尼可地爾對(duì)抑郁模型大鼠心肌KATP通道的影響

徐啟明，劉軍華，蘇紅英，曾海龍，劉凱東

抑郁癥是情感障礙類精神疾病之一，以心境低落、食欲減退為主要臨床表現(xiàn)。隨著時(shí)代發(fā)展，普通人群患抑郁癥比例逐年增加，因此，抑郁癥對(duì)人類健康及生命安全造成極大威脅，而應(yīng)激是除遺傳因素之外誘發(fā)抑郁發(fā)生的重要機(jī)制之一。流行病學(xué)資料顯示，長(zhǎng)期高強(qiáng)度心理、生理應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生、發(fā)展及惡化，同時(shí)抑郁癥與心血管疾病發(fā)生密切相關(guān)，抑郁癥加重心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展[1]。本研究觀察抑郁模型大鼠心肌損傷情況及KATP通道抑制劑尼可地爾對(duì)抑郁模型大鼠心肌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 兔抗大鼠Kir6.2抗體(sc-20809)，兔抗大鼠SUR2抗體(sc-25684)，兔抗大鼠β-actin抗體(sc-130657)均購(gòu)自Santa Cruz Corporation(USA)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自博士德生物(BA1054)，Tris-HCL緩沖液(pH8.8)及Tris-HCL緩沖液(pH6.8)、SDS-PAGE電泳緩沖液及轉(zhuǎn)膜緩沖液均購(gòu)自北京碧云天，Nagar-Olsen染色試劑盒購(gòu)自Sigma，5-羥色胺酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京碧云天，BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，i Bright高清顯色系統(tǒng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取7周齡的清潔級(jí)雄性大鼠，體重180～190 g，在23.5～24.0 ℃干燥、通風(fēng)條件飼養(yǎng)大鼠1周后，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(CMS)組和尼可地爾組(0.1 mg/kg)，各12只，每組大鼠分別飼養(yǎng)2周、4周、6周及8周。每周記錄1次大鼠體重及曠野實(shí)驗(yàn)評(píng)分、糖水喜好實(shí)驗(yàn)。

1.3 CMS誘導(dǎo)大鼠抑郁模型 根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]將鼠籠傾斜45°放置，同時(shí)將尾部懸吊5 min，剝奪大鼠飲食及飲水，更換大鼠光照方式使其晝夜顛倒。應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期每隔1周檢測(cè)大鼠體重變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用5-羥色胺試劑盒檢測(cè)腦組織5-羥色胺含量。

1.4 尼可地爾處理大鼠 將鼠籠傾斜45°放置同時(shí)將尾部懸吊5 min，剝奪大鼠飲食及飲水，更換大鼠光照方式使其晝夜顛倒。應(yīng)激開(kāi)始第2周使用尼可地爾0.1 mg/kg灌胃大鼠持續(xù)至應(yīng)激結(jié)束，實(shí)驗(yàn)期間每隔1周檢測(cè)大鼠體重變化，持續(xù)至8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用5-羥色胺試劑盒檢測(cè)腦組織5-羥色胺含量。

1.5 ELISA測(cè)定CMS組大鼠下丘腦及海馬體5-羥色胺含量 將大鼠斷頭處死后置于冰盒上取出完整海馬體及下丘腦組織，置于-80 ℃保存，使用電子勻漿器充分?jǐn)嚢韬笥? ℃離心機(jī)以7 000 r/min離心15 min。取上清液采用ELISA分析。

1.6 大鼠心肌損傷心率與心率變異性測(cè)定 采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，將大鼠四肢以線繩固定于木板上并取仰臥位，采用動(dòng)物多導(dǎo)生理記錄儀及系統(tǒng)軟件記錄大鼠心率及心率變異性。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠損傷心肌KATP通道蛋白Kir6.2和SUR2表達(dá)水平

1.7.1 大鼠心肌蛋白樣品制備 取大鼠心肌組織，使用磷酸鹽緩沖液沖洗3次后應(yīng)用電子勻漿攪拌器充分勻漿，再加入RIPA強(qiáng)裂解液超聲破碎7次至混合液不再黏稠為止，4 ℃條件下，以7 000 r/min離心10 min，取上層清液加入SDS-上樣緩沖液，之后沸水浴煮5 min，瞬時(shí)離心后-80 ℃保存。

1.7.2 BCA蛋白質(zhì)定量分析 按照說(shuō)明書(shū)方法制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，在96孔板中分別加入200 μL的BCA蛋白定量A液、B液混合液(50∶1)，每孔加入18 μL蒸餾水及2 μL蛋白樣品， 37 ℃條件下恒溫孵育30 min后，使用酶標(biāo)儀在A562 nm處檢測(cè)蛋白濃度。

1.7.3 SDS-PAGE凝膠電泳 上樣：每孔道上樣蛋白質(zhì)量50 μg；電泳、轉(zhuǎn)模、封閉、抗體雜交：配制12%的分離膠、5%的濃縮膠及SDS-PAGE電泳緩沖液(pH7.5)，4 ℃條件下110 V恒壓電泳，采用三層夾膜濕轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。4 ℃條件下以300 mA轉(zhuǎn)膜1 h，將膜取出后使用含有5%脫脂奶粉的TBS-T溶液作為封閉液，室溫?fù)u浴封閉2 h后在4 ℃條件下層析柜搖浴孵育一抗過(guò)夜后將條帶取出，使用TBS-T(2%Tween-20)室溫洗膜3次，每次5 min；室溫孵育二抗1 h，使用TBS-T(2%Tween-20)室溫洗膜3次，每次5 min。ECL顯色：將ECL A液與B液混合后濾膜滴加混合液，反應(yīng)后于不同時(shí)間曝光后顯色。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦組織5-羥色胺表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，CMS組8周時(shí)大鼠下丘腦及海馬體組織5-羥色胺水平下降(P<0.05)；與CMS組比較，尼可地爾組大鼠下丘腦及海馬體組織5-羥色胺水平升高(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較，＊ P<0.05；與CMS組比較，#P<0.05。圖1 各組大鼠下丘腦及海馬體5-羥色胺含量比較

2.2 各組大鼠心率與心率變異性變化 飼養(yǎng)2周、4周、6周和8周，與對(duì)照組比較，CMS 組大鼠各時(shí)間心率降低(P<0.05)，心率變異性升高(P<0.01)；與CMS組各時(shí)間比較，尼可地爾組大鼠心率降低(P<0.05)，心率變異性升高(P<0.01)。詳見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組、CMS組及尼可地爾組大鼠心率與心率變異性變化(±s)

2.3 各組大鼠心肌Kir6.2和SUR2表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，CMS組2周、4周、6周、8周大鼠心肌細(xì)胞KATP通道(Kir6.2和SUR2亞基)蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)；與CMS組2周、4周、6周、8周比較，尼可地爾組大鼠心肌細(xì)胞KATP通道(Kir6.2和SUR2亞基)蛋白表達(dá)水平下降(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組比較，＊P<0.01；與CMS組比較，#P<0.01。圖2 各組大鼠不同時(shí)間心肌KATP通道受體蛋白Kir6.2和SUR2比較 (A為心肌細(xì)胞KATP通道蛋白表達(dá)電泳圖；B為Kir6.2；C為SUR2)

3 討 論

抑郁癥是嚴(yán)重危害人類身心健康的一類精神疾病。相關(guān)研究證實(shí)，抑郁癥導(dǎo)致心臟疾病可能是由于機(jī)體炎癥反應(yīng)促使巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)粥樣斑塊形成及動(dòng)脈粥樣硬化惡化，同時(shí)促進(jìn)血小板聚集，最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能及自主神經(jīng)功能障礙[2-4]。抑郁癥發(fā)生時(shí)，人體大腦產(chǎn)生的5-羥色胺及γ-氨基丁酸分泌下降，導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸功能降低，各類器官功能紊亂?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為心肌KATP通道作為一種細(xì)胞內(nèi)代謝信號(hào)感受器主要由SUR2A和Kir6.2亞基組成，心肌KATP通道開(kāi)放可有效減少動(dòng)作電位時(shí)程從而降低心室率和鈣離子內(nèi)流，同時(shí)抑制線粒體內(nèi)氧化自由基及活性氧產(chǎn)生，通過(guò)降低細(xì)胞凋亡與壞死水平從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外界刺激適應(yīng)性及耐受[5-8]。KATP通道開(kāi)放引起心肌線粒體信號(hào)感受器過(guò)度開(kāi)發(fā)，誘發(fā)線粒體外膜滲透壓增高及線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷，最終導(dǎo)致線粒體能量產(chǎn)生和代謝障礙。SUR2A亞基主要表達(dá)于心肌表面，負(fù)責(zé)mRNA運(yùn)轉(zhuǎn)，修復(fù)受損DNA，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激、廣泛損傷、缺血缺氧時(shí)SUR2A亞基上調(diào)可提高心肌細(xì)胞攜氧能力以保護(hù)心臟免于損傷[9-10]。Kir6.2亞基是細(xì)胞膜KATP通道的一部分，Kir6.2結(jié)合ATP誘導(dǎo)KATP通道關(guān)閉，結(jié)合PIP2促進(jìn)KATP開(kāi)放，Kir6.2亞基與心腦血管疾病、糖尿病、癲癇等具有一定程度的相關(guān)性[11-12]

尼可地爾是一種KATP通道鉀離子開(kāi)放劑，臨床廣泛用于治療急性冠脈綜合征，本研究證實(shí)尼可地爾對(duì)抑郁大鼠產(chǎn)生的心肌損傷具有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)在CMS致抑郁大鼠下丘腦及海馬體5-羥色胺明顯減少，與人類發(fā)生抑郁癥時(shí)機(jī)體5-羥色胺減少類似，因此證實(shí)緩慢應(yīng)激對(duì)大鼠抑郁模型建立成功，給予緩慢應(yīng)激及尼可地爾(0.1 mg/kg)的大鼠下丘腦及海馬體5-羥色胺升高，具體機(jī)制將通過(guò)進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，CMS致抑郁時(shí)心率和心率變異性升高，證實(shí)緩慢應(yīng)激引起心臟損傷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CMS組心肌KATP通道的Kir6.2亞基和SUR2亞基蛋白表達(dá)水平升高，因此推測(cè)，由于抑郁形成時(shí)心肌KATP通道發(fā)生改變，同時(shí)給予緩慢應(yīng)激及尼可地爾(0.1 mg/kg)大鼠心率降低、心率變異率性改善，心肌KATP通道Kir6.2亞基和SUR2亞基蛋白表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而推測(cè)尼可地爾可能通過(guò)調(diào)控大鼠心肌細(xì)胞表面通道SUR2和Kir6.2亞基，誘導(dǎo)KATP通道開(kāi)放進(jìn)而降低心臟正?；顒?dòng)所需的能量，最終調(diào)控心肌細(xì)胞對(duì)損傷的耐受。尼可地爾通過(guò)抑制KATP通道開(kāi)放，下調(diào)Kir6.2和SUR2蛋白的表達(dá)，從而減緩抑郁大鼠發(fā)生的心肌損傷。