冬春季層疊式蛋雞舍乳頭式飲水系統(tǒng)細菌含量檢測及其對生產(chǎn)性能的影響

萬 意 季志遠 馬瑞鈺 杜 強 楊榮斌 詹 凱*

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室，合肥 230001； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，合肥 230001； 3.安徽圣迪樂村生態(tài)食品有限公司，安徽 銅陵 244100)

在現(xiàn)代化商品蛋雞飼養(yǎng)過程中，飲水衛(wèi)生安全逐漸得到生產(chǎn)者的重視。雞群采食和飲水的同時各種有益和有害物質(zhì)會被帶入體內(nèi)，從而對其健康產(chǎn)生危害[1-2]。隨著密閉式乳頭飲水器的普遍使用，部分養(yǎng)殖場通常在水線下方安裝V型接水槽，以防止乳頭故障漏水和雞群飲水外撒滴落至糞帶[3]。然而大多數(shù)生產(chǎn)者在關(guān)注水線水細菌微生物污染的同時，卻忽略了V接水型槽的衛(wèi)生情況及其對雞群健康的威脅[4]。

不良的采食和飲水環(huán)境會導致畜禽免疫系統(tǒng)任務(wù)加重，增重速度減慢，無法提高經(jīng)濟效益，甚至引發(fā)家禽疾病，造成重大的經(jīng)濟損失[5]。水線下方敞開式的V型槽，由于長期暴露于養(yǎng)殖環(huán)境微生物氣溶膠中，加上飲水器滴漏的水和雞采食殘渣以及空氣粉塵，在適宜的環(huán)境條件下有害細菌會不斷繁殖[6]，如大腸桿菌、沙門氏菌和葡萄球菌等，若不能及時和有效的控制，日積月累便會造成嚴重的槽內(nèi)污染。通過對籠內(nèi)雞群采食習性的觀察發(fā)現(xiàn)，雞在采食后喜歡啄飲V型槽內(nèi)水，這可能會對機體健康有著嚴重影響。因此，飲水系統(tǒng)中V型槽的配備對蛋雞生產(chǎn)性能和企業(yè)效益產(chǎn)生的影響有待進一步研究。

為此，本課題組前期在夏季對雞舍內(nèi)水線水和V型槽水細菌數(shù)進行檢測，發(fā)現(xiàn)V型槽內(nèi)污染程度較高且對雞群的產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)有較大負面影響[7]。為了更系統(tǒng)地探究規(guī)?；半u場內(nèi)飲水系統(tǒng)的日常環(huán)境衛(wèi)生，本研究擬以8層層疊式密閉籠養(yǎng)蛋雞舍為研究對象，在冬季和春季測定了雞舍內(nèi)不同籠層飲水裝置中細菌微生物含量，比較水線水和V型槽水的污染情況及其對蛋雞生產(chǎn)性能的影響，旨在為雞舍內(nèi)部環(huán)境控制和乳頭式飲水系統(tǒng)的完善提供指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗雞舍

選擇安徽圣迪樂村生態(tài)食品有限公司的8層層疊式籠養(yǎng)密閉蛋雞舍為對象，單棟存欄羅曼粉殼商品蛋雞5 萬只。雞舍中間用鋼網(wǎng)管理走道隔為上、下樓各4層，長73.0 m，寬16.0 m，吊頂高6.3 m，4列 5走道，單列單層籠位數(shù)量為135個，每籠飼養(yǎng)6只雞，履帶式清糞，自動喂料、飲水、環(huán)控和集蛋。

1.2 試驗動物與分組

在雞群382日齡時，選擇舍內(nèi)東邊相鄰2列雞籠的前端(靠近濕簾端，第13號籠)、中端(第73號籠)、后端(靠近風機端，第133號)，每端的第1、3、5和7層，共計24個監(jiān)測點(監(jiān)測點示意圖見萬意等[7])。試驗期內(nèi)若有雞只死亡，則選用體重相近的雞只代替。

1.3 水樣采集和環(huán)境參數(shù)測定

冬季分別在2019-12-24，2020-01-07和01-21，春季分別在2020-03-31和04-14，于每天上午9:00進行水樣采集和環(huán)境參數(shù)測定。

采集各監(jiān)測點對應雞籠內(nèi)水線水和V型槽水以測定細菌基因總拷貝數(shù)，水線水用無菌離心管直接接取50 mL；V型槽中積水用2 mL膠頭滴管吸取，V型槽內(nèi)無水時使用滅菌棉拭子刮取，一同加入離心管后加DEPC水稀釋至50 mL。所有采樣材料均提前1天高壓滅菌。

同時記錄各監(jiān)測點環(huán)境溫度和濕度，并采用自然沉降法測定空氣細菌數(shù)：在籠外放置營養(yǎng)瓊脂糖培養(yǎng)基，于空氣中暴露5 min后蓋上皿蓋并編號，然后將平皿于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，按奧氏公式[8]計算菌落總數(shù)：

C=50 000N/AT

式中：C為每立方米菌落總數(shù)，cfu/m3；N為每皿菌落數(shù)，個；A為培養(yǎng)皿面積，cm2；T為采樣時間，min。

1.4 水樣細菌基因總拷貝數(shù)測定

1.4.1引物設(shè)計

熒光定量PCR檢測引物使用細菌16S rDNA通用引物，擴增區(qū)域為V3～V4區(qū)，序列如下：V3-F：CCT ACG GGN GGC WGC AG，V4-R：GGA CTA CHV GGG TAT CTA AT，擴增產(chǎn)物長度466 bp。

1.4.2樣本總DNA提取

采集后的水樣先進行預處理：使用真空泵抽吸，濾過孔徑0.22 μm的濾膜，待檢細菌截留在濾膜上，以2 mL滅菌水充分涮洗濾膜；洗脫液12 000 rpm離心 10 min，收集沉淀；然后使用通用型基因組DNA提取試劑盒(Magnetic universal genomic DNA kit，DP705，天根生化科技有限公司)進行DNA提取，獲得的基因組DNA以超微量核酸蛋白測定儀檢測濃度及純度(Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific USA)。

1.4.3標準品質(zhì)粒制備

絕對定量檢測標準品質(zhì)粒構(gòu)建：以大腸桿菌標準株(E.coliATCC 25922)16S rRNA序列為參考序列，將其16S rRNA第332～797位共466 bp的序列構(gòu)建至T載體pMD -18T中，重組質(zhì)粒標記為pMD -18T-16S rDNA，長度3 158 bp。提取重組質(zhì)粒并調(diào)整濃度至100 ng/μL，算得其質(zhì)?？截悢?shù)為2.89×1010copies/μL。用ddH2O將標準品質(zhì)粒進行10倍比稀釋，使其濃度為2.89×109～2.89×103copies/μL，獲得7個濃度梯度的標準品模板，用于熒光定量PCR檢測建立標準曲線。

1.4.4qRT-PCR反應體系及步驟

采用SYBR Green I法實時熒光定量PCR進行細菌16S rDNA總拷貝數(shù)絕對定量檢測；熒光定量PCR試劑盒為TB Green?Premix Ex TaqTMII (RR820，Takara Japan)。熒光定量PCR反應體系如下：2×TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，V3-F 0.5 μL，V4-R 0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O 8 μL，總體積為20 μL。擴增條件：預變性95 ℃ 30 s；擴增循環(huán)95 ℃變性5 s，61 ℃退火延伸60 s，進行40個循環(huán)。熔解曲線條件如下：98 ℃ 1 s，68 ℃ 60 s，98 ℃ 1 s；其中從68～98 ℃機器持續(xù)性采集熒光信號(5 readings/℃)，熔解曲線生成溫度區(qū)間。

1.5 生長性能和蛋品質(zhì)測定

各監(jiān)測點以3個相鄰籠位雞群為1組，每天上午8:00記錄各組產(chǎn)蛋率、雞蛋質(zhì)量和畸形蛋率。每2周1次測定各組蛋品質(zhì)性狀：雞蛋質(zhì)量、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋殼顏色、蛋黃顏色、蛋白高度和哈氏單位。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，使用Turkey法進行多重比較，不同籠層的試驗結(jié)果為前、中和后三端測定的平均值，結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示；各指標間相關(guān)系數(shù)使用Pearson法進行相關(guān)性分析；P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。每1 mL樣本水中細菌基因總拷貝數(shù)以10為底取對數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同籠層的溫度、濕度和空氣細菌數(shù)

不同時間測定第1、3、5和7層的溫度、濕度和空氣細菌數(shù)見表1。各籠層溫、濕度和空氣細菌數(shù)存在差異。由平均值來看，冬季和春季時舍內(nèi)溫度從第1層至第7層均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，相對濕度呈降低趨勢；冬季和春季時第3和7籠層空氣細菌數(shù)均高于第1和5籠層，但差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同籠層水線水和V型槽水細菌基因總拷貝數(shù)

不同時間測定第1、3、5和7層水線水和V型槽水中細菌含量見表2。由平均值來看，水線水和V型槽水中細菌基因總拷貝數(shù)從2019年冬季至2020年春季隨著時間推移逐漸增多，分別增漲194.98 倍(4.76～7.05個單位)和4.08倍(9.26～9.87個單位)；不同階段水線水中細菌基因總拷貝數(shù)在各籠層間差異不大，在冬季時第5層平均值最大，第3層最小，在春季時第7層平均值最大，第1層最??；不同階段V型槽水中細菌基因總拷貝數(shù)在各籠層間差異較大，在冬季和春季第3和7層的平均值均高于第1和5層。比較水線水和V型槽水中細菌含量，發(fā)現(xiàn)在各階段V型槽水中細菌數(shù)均遠高于水線水中(P<0.01)，高達575.44～32 130.51倍，在冬季時差異更明顯。

表1 冬春季雞舍內(nèi)不同籠層溫濕度和空氣細菌數(shù)Table 1 Temperature， humidity and air bacterial count in different tiers of layer house during winter and spring

2.3 不同籠層蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)性狀

舍內(nèi)不同籠層產(chǎn)蛋率、畸形蛋率及蛋品質(zhì)性狀分別見表3、表4和表5。從生產(chǎn)性能看，冬季和春季時第1和5層產(chǎn)蛋率均高于第3和7層；冬季和春季時不同籠層畸形蛋率無顯著差異；隨著蛋雞日齡增加，次年春季產(chǎn)蛋率低于冬季，畸形蛋率高于冬季。從蛋品質(zhì)性狀看，冬季時第5層蛋白高度顯著高于其余各層(P<0.01)，且第1和5層蛋白高度和哈氏單位均高于第3和7層，其余各性狀指標在不同籠層間無顯著差異；春季時第1和5層蛋黃顏色和蛋白高度顯著高于其余各層(P<0.01)，第1和5層哈氏單位均高于第3和7層，其余各性狀指標在不同籠層間無顯著差異。

表3 雞舍內(nèi)不同籠層產(chǎn)蛋率和畸形蛋率

2.4 細菌基因總拷貝數(shù)與環(huán)境參數(shù)的相關(guān)性

水線水和V型槽水中細菌基因總拷貝數(shù)與環(huán)境參數(shù)的相關(guān)性見表6。水線水細菌數(shù)和V型槽水細菌數(shù)在冬季和春季均呈弱正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.223，r=0.225)，環(huán)境溫度與濕度在冬季和春季均呈極顯著負相關(guān)(r=-0.597，r=-0.921)；水線水細菌數(shù)在冬季和春季時，與溫度、濕度和空氣細菌數(shù)均呈不同程度弱相關(guān)；V型槽細菌數(shù)在冬季和春季時，與溫度、濕度和空氣細菌數(shù)均呈弱正相關(guān)，其中在冬季時與濕度呈顯著正相關(guān)(r=0.325)；溫度和濕度與空氣細菌數(shù)在冬季和春季時均呈弱相關(guān)。

2.5 細菌基因總拷貝數(shù)和環(huán)境參數(shù)與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)的相關(guān)性

水線水和V型槽水細菌基因總拷貝數(shù)、溫度、濕度和空氣細菌數(shù)與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)性狀的相關(guān)性見表7。水線水細菌數(shù)與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)性狀在冬、春季均呈不同程度弱負相關(guān)；V型槽水細菌數(shù)與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)性狀在冬季和春季均呈不同程度負相關(guān)，其中春季時與蛋白高和哈氏單位呈顯著負相關(guān)(r=-0.348，r=-0.479)；空氣細菌數(shù)與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)性狀在冬、春季均呈不同程度弱負相關(guān)；環(huán)境溫度與產(chǎn)蛋率和蛋重在冬、春季均呈不同程度正相關(guān)，與蛋白高度和哈氏單位均呈不同程度弱負相關(guān)，其中冬季時與產(chǎn)蛋率呈顯著正相關(guān)(r=0.215)；環(huán)境濕度與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)性狀在冬季和春季均呈不同程度弱相關(guān)。

3 討 論

本課題組前期利用16S rDNA 細菌通用引物擴增，通過實時熒光定量PCR法成功檢測了夏季雞舍內(nèi)水線水和V型槽水中細菌含量，發(fā)現(xiàn)不同階段所測V 型槽水細菌基因總拷貝數(shù)顯著高于水線水中[7]。本試驗中，冬、春季各階段所測V型槽水細菌基因總拷貝數(shù)量在各籠層均遠遠高于水線水中，最高可達32 130.51倍，這與夏季所測情況基本一致。水線水中細菌含量遠低于V型槽中，可能是由于水管密閉僅有飲水乳頭露置在外，加上雞群日常頻繁啄飲有沖洗作用，同時舍內(nèi)水線水也會提前消毒和定期沖洗，而敞開的V型槽內(nèi)積水和內(nèi)容物從未被清洗處理過，日積月累污染嚴重。次年春季水線水和V型槽水中細菌基因總拷貝數(shù)均高于冬季，表明隨著時間推移和溫度回升，水線和V型槽內(nèi)細菌微生物會不斷滋生增加。

舍內(nèi)溫濕度是影響蛋雞飲食衛(wèi)生和生產(chǎn)性能的重要因素[9]。李俊營等[10]對6層層疊式籠養(yǎng)密閉式雞舍冬季環(huán)境參數(shù)進行測定，發(fā)現(xiàn)上層平均溫度顯著高于下層，平均濕度顯著低于下層，這與本研究結(jié)果一致。舍內(nèi)環(huán)境中微生物形成的氣溶膠不僅污染環(huán)境，還可能危害畜禽的健康[11]。魏磊等[12]發(fā)現(xiàn)季節(jié)變化對舍內(nèi)氣溶膠的變化會產(chǎn)生一定的影響，冬季氣載金黃色葡萄球菌濃度高于夏季和秋季；牛晉國等[13]測定了雞舍內(nèi)不同位置細菌氣溶膠濃度，發(fā)現(xiàn)細菌氣溶膠濃度與采樣位置無關(guān)，但從濕簾端到風機端有升高的趨勢。本試驗中舍內(nèi)第3和7層空氣細菌數(shù)在冬、春季均高于第1和5層，這可能與第3和7層分別處于舍內(nèi)2個樓層的上部，空氣流動速度較大和濕度較低有關(guān)。

表6 水線水和V型槽水細菌基因總拷貝數(shù)與溫濕度和空氣細菌數(shù)相關(guān)分析Table 6 Correlation analysis of 16S rDNA copy number of bacteria in pipe water and V-trough between temperature and humidity as well as bacterial content in air

盧元鵬等[14]發(fā)現(xiàn)在4層層疊式籠養(yǎng)蛋雞舍內(nèi)第1層產(chǎn)蛋率最低，第3層產(chǎn)蛋率最高。Sahin[15]發(fā)現(xiàn)不同籠層蛋白指數(shù)、蛋黃指數(shù)和哈氏單位等均無顯著差異。本試驗中，在冬、春季節(jié)舍內(nèi)第1和5層產(chǎn)蛋率、蛋白高度、哈氏單位均高于第3和7層，除了與各籠層間溫度、濕度和通風量等環(huán)境差異有關(guān)[16]，還可能與第1和5層V型槽水細菌基因總拷貝數(shù)和空氣細菌含量較低有關(guān)。推測蛋雞產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)與空氣質(zhì)量和V型槽內(nèi)微生物環(huán)境有關(guān)，氣溶膠中細菌可能會對雞呼吸道產(chǎn)生危害，槽內(nèi)污物等有機物中含有大量的病原微生物，雞群采食后會可能會致腸道和輸卵管慢性疾病的發(fā)生。因此，在生產(chǎn)中控制好舍內(nèi)水線衛(wèi)生和空氣質(zhì)量的同時，還需要提高對V型槽內(nèi)污染情況的關(guān)注。

表7 水線水和V型槽水中細菌基因總拷貝數(shù)與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)的相關(guān)性Table 7 Correlation analysis of 16S rDNA copy number of bacteria in pipe water and V-trough between laying rate and egg quality traits

本研究中，舍內(nèi)溫度和濕度在不同季節(jié)均呈顯著負相關(guān)，這與李俊營等[10]研究結(jié)果一致。水線水細菌數(shù)和V型槽水細菌數(shù)在冬、春季節(jié)均呈弱正相關(guān)，與萬意等[7]夏季的研究結(jié)果一致，因為當雞啄飲乳頭時會造成飲水器漏水或外灑至V型槽內(nèi)，所以水線中微生物滋生也會增加V型槽中的細菌數(shù)量。水線水細菌基因總拷貝數(shù)與溫、濕度及空氣細菌數(shù)呈弱相關(guān)，可能是由于水線管密閉且飲水乳頭經(jīng)常被雞群啄飲，從而溫、濕度及空氣質(zhì)量對水線水影響較小。V型槽水細菌基因總拷貝數(shù)與溫、濕度和空氣細菌數(shù)均呈正相關(guān)，且在冬季時與濕度呈顯著正相關(guān)，表明適宜的溫度和較高的濕度可致使槽內(nèi)細菌微生物迅速繁殖[17]。因此，控制好合理的舍內(nèi)溫濕度不僅有利于雞群的生長健康，還可以抑制V型槽內(nèi)有害微生物的滋生。

溫度與產(chǎn)蛋率、蛋重均呈正相關(guān)，其中在冬季與產(chǎn)蛋率呈顯著正相關(guān)，提醒在冬季生產(chǎn)中更應重視舍內(nèi)保暖措施。水線水細菌基因總拷貝數(shù)和空氣細菌數(shù)與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)性狀等均呈弱相關(guān)，表明水線水污染和空氣質(zhì)量對雞群生產(chǎn)性能影響相對較小；V型槽水細菌基因總拷貝數(shù)與產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)性狀均呈負相關(guān)，其中在春季與蛋白高度和哈氏單位呈顯著負相關(guān)，表明V型槽內(nèi)細菌微生物污染有致使蛋雞生產(chǎn)性能和雞蛋品質(zhì)下降的趨勢，舍內(nèi)雞群長期啄飲V型槽水可能會危害機體健康和生產(chǎn)性能，對企業(yè)經(jīng)濟效益產(chǎn)生負面影響。結(jié)合前期夏季的研究結(jié)果，建議雞舍內(nèi)飲水系統(tǒng)配備有V型槽的養(yǎng)殖場，無論在夏季還是冬春季都應增強對V型槽衛(wèi)生安全的關(guān)注，需定期采集槽內(nèi)水樣進行污染情況監(jiān)測，同時依照自身條件制定并執(zhí)行一套實用的V型槽清潔消毒技術(shù)規(guī)程。

4 結(jié) 論

1)冬季和春季層疊式蛋雞舍內(nèi)V 型槽水中細菌微生物含量遠高于水線水中，污染程度更大，次年春季時水線水和V型槽水中細菌微生物含量均高于冬季時。

2)冬季和春季舍內(nèi)水線水細菌數(shù)與V型槽水細菌數(shù)均呈弱正相關(guān)，V型槽水細菌數(shù)與溫度、濕度和空氣細菌數(shù)間正相關(guān)程度更高，更易受環(huán)境質(zhì)量影響。

3)水線水和V型槽水細菌含量與產(chǎn)蛋率、蛋重、蛋白高度和哈氏單位均呈不同程度負相關(guān)，V型槽水細菌污染對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)有更大的潛在負面影響。