦溝液pH值、菌斑指數(shù)均高于Hp陰性(P<0.05)，觀察組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組口腔環(huán)境比較

2.4兩組ALP、Runx-2 mRNA水平比較 對(duì)照組HP陽(yáng)性者與陰性者的ALP、Runx-2 mRNA水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，觀察組HP陽(yáng)性者的ALP、Runx-2 mRNA水平顯著低于Hp陰性者(P<0.05)，觀察組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組ALP、Runx-2 mRNA水平比較

3 討 論

研究[3]發(fā)現(xiàn)，胃炎患者牙菌斑分離得到的Hp與胃粘膜Hp的生化特性、形態(tài)和免疫特性類似，因此推斷除胃以外，口腔是重要的人體Hp貯存地?？谇粌?nèi)環(huán)境直接影響口腔Hp生長(zhǎng)及分布。本文結(jié)果顯示，觀察組的口腔Hp陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組；隨著牙周炎程度加重，口腔Hp陽(yáng)性率顯著升高，提示牙周組織破壞程度越嚴(yán)重，越有利于口腔Hp的生長(zhǎng)分布。Hp陽(yáng)性者的牙周袋深度、齦溝液pH值、菌斑指數(shù)均高于Hp陰性，觀察組顯著高于對(duì)照組。

ALP是一類由肝臟外排的同工酶，在人體胎盤、骨骼、肝臟、腎等多種組織均有分布，參與骨等礦化組織代謝再生。ALP 活性是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志物，也是其分化程度及功能的指示指標(biāo)。牙周膜細(xì)胞在牙周組織修復(fù)重建過(guò)程中扮演重要角色，研究[4]表明，牙周膜細(xì)胞具有成骨的能力，細(xì)胞ALP 表達(dá)水平直接反映成骨細(xì)胞活性。研究[5]發(fā)現(xiàn)，Runx-2在骨組織形成和重建等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，成骨細(xì)胞增殖分化時(shí)，Runx-2表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明兩者具有密切聯(lián)系。本文中，對(duì)照組Hp陽(yáng)性者與陰性者的ALP、Runx-2 mRNA水平無(wú)顯著差異，觀察組Hp陽(yáng)性者的ALP、Runx-2 mRNA水平顯著低于Hp陰性者，說(shuō)明牙周炎患者牙周膜細(xì)胞成骨分化的礦化程度降低，成骨分化能力明顯降低，影響牙周組織的修復(fù)與重建。但Hp感染并不一定是導(dǎo)致牙周膜細(xì)胞成骨能力下降的直接因素。研究[6]發(fā)現(xiàn)，口腔發(fā)生局部炎癥時(shí)，大量炎性因子分泌到胞外，刺激PDLSCs，削弱其分化能力，下調(diào)成骨能力，直接影響牙周組織再生。因此，推測(cè)可能是Hp感染加重了牙周炎患者的炎癥程度，炎性因子水平升高，進(jìn)一步減弱牙周膜細(xì)胞成骨能力。