丹參酮ⅡA對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及對(duì)JAK2/STAT3通路的影響

王 煜

缺血-再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)是指缺血組織器官恢復(fù)血流后，不僅組織器官功能未恢復(fù)，反之，缺血進(jìn)一步加重功能、代謝障礙和結(jié)構(gòu)破壞，甚至出現(xiàn)不可逆。目前研究較多的是心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)，特別是老年人MIRI。IRI發(fā)生過程復(fù)雜，涉及多種病理生理過程，最終對(duì)心臟造成損害[1]。Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡、自噬和炎癥反應(yīng)等過程，已有研究證明，其與MIRI密切相關(guān)[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過激活JAK2/STAT3可發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用，減少凋亡[4-5]。丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，TA)是從中藥丹參中分離提取得到的一種脂溶性二萜醌類成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗心肌缺血等作用，且毒副作用較低。有研究表明，TA通過絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/雷帕霉素靶蛋白(MEK/ERK/mTOR)通路改善肝臟IRI[6]；通過Toll樣受體4/核因子κB(TLR4/NF-κB)通路改善缺血缺氧性腦病[7]；通過p38促絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路改善腎臟IRI[8]。Pan等[9]發(fā)現(xiàn)，TA通過改善炎癥損傷和凋亡，增加自噬，從而改善大鼠MIRI并提高心功能。Li等[10]研究證實(shí)，TA通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)通路從而改善MIRI。為進(jìn)一步明確TA對(duì)MIRI的影響及機(jī)制，本研究觀察TA對(duì)老年MIRI大鼠及缺氧/復(fù)氧損傷(hypoxia/reoxygenation injury，HRI)心肌細(xì)胞的影響，并探討JAK2/STAT3抑制劑AG490對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞與試劑 取24只健康老年雄性Wistar大鼠，18個(gè)月齡，體重(355.62±20.35)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2006—2009。取出生48 h內(nèi)的Wistar大鼠8只，分離原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)試劑：TA(南京清澤醫(yī)療科技有限公司)，Evan′s藍(lán)染液(美國Sigma公司)，氯化三苯基氮四唑 (TTC)溶液(美國Sigma公司)，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(上海聯(lián)合賽爾生物工程有限公司)，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(生工生物工程有限公司)，DCFH-DA活性氧ROS熒光探針(上海懋康生物科技有限公司)，抗體(美國Sigma公司)，乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性分析試劑盒(艾美捷科技有限公司)。

1.2 老年大鼠MIRI模型的建立及分組 術(shù)前禁食12 h，使用苯巴比妥麻醉大鼠，于胸骨左側(cè)第3肋與第4肋間作一縱向切口，剪斷第3根肋骨，暴露心臟，結(jié)扎左心耳下緣與肺動(dòng)脈圓錐之間左冠狀動(dòng)脈前降支中下1/3，結(jié)扎45 min后再灌注24 h[11]。將24只大鼠隨機(jī)分為3組。假手術(shù)組(Sham組)不進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎；MIRI組，術(shù)前經(jīng)頸外靜脈注射生理鹽水，之后建立MIRI模型；MIRI+TA組，術(shù)前經(jīng)頸外靜脈注射20 mg/kg TA[10]，之后建立MIRI模型。模型建立后，采用超聲心動(dòng)圖測定所有大鼠心功能，包括射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)。

1.3 心功能指標(biāo)檢測 采用全自動(dòng)生化檢測儀檢測大鼠血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、LDH。

1.4 心肌梗死面積 應(yīng)用Evan′s藍(lán)染液和TTC染色法測定心肌梗死范圍，將0.2～0.3 mL的2%Evan′s藍(lán)染液注入右頸靜脈，明確缺血損傷危險(xiǎn)區(qū)域(area at risk，AAR)。再灌注結(jié)束時(shí)迅速取出大鼠心臟，使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，-20 ℃條件下冷凍30 min。將左心室(LV)切成5塊，置于1% TTC中孵育15 min，之后使用10%甲醛固定。顯微鏡下觀察梗死區(qū)(the infarct area，INF，白色)和AAR(紅色)。

1.5 細(xì)胞HRI模型的建立及分組 將細(xì)胞暴露于缺氧條件下(1%O2、5%CO2、94%N2)3 h，之后復(fù)氧(95%O2、5%CO2)3 h。將細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、HRI組(缺氧3 h后復(fù)氧3 h)、HRI+TA組(HRI前應(yīng)用10 μmol/L TA預(yù)處理)[12]、HRI+TA+AG490組(HRI前應(yīng)用10 μmol/L TA和20 μmol/L AG490預(yù)處理)。

1.6 細(xì)胞活力檢測 將細(xì)胞按1×103/孔接種于96孔板上，每孔100 μL，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。避光條件下每孔加入MTT溶液10 μL，37 ℃條件下培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀(波長設(shè)置為450 nm)上測定吸光度(OD)值，評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。LDH檢測采用LDH細(xì)胞毒性分析試劑盒。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測 應(yīng)用TUNEL試劑盒檢測凋亡。樣品中加入5 μL TUNEL反應(yīng)混合物，載玻片于37 ℃避光條件下孵育60 min，之后應(yīng)用PBS沖洗3次，5 min。為檢測細(xì)胞核，將細(xì)胞在室溫避光條件下使用4′，6-二脒基-2-2-苯基吲哚(DAPI)孵育5 min，PBS洗滌3次，之后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察。以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與DAPI陽性細(xì)胞數(shù)比值反映凋亡情況。

1.8 抗氧化指標(biāo)檢測 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量，將細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后加入10 μmol/L的DCFH-DA 1 mL熒光探針溶液，之后洗滌3次，應(yīng)用PBS重懸并計(jì)數(shù)，取含有2×105個(gè)細(xì)胞懸浮液，使用流式細(xì)胞儀檢測。應(yīng)用全自動(dòng)生化檢測儀檢測細(xì)胞上清液丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)。

1.9 免疫印跡法(Western Blotting)檢測蛋白 Western Blotting檢測p-JAK2、p-STAT3、JAK2、STAT3及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3。樣品中加入SDS緩沖液煮沸5 min使蛋白變性。經(jīng)凝膠電泳(SDS-PAGE)后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，使用5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗，4 ℃過夜，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗2 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。ECL顯色，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白條帶與GAPDH灰度比值。

2 結(jié) 果

2.1 TA改善心肌細(xì)胞HRI 與對(duì)照組比較，HRI組心肌細(xì)胞增殖活性明顯降低，而LDH釋放增加(P<0.05)，經(jīng)TA預(yù)處理可預(yù)防這些病理損傷。詳見圖1A和圖1B。TUNEL檢測結(jié)果顯示，經(jīng)TA預(yù)處理可改善HRI心肌細(xì)胞凋亡(P<0.05)。詳見圖1C和圖2。

與對(duì)照組比較，＊P<0.05；與HRI組比較，#P<0.05。圖1 TA改善心肌細(xì)胞HRI(A為MTT法檢測TA對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響；B為TA對(duì)心肌細(xì)胞釋放LDH的影響；C為TUNEL檢測TA對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響)

圖2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡(×400)(Merge為TUNEL與DAPI疊加圖像)

2.2 TA改善老年大鼠MIRI 與MIRI組比較，MIRI+TA組大鼠心臟梗死面積較小(P<0.05)，詳見圖3。TA改善MIRI大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡(P<0.05)，詳見圖4。與Sham組比較，MIRI組大鼠射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)明顯較低，而血清CK、LDH升高(P<0.05)，經(jīng)TA預(yù)處理可預(yù)防上述病理改變(P<0.05)，詳見圖5。

與MIRI組比較，＊P<0.05。圖3 TA改善大鼠心肌梗死面積

圖4 TUNEL檢測TA對(duì)心肌組織細(xì)胞凋亡的影響(×400)(Merge為TUNEL與DAPI疊加圖像)

與Sham組比較，＊P<0.05；與MIRI組比較，#P<0.05。 圖5 各組射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)、血清CK和LDH比較

(A為射血分?jǐn)?shù)；B為縮短分?jǐn)?shù)；C為CK；D為LDH)

2.3 TA改善心肌細(xì)胞的抗氧化能力 與對(duì)照組比較，HRI組ROS熒光強(qiáng)度和MDA增高，而SOD降低，TA預(yù)處理可預(yù)防上述指標(biāo)改變(P<0.05)，說明TA可提高HRI心肌細(xì)胞抗氧化能力。詳見圖6。

與對(duì)照組比較，＊P<0.05；與HRI組比較，#P<0.05。 圖6 TA增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗氧化能力(A為DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS； B為ROS熒光染色強(qiáng)度；C為細(xì)胞培養(yǎng)上清液MDA；D為細(xì)胞培養(yǎng)上清液SOD)

2.4 TA通過調(diào)控JAK2/STAT3通路減輕心肌細(xì)胞HRI JAK2/STAT3通路抑制劑AG490可抵消TA對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。與HRI組比較，HRI+TA組p-JAK2和p-STAT3表達(dá)水平升高，而AG490可抵消TA的作用(P<0.05)。HRI+TA組凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值高于HRI組， cleaved Caspase-3低于HRI組，AG490可逆轉(zhuǎn)上述變化(P<0.05)。詳見圖7、圖8。上述結(jié)果說明，TA可能通過JAK2/STAT3通路降低HRI心肌細(xì)胞的凋亡。

與對(duì)照組比較，＊P<0.05；與HRI組比較，#P<0.05；與HRI+TA組比較，△ P<0.05。圖7 TA和JAK2/STAT3通路抑制劑AG490對(duì)心肌細(xì)胞活力和LDH的影響(A為心肌細(xì)胞活力；B為LDH)

與對(duì)照組比較，＊P<0.05；與HRI組比較，#P<0.05；與HRI+TA組比較，△ P<0.05。圖8 TA和JAK2/STAT3通路抑制劑AG490對(duì)心肌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(A為Western Blotting檢測p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖；B為p-JAK2/JAK2比值；C為p-STAT3/STAT3比值；D為Bcl-2/Bax比值；E為cleaved Caspase-3)

3 討 論

TA是從中藥丹參中分離提取到的一種脂溶性二萜醌類成分，傳統(tǒng)認(rèn)為TA具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀消腫和安神寧心等作用，藥理研究表明，TA具有心血管保護(hù)的作用，其機(jī)制可能與抗缺血、抗心律失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)脂和抑制凝血等有關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，TA通過JAK2/STAT3通路減少心肌細(xì)胞凋亡從而改善IRI，并對(duì)心功能有一定保護(hù)作用。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，線粒體ROS產(chǎn)生異常與心血管疾病有關(guān)[14]。線粒體過度產(chǎn)生ROS可能造成氧化應(yīng)激，與心臟缺血性疾病病理生理過程相關(guān)。缺血引起的細(xì)胞變化包括H+、Ca2+積聚和線粒體膜電位破壞，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生[15]。ROS積聚可直接激活應(yīng)激反應(yīng)，造成細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，TA可預(yù)防HRI造成的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。氧自由基在心肌缺血再灌注損傷中的作用已證實(shí)。氧自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化后產(chǎn)生的MDA具有較強(qiáng)的交聯(lián)能力，導(dǎo)致多種酶失活。MDA反映細(xì)胞損傷程度；SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，是天然的自由基清除因子，對(duì)維持機(jī)體氧化/抗氧化平衡具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，TA可提高細(xì)胞SOD水平，并降低MDA水平，提示TA對(duì)HRI有明顯保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。經(jīng)典凋亡途徑包括外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體途徑，特點(diǎn)是Caspases激活，特別是Caspase-3。阻斷細(xì)胞凋亡過程可防止細(xì)胞大量丟失，減少IRI引起的心臟損傷，進(jìn)而緩解甚至預(yù)防心力衰竭發(fā)生[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TA可抑制IRI后心肌細(xì)胞凋亡。Cui等[18]體外研究發(fā)現(xiàn)，TA可調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、Caspase-3和Bcl-2表達(dá)，抑制心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善HRI。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，TA可改善MIRI大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡，并縮小心肌梗死面積，對(duì)大鼠心功能有一定保護(hù)作用。

JAK/STAT可改變IRI發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，早期IRI、鈣超載引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，導(dǎo)致線粒體腫脹和破裂，進(jìn)而釋放細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子等，啟動(dòng)凋亡和死亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20]。JAK/STAT通路激活抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。JAK2/STAT3是JAK/STAT通路中重要的成員之一，在MIRI保護(hù)機(jī)制中起核心作用[21-22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TA可提高HRI心肌細(xì)胞Bcl-2/Bax，降低cleaved Caspase-3，說明TA具有抗凋亡作用。應(yīng)用JAK2/STAT3通路抑制劑AG490可抵消TA的抗凋亡作用，證實(shí)TA通過JAK2/STAT3通路減少心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究觀察TA對(duì)IRI的保護(hù)作用，為TA在體內(nèi)外調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡提供了基礎(chǔ)研究證據(jù)，TA可能通過激活JAK2/STAT3通路減少心肌細(xì)胞凋亡而改善IRI。