外周血中ABCC3 濃度與CYP2C19 基因型對(duì)PCI 術(shù)后 氯吡格雷抗血小板效應(yīng)的影響

王晶晶，郭曉波，謝 娟，阮芙蓉

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬西安市中心醫(yī)院，1.藥劑科，2.血液科，西安 710003）

冠心病臨床常見(jiàn)的心血管疾病之一，也是導(dǎo)致死亡的主要原因之一［1］。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（percutaneous coronary intervention，PCI）已經(jīng)成為治療冠心病的主要方法之一。氯吡格雷（clopidogrel）作為新型的二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）受體拮抗劑，是PCI 術(shù)后患者的抗血小板治療的一線用藥，但氯吡格雷臨床應(yīng)用的個(gè)體差異較大，有4～30%的患者常規(guī)服用時(shí)，不能有效地使其轉(zhuǎn)化成活性產(chǎn)物［2］，氯吡格雷抵抗的出現(xiàn)已影響其療效發(fā)揮，為此導(dǎo)致了血栓形成、死亡等心血管缺血事件。

在體內(nèi)，約15%的氯吡格雷原藥經(jīng)CYP2C19 催化生成活性代謝物，進(jìn)而發(fā)揮藥理活性，CYP2C19 基因多態(tài)性與藥物的代謝及療效密切相關(guān)［3］，能夠影響藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程及藥效的發(fā)揮。目前主要開(kāi)展針對(duì)藥物代謝酶CYP2C19 基因型檢測(cè)來(lái)診斷患者氯吡格雷抵抗的發(fā)生率［4-6］，但進(jìn)行CYP2C19 基因型檢測(cè)費(fèi)用高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，步驟復(fù)雜，部分患者對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目接受度不高，間接影響其預(yù)后。因此，有必要尋找一種新的用于診斷PCI 術(shù)后患者氯吡格雷敏感性的方法。有研究發(fā)現(xiàn)外周血ABCC3 中較低水平的mRNA 與氯吡格雷的增敏效應(yīng)有關(guān)［17］。本課題將探究分析ABCC3與CYP2C19 基因型的相關(guān)性，外周血ABCC3 表達(dá)水平與CYP2C19 基因型分別對(duì)氯吡格雷抗血小板效應(yīng)的關(guān)系，，以為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇在2017 年1 月～2018 年1 月期間于本院進(jìn)行診斷為冠心病并進(jìn)行PCI 手術(shù)的患者103 例，男63 例，女40 例，記錄患者基本信息如年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史、疾病史等。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）PCI 術(shù)后接受氯吡格雷繼進(jìn)行抗血小板治療；（2）年齡＞18 歲。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）具有出血傾向，不能用藥者；（2）妊娠期婦女患者；（3）腫瘤及其他心血管病患者；（4）肝腎功能異?；颊?；（5）不能接受隨訪患者。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或其家屬均知情同意且簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法 入選的冠心病患者行PCI 術(shù)后，采用阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷抗血小板治療，負(fù)荷劑量300 mg，維持劑量75 mg／d，用藥時(shí)間至少半年。

1.3 CYP2C19 基因型檢測(cè) 采集所有患者的外周靜脈血4 mL，通過(guò)DNA 提取試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）提取全血基因組DNA，經(jīng)DNA PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行雜交顯色，采用DNA 微陣列芯片法檢測(cè)相應(yīng)的CYP2C19 等位基因。

1.4 外周血ABCC3 水平檢測(cè) 采用人ABCC3 ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BioLegend 公司）對(duì)外周血漿中的ABCC3 進(jìn)行測(cè)定，利用抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記反應(yīng)原理。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm OD 值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析測(cè)定。

1.5 觀察指標(biāo) 分別于PCI 術(shù)前及PCI 術(shù)后7 d 抽取患者空腹肘靜脈血3 mL，采用比濁法測(cè)定ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集率；觀察血小板聚集率變化及達(dá)標(biāo)率（5mol /L ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集率＜50%）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由IBM SPSS Statistics 22.0 統(tǒng)計(jì)分析?；蛐头植加搔?檢驗(yàn)分析是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，以P＞0.05 視為符合Hardy-Weinberg 平衡。計(jì)量資料mean±SD 表示，采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以百分比（或例數(shù)）表示，采用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。線性回歸采用GraphPad 7 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本資料 本研究共納入接受PCI 手術(shù)治療且接受氯吡格雷抗血小板治療的ACS 患者103例，其中男63 例，女40 例，年齡（62.4±12.6）歲，其中單支血管病變43 例，兩支血管病變35 例，三支血管病變25 例，合并原發(fā)性高血壓（高血壓）42 例，合并2 型糖尿病31 例，吸煙患者43 例。

2.2 CYP2C19 等位基因型分析 對(duì)80 例患者進(jìn)行CYP2C19 等位基因分析，經(jīng)χ2檢驗(yàn)所有基因型均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05）。根據(jù)CYP2C19 對(duì)氯吡格雷代謝的影響分為以下3組：快代謝型（CYP2C19*1/*1 基因型）、中代謝型（CYP2C19*1/*2，CYP2C19*1/*3 基因型）、慢代謝型（CYP2C19*2/*2，CYP2C19*2/*3，CYP2C19*3/*3 基因型），中慢代謝型患者占63%，其構(gòu)成比見(jiàn)圖1，及各基因型占比見(jiàn)圖2。

圖1 CYP2C19代謝效率基因型構(gòu)成比

圖2 CYP2C19基因型構(gòu)成比圖

2.3 不同CYP2C19 基因型患者外周血ABCC3 水平利用ELISA 方法檢測(cè)外周血中的ABCC3 水平，測(cè)定103 例PCI 術(shù)后服用氯吡格雷治療的患者外周血中ABCC3 水平為32.6±6.2 ng/mL。對(duì)比不同代謝水平的CYP2C19 基因型患者的ABCC3 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在快代謝型患者中的ABCC3 水平為26.4±7.1 ng/mL，較中代謝型患者（35.3±5.8 ng/mL）及慢代謝型患者（40.1±6.7）顯著降低，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。中代謝型患者的ABCC3 水平也顯著低于慢代謝型患者（P＜0.05）。

表1 不同CYP2C19基因型患者外周血ABCC3水平

2.4 CYP2C19 基因型對(duì)抗血小板聚效應(yīng)的影響 PCI術(shù)后采用氯吡格雷治療，不同CYP2C19 基因型患者的血小板聚集率及達(dá)標(biāo)率進(jìn)行分析，CYP2C19 快代謝型患者的血小板聚集率較中、慢代謝型患者顯著降低（P＜0.05），且快代謝型患者的達(dá)標(biāo)率高于中、慢代謝型患者（P＜0.05），見(jiàn)表2。盡管中代謝型患者的血小板聚集率較慢代謝型低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 CYP2C19基因型對(duì)抗血小板聚效應(yīng)的影響

2.5 外周血ABCC3 水平對(duì)血小板聚集率的影響 利用線性回歸分析外周血ABCC3 水平與血小板聚集率的相關(guān)性，見(jiàn)圖3，可見(jiàn)在103 例患者中外周血ABCC3的濃度與血小板聚集率呈顯著正相關(guān)（R2=0.5512，P＜0.001），說(shuō)明ABCC3 水平與氯吡格雷的抗血小板療效呈負(fù)相關(guān)。

圖3 外周血ABCC3濃度與血小板聚集率的相關(guān)性圖

3 討論

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）已經(jīng)成為治療冠心病的主要方法之一。由于PCI 治療中對(duì)病變斑塊的擠壓、促凝組織的暴露以及支架等器械置入等可促進(jìn)血小板激活、血栓形成，引發(fā)支架內(nèi)血栓，導(dǎo)致心肌梗死和死亡等惡性臨床事件，故患者在PCI 治療后需進(jìn)行抗血小板治療。氯吡格雷是當(dāng)前經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后預(yù)防血栓事件的常規(guī)策略［7，8］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有4～30% 的患者存在不同程度的氯吡格雷抵抗［2，9］，其不良臨床事件的發(fā)生率較氯吡格雷敏感者升高。

大多數(shù)相關(guān)文獻(xiàn)指出，存在CYP2C19* 2 基因變異的患者，其對(duì)于氯吡格雷的代謝較低［4，10］，攜帶CYP2C19* 2 功能缺失基因的人群在使用氯吡格雷的效果顯著低于不攜帶該基因型的人群。國(guó)內(nèi)既往研究也發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征患者PCI 術(shù)后CYP2C19*2、CYP2C19*3 基因變異氯吡格雷抵抗發(fā)生率更高，支架內(nèi)血栓及心血管不良事件發(fā)生率明顯升高［3，5，6］。也有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后相關(guān)的血小板反應(yīng)與CYP2C19 酶活性的變化相關(guān)［11］。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在CYP2C19 快代謝型患者中，氯吡格雷的抗血小板療效顯著高于中、慢代謝型患者。

ABCC3 是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的重要成員，它扮演內(nèi)源性葡萄糖醛酸及其偶聯(lián)物在外排中的重要作用跨細(xì)胞膜的藥物代謝物［12］。ABCC3 被證明與腫瘤的多藥耐藥現(xiàn)象有關(guān)［13-15］，其參與多種腫瘤的增殖、侵襲，可能通過(guò)外排抗腫瘤藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)人血小板中可檢測(cè)到ABCC3 mRNA 和蛋白的表達(dá)，推測(cè)ABCC3 和其他ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體可能影響藥物在血小板上的轉(zhuǎn)運(yùn)［16］。本研究中，發(fā)現(xiàn)在CYP2C19 快代謝型患者中ABCC3 的表達(dá)量較低，而其抗血小板療效較好，說(shuō)明CYP2C19 與ABCC3 的表達(dá)具有相關(guān)性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)量ABCC3 的患者中，氯吡格雷的抗血小板療效較好。在103 例患者中，對(duì)ABCC3 的表達(dá)量與血小板聚集率進(jìn)行相關(guān)性分析，也發(fā)現(xiàn)其強(qiáng)正相關(guān)性聯(lián)系。說(shuō)明ABCC3 可能通過(guò)調(diào)控氯吡格雷的代謝或影響其作用靶點(diǎn)，進(jìn)而影響其療效。Luchessi 等發(fā)現(xiàn)，外周血細(xì)胞中低ABCC3 mRNA 表達(dá)與氯吡格雷增敏有關(guān)，但需要進(jìn)一步的研究其具體機(jī)制［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)ABCC3 的低水平表達(dá)與氯吡格雷的增敏效果有關(guān)，且與CYP2C19 基因型具有相關(guān)性，提示ABCC3 可作為PCI 術(shù)后氯吡格雷抗血小板效應(yīng)的重要指標(biāo)。