一株西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌基因分型及rpoE基因生物信息學(xué)分析

周賽賽 李天嬌 武 琦 朱家平 羅 宗 呂 然 趙曉慧 王一飛 羅潤(rùn)波 貢 嘎 王保寧,2 索朗斯珠*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000； 2.四川大學(xué) 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)歸屬巴氏桿菌目、巴氏桿菌科、巴氏桿菌屬，革蘭陰性兩極濃染、無芽孢的兼性厭氧短小桿菌，因巴斯德在1880年首次從家禽霍亂爆發(fā)病例中分離而得名[1-2]。多殺性巴氏桿菌不僅引起多種畜禽發(fā)病[3-8]，也是人多種疾病的病原體[9-11]。多殺性巴氏桿菌不僅影響我國(guó)的多種動(dòng)物[12-16]，亞洲、歐洲、非洲的多個(gè)國(guó)家均有報(bào)道[17-23]。近些年，莢膜A型和B型多殺性巴氏桿菌一直影響著我國(guó)牛產(chǎn)業(yè)體系的發(fā)展，且病死率高，有區(qū)域流行性。

近些年本課題組通過對(duì)西藏地區(qū)牦牛源多殺性巴氏桿菌流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，牦牛Pm感染率較高，嚴(yán)重影響了我國(guó)牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4,13]。目前國(guó)內(nèi)尚無專用于防控牦牛多殺性巴氏桿菌的商品化疫苗，商品化牛源多殺性巴氏桿菌疫苗主要以滅活苗為主，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)因不了解牦牛源多殺性巴氏桿菌基因型，盲目用商品化牛源多殺性巴氏桿菌滅活疫苗免疫西藏牦牛，導(dǎo)致不能有效的防控該病，所以了解西藏地區(qū)牦牛源多殺性巴氏桿菌的基因型是選擇和制備疫苗的前提，也將有利于防控西藏牦牛出血性敗血癥。Carter[24]于1952年根據(jù)細(xì)菌莢膜抗原性、特異性，利用血凝試驗(yàn)將多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了A、B、D和E莢膜分型；Rimler等[25]于1987年從火雞中分離出了多殺性巴氏桿菌，隨后根據(jù)Carter的分型方法鑒定出其莢膜F型。Harper等[26]基于脂多糖外核編碼基因簇建立了多重PCR方法，將Pm分為L(zhǎng)1～L8基因型，8種基因型和傳統(tǒng)Heddleston等[27]血清分型間有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，但比傳統(tǒng)Heddleston血清分型方法有較高的精確度。Maiden等[28]于1998年利用PCR擴(kuò)增了多個(gè)管家基因內(nèi)部片段(約7個(gè)管家基因)，建立了多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)方法，該方法已經(jīng)被用于細(xì)菌、真菌的分型研究中。目前利用MLST分型鑒定多殺性巴氏桿菌，ST型已有142種，因多殺性巴氏桿菌基因型眾多，若不能了解西藏地區(qū)牦牛源多殺性巴氏桿菌的基因型，將嚴(yán)重影響該地區(qū)的疫病防控。

rpoE是一種控制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的 σ 因子，基因編碼的RpoE蛋白是 σ 70蛋白家族成員，在維持細(xì)菌內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、毒力、非致死性環(huán)境脅迫的過程中有調(diào)節(jié)作用[29-31]。王林柏[32]已經(jīng)驗(yàn)證rpoE為兔巴氏桿菌的一種毒力因子，是良好的減毒疫苗候選蛋白。據(jù)報(bào)道rpoEσ 因子在沙門氏菌[33]、溶藻性弧菌[34]、大腸桿菌[35]和放線桿菌[36]等細(xì)菌中具有調(diào)節(jié)生物膜合成和適應(yīng)外界應(yīng)激能力的重要作用。雖有A型多殺性巴氏桿菌關(guān)于RpoE蛋白在免疫保護(hù)效力方面的研究[37]，但缺少對(duì)多殺性巴氏桿菌rpoE基因的生物信息學(xué)分析，西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因的研究更是空白。

本研究通過分子學(xué)方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的一株西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行莢膜分型、脂多糖分型、多位點(diǎn)序列分型鑒定，利用生物信息學(xué)方法對(duì)rpoE基因及其編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、親水和疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、基因信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、潛在氨基酸磷酸化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞線性抗原表位、蛋白互作分析，旨在了解西藏牦牛源Pm的基因型，為后期疫苗研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

本株牦牛源B型Pm、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離、冷凍保存；pMD -TM18T購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 試劑及儀器

PCR擴(kuò)增的所有引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；細(xì)菌全基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Premix TaqTM(Code No.RR901A)、Agarose gel DNA extraction kit(Code No.9762)和Plasmid purification kit(Code No.9760)均購自大連寶生物工程有限公司；微量分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop 2000，美國(guó))；凝膠成像儀(Bio-rad，美國(guó))；PCR儀器(Applied Biosystems，美國(guó))。

1.3 全基因組提取及PCR擴(kuò)增

將平板單菌落挑到含有10% FBS的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA，NanoDrop 2000分析DNA濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆?；分別用多殺性巴氏桿菌特異性引物(Kmt)、莢膜基因分型引物(PmA、PmB、PmD、PmE和PmF)、脂多糖基因分型引物(L1-L8)、MLST分型擴(kuò)增引物(adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh和pgi)、σ 因子基因(rpoE)引物PCR擴(kuò)增，總體系均為50 μL，分別將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀拍照保存。

表1 多殺性巴氏桿菌基因擴(kuò)增相關(guān)引物信息Table 1 Related primer information of P. multocida

表1(續(xù))

1.4 基因克隆及測(cè)序

將陽性產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，過夜連接載體pMDTM-18T，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，在含100 μg/mL Amp+LB固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于100 μg/mL Amp+LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，PCR鑒定，將陽性送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.5 測(cè)序結(jié)果分析

將所有測(cè)序結(jié)果在NCBI中比對(duì)，并下載參考序列；將測(cè)序完成的管家基因的序列提交至專門的MLST在線數(shù)據(jù)庫(PasteurellamultocidaMLST Databases：http:∥pubmlst.org/pmultocida/)進(jìn)行比對(duì)明確每個(gè)基因T型，并確定牦牛源多殺性巴氏桿菌的ST型；利用MEGA 7.0 對(duì)rpoE基因序列進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 rpoE基因生物信息學(xué)分析

利用蛋白質(zhì)在線工具Prot-Param(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析RpoE蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)和不穩(wěn)定系數(shù)等)；

利用ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析RpoE蛋白的親水和疏水性；

利用TMHMM Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)rpoE基因的跨膜結(jié)構(gòu)域分析；

利用SignalP 4.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)對(duì)rpoE基因信號(hào)肽分析；

通過在線分析工具PSORT Prediction(http:∥psort1.hgc.jp/form.html)可對(duì)rpoE基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析；

利用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)和NCBIConserved Domains(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線程序預(yù)測(cè)RpoE蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析；

利用NetPhos 3.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)RpoE潛在氨基酸磷酸化位點(diǎn)；

利用在線軟件SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)RpoE蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；

利用在線軟件SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)RpoE蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；

利用IEDB(http:∥tools.iedb.org/bcell/)和BCPREDS(http:∥ailab-projects1.ist.psu.edu:8080/bcpred/predict.html)在線程序預(yù)測(cè)RpoE蛋白B細(xì)胞線性抗原表位；

利用STRING Version:11.0(https:∥string-db.org/)分析RpoE蛋白與其他蛋白互作關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛源多殺性巴氏桿菌莢膜、脂多糖和管家基因擴(kuò)增

經(jīng)過對(duì)細(xì)菌引物PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1～3。

M：DL 2 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N：陰性對(duì)照；1： 16S rDNA 片段；2： Kmt基因；3～7：莢膜分型(A、B、D、E和F)；8～15：脂多糖分型(L1～L8) M: DL 2 000 DNA Marker; N: Negative controls; 1: 16S rDNA fragment; 2： Kmt gene; 3-7: Classification of capsule (A、B、D、E and F); 8-15: Classification of lipopolysaccharide (L1-L8)圖1 牦牛源多殺性巴氏桿菌莢膜和脂多糖分型Fig.1 Classifications of Pasteurella multocida capsule and lipopolysaccharide from yak

M：DL 2 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N：陰性對(duì)照；1： 16S rDNA 片段；2： Kmt gene；3～9：管家基因(adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh和pgi) M: DL 2 000 DNA Marker; N: Negative controls;1: 16S rDNA fragment; 2： Kmt gene; 3-9: Housekeeping gene (adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh and pgi)圖2 牦牛源多殺性巴氏桿菌管家基因擴(kuò)增Fig.2 Gene amplification of P. multocida house from yak

M：DL 2 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N：陰性對(duì)照；1： 16S rDNA 片段；2： Kmt gene；3：rpoE基因 M: DL 2 000 DNA Marker; N: Negative controls; 1: 16S rDNA fragment; 2: Kmt gene; 3: rpoE gene圖3 牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因擴(kuò)增Fig.3 Gene amplification of P. multocida rpoE from yak

細(xì)菌通用引物16S rDNA擴(kuò)增出了長(zhǎng)約1 400 bp條帶；B型引物擴(kuò)增出了長(zhǎng)約760 bp條帶，其他莢膜分型引物均未擴(kuò)增出；L2型引物擴(kuò)增出了約810 bp條帶，其他脂多糖分型均無條帶；7對(duì)管家基因均能擴(kuò)增出條帶，且符合預(yù)期條帶大小。rpoE基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條帶大小約460 bp。結(jié)果表明：該株牦牛源多殺性巴氏桿菌為莢膜B型和脂多糖L2型。

2.2 牦牛源多殺性巴氏桿菌MLST分型鑒定

將測(cè)序結(jié)果在PasteurellamultocidaMLST數(shù)據(jù)庫中比對(duì)7個(gè)管家基因的等位基因，結(jié)果如表2，表明該株牦牛源多殺性巴氏桿菌MLST分型為ST44型。

表2 管家基因在線比對(duì)分析Table 2 Online comparison of housekeeping gene

2.3 牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因進(jìn)化樹分析

將測(cè)序序列比對(duì)后，該西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因和印度牛源多殺性巴氏桿菌(CP023305.1)的rpoE基因相似性100%，和其他多殺性巴氏桿菌rpoE基因序列存在10處堿基差異，但僅有第27位氨基酸發(fā)生了S→F突變；另外，第471位氨基酸(E)僅與法國(guó)兔源多殺性巴氏桿菌(CP020347.1)RpoE蛋白的氨基酸(K)有差異。通過和19株參考序列比對(duì)做基因發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)，西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌rpoE基因，與荷蘭(CP026744.1)、美國(guó)(CP044077.1)人源，韓國(guó)(CP049756.1)貓?jiān)炊鄽⑿园褪蠗U菌差異性較大，相似性分別為38.7%、38.4%和38.7%，位于不同分支，除牛源以外的其他源多殺性巴氏桿菌rpoE基因差異性較小。

2.4 rpoE基因編碼蛋白特性分析

通過Port-Param在線分析RpoE蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明rpoE基因序列長(zhǎng)576 bp，編碼191個(gè)氨基酸，分子式為C967H1 544N268O304S6，分子量為22.0 ku，理論等電點(diǎn)4.86，20種氨基酸中無組氨酸(H)，谷氨酸(E)占比最多9.9%(表3)，負(fù)電荷(Asp+Glu)的殘基總數(shù)31個(gè)，正電荷(Arg+Lys)的殘基總數(shù)24個(gè)，脂肪指數(shù)90.37，總平均親水性(GRAVY)為-0.440，在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)半衰期約為30 h，大腸桿菌屬和酵母內(nèi)半衰期分別大于10和20 h，消光系數(shù)為17 420，不穩(wěn)定性指數(shù)為46.14，屬不穩(wěn)定性蛋白。

標(biāo)尺表示遺傳距離，指每個(gè)位點(diǎn)有0.000 5個(gè)氨基酸替換。 Scale bar indicates genetic distance. Number 0.000 5 represents 0.000 5 aa substitutions per site.圖4 rpoE基因進(jìn)化樹分析Fig.4 rpoE gene evolution tree analysis

表3 RpoE蛋白氨基酸含量Table 3 RpoE protein amino acid content

2.5 RpoE蛋白親疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)分析

通過Prot-Param在線分析，已知本分離株RpoE蛋白的GRAVY為負(fù)值，表示具有親水性；利用在線分析工具Protscale可對(duì)蛋白親疏水性進(jìn)行分析，多肽鏈第93位的Pro(P)具有最低的分值-2.956，第134位的Thr(T)具有最高的分值1.300；從整體看，親水性氨基酸多于疏水氨基酸，表明了RpoE為親水性蛋白。通過TMHMM Server在線程序，對(duì)RpoE蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果氨基酸殘基在螺旋中、內(nèi)部或外部的總概率求和概率無波峰，表明預(yù)測(cè)該蛋白無跨膜區(qū)域，見圖5。

2.6 RpoE蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽和細(xì)胞定位分析

通過NetPhos3.1 Server服務(wù)器進(jìn)行激酶特異性磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果Ser(S)、Thr(T)、Tyr(Y)預(yù)測(cè)得分高于0.5的個(gè)數(shù)分別為10、5和2，表明該蛋白氨基酸潛在的磷酸化位點(diǎn)有17個(gè)。通過SignalP 4.0 Server服務(wù)器分析RpoE蛋白信號(hào)肽，S平均值<0.5，表明該蛋白無信號(hào)肽，不能向其他通路轉(zhuǎn)移或進(jìn)入其他膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞內(nèi)。rpoE基因定位的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在很大程度上與該基因編碼蛋白的功能密切相關(guān)，通過PSORT Prediction在線分析，結(jié)果顯示該基因定位在細(xì)胞質(zhì)、線粒體基質(zhì)、溶酶體(腔)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(膜)的得分分別為0.650、0.100、0.100和0.000，表明該基因在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的可能性極大(圖6)。

(a)RpoE蛋白親疏水性分析；(b)RpoE蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析(a) Analysis of RpoE protein hydrophobicity； (b) Analysis of RpoE protein transmembrane structure圖5 RpoE蛋白親疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.5 RpoE analysis of protein hydrophobicityand transmembrane structure

(a)RpoE蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)分析； (b)RpoE蛋白信號(hào)肽分析(a) RpoE protein kinase phosphorylation site analysis； (b) RpoE protein signal peptide analysis圖6 RpoE蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)和信號(hào)肽分析Fig.6 RpoE protein kinase phosphorylation site and signal peptide analysis

2.7 RpoE蛋白結(jié)構(gòu)域分析

通過SMART在線分析RpoE蛋白保守結(jié)構(gòu)域，RpoE蛋白在PFAM數(shù)據(jù)庫中有Sigma70_r2、Sigma70_r4_2個(gè)結(jié)構(gòu)域，氨基酸位點(diǎn)分別在25～92、128～181，均為RNA聚合酶Sigma因子；利用NCBI CD Search在線分析，結(jié)果有3種類型的匹配：特定匹配(specific hits)和超家族(superfamily)蛋白PRK09652、RpoE superfamily，非特定匹配(non-specific hits)和超家族(superfamily)蛋白R(shí)poE Sigma70 superfamily，均為Sigma-70家族RNA聚合酶sigma因子；保守位點(diǎn)氨基酸有13個(gè)，均為DNA結(jié)合殘基位點(diǎn)。2次分析結(jié)果一致，利用NCBI分析RpoE蛋白保守結(jié)構(gòu)域結(jié)果相對(duì)更豐富(圖7)。

(a)SMART在線分析；(b)NCBI CD search在線分析(a) SMART online analysis； (b) NCBI CD search online analysis圖7 RpoE蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.7 RpoE protein domain analysis

2.8 RpoE蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過在線軟件SOPMA在線分析顯示，由圖8可知，RpoE蛋白有4種結(jié)構(gòu)存在，分別是：α-螺旋(h)、無規(guī)則卷曲(c)、延伸鏈(e)和β-轉(zhuǎn)角(t)。α-螺旋占比67.02%，β-轉(zhuǎn)角占比4.71%。通過SWISS-MODEL在線數(shù)據(jù)庫對(duì)牦牛源多殺性巴氏桿菌RpoE蛋白進(jìn)行同源建模，分析表明與大腸桿菌RNA聚合酶sigma E模型相似度最高為74.35%，GMQE為0.87，QMEAN為-0.52，基本可以認(rèn)為模型完全代表了真實(shí)結(jié)構(gòu)，并可用它進(jìn)行虛擬篩選、分子對(duì)接等功能結(jié)構(gòu)研究，選擇該蛋白進(jìn)行同源性建模(圖9)。

2.9 RpoE蛋白B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測(cè)

通過IEDB在線分析RpoE蛋白B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測(cè)，最高分1.146，平均得分1.019，共預(yù)測(cè)到6個(gè)線性抗原表位；利用BCPREDS在線分析，線性表位預(yù)測(cè)長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸，特異性為75%，結(jié)果共預(yù)測(cè)到4個(gè)線性抗原表位(圖10)。2種分析方法均表明該蛋白表面存在線性抗原表位，但2種方法預(yù)測(cè)存在差異。

2.10 RpoE與其他蛋白之間的互作預(yù)測(cè)

通過STRING Version11.0分析多殺性巴氏桿菌RpoE蛋白與其他蛋白之間的關(guān)系，在10個(gè)蛋白中有24條相互作用線，蛋白之間連線顏色差異表示不同的相互作用途徑，顏色越多，表明2種蛋白之間有更為密切的互作關(guān)系。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)：RpoE蛋白和替代 σ 因子RpoH、RseB、RNA聚合酶σ因子RpoD、arcB、sodC、RNA結(jié)合蛋白hfq、DR93_94、DR93_141、抗RpoE RseA N-端結(jié)構(gòu)域蛋白DR93_149和DR93_151蛋白的編碼基因中存在基因鄰域、基因組間協(xié)同、基因共表達(dá)和基因融合等現(xiàn)象，與抗RpoE RseA N端結(jié)構(gòu)域蛋白DR93_149相互作用的綜合得分最高為0.999，其主要功能為參與脂多糖的合成和調(diào)節(jié)外界環(huán)境脅迫的耐受能力等(圖11)。

h：α-螺旋；c：無規(guī)則卷曲；e：延伸鏈；t：β-轉(zhuǎn)角 h: Alpha helix； c: Random coil； e: Extended strand； t: Beta bridge圖8 RpoE蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 RpoE protein secondary structure prediction

(a)Ball+Stick模型； (b) Spacefill模型(a) Ball+Stick model; (b) Spacefill model圖9 RpoE蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 RpoE protein tertiary structure prediction

(a)IEDB在線分析；(b)BCPREDS在線分析(a) IEDB online analysis; (b) BCPREDS online analysis圖10 RpoE蛋白B細(xì)胞線性抗原表位預(yù)測(cè)Fig.10 Prediction of B cell linear antigen epitope of RpoE protein

3 討 論

目前，我國(guó)雖有商品化的牛多殺性巴氏桿菌滅活疫苗，但疫苗株和西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌存在一定差異，迫切需要鑒定西藏牦牛源Pm的基因型，并利用西藏牦牛源多殺性巴氏桿菌研發(fā)高效、可靠的疫苗。通過分子學(xué)方法鑒定西藏地區(qū)牦牛源Pm為莢膜B型、脂多糖L2型、管家基因ST44型，與鄔琴等[38]對(duì)新疆牦牛源Pm對(duì)比分型一致，表明新疆牦牛源Pm與西藏地區(qū)牦牛源Pm有較高的相似性。Sarangi等[39]、Alex等[40]和Peng等[15,41]在Pm基因分型中的研究表明，不同地理區(qū)域、不同宿主動(dòng)物Pm的基因型有一定差異，但同一宿主的Pm具有“基因型偏好”現(xiàn)象。也有報(bào)道青海牦牛源多殺性巴氏桿菌存在莢膜A型，但并未進(jìn)行多方面基因分型。牦牛源Pm基因分型是否具有一定的“基因型偏好”，還需要大量基因分型鑒定驗(yàn)證。

RpoE蛋白是細(xì)菌在應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化的內(nèi)部調(diào)節(jié) σ 因子，在兔源和牛源Pm中編碼的RpoE蛋白有著較強(qiáng)的毒力作用和免疫原性[32,37]。通過分子生物學(xué)分析rpoE基因及其編碼蛋白發(fā)現(xiàn)，西藏牦牛源rpoE基因全長(zhǎng)576 bp，其基因序列和印度牛源Pm的rpoE基因完全一致，相似度100%。本課題組曾將Pm特異性基因Kmt進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，和印度牛源Pm的特異性基因同源性較高[4]，結(jié)合本次rpoE基因比對(duì)結(jié)果，進(jìn)一步證明了西藏牦牛源Pm與印度牛源Pm存在很近的親緣關(guān)系，應(yīng)加強(qiáng)進(jìn)出口檢疫防控。利用生物信息學(xué)方法對(duì)牦牛源PmrpoE基因及其編碼蛋白R(shí)poE分析，預(yù)測(cè)出該蛋白分子量為22.0 ku，理論等電點(diǎn)4.86，為不穩(wěn)定、無跨膜結(jié)構(gòu)、無信號(hào)肽、有潛在磷酸化的胞內(nèi)親水性蛋白，這表明該蛋白可能在胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，通過抗原和抗體結(jié)合進(jìn)行信號(hào)的傳導(dǎo)。RpoE蛋白有多個(gè)抗原表位，可能和二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、自由卷曲的存在有關(guān)[42]，三級(jí)結(jié)構(gòu)模型為棒狀微彎曲，可較大面積與B細(xì)胞抗原結(jié)合，可能為良好的候選疫苗抗原[37]。由于BCPREDS在線分析中抗原決定簇氨基酸數(shù)量限制較大，與IEDB在線分析相比抗原表位預(yù)測(cè)少2個(gè)，但均表明RpoE蛋白存在抗原表位。在預(yù)測(cè)RpoE蛋白互作中，發(fā)現(xiàn)與10個(gè)蛋白存在共表達(dá)、基因共現(xiàn)、基因融合等相互作用，將為深入了解RpoE蛋白作用機(jī)制提供參考。Collinet等[43]發(fā)現(xiàn)RseB-RiseA相互作用，可調(diào)節(jié)rpoE基因RNA聚合酶的組裝和熱休克反應(yīng)，Kloska等[44]研究表明通過誘導(dǎo)RpoE和抑制RpoD σ 因子來介導(dǎo)冷應(yīng)激反應(yīng)。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)rpoE基因在西藏牦牛源Pm中可能是潛在的毒力基因，在環(huán)境脅迫的過程中有潛在的調(diào)節(jié)作用，若要明確RpoE蛋白的具體作用，還需要進(jìn)一步研究該蛋白在牦牛源Pm中的作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究成功鑒定了一株實(shí)驗(yàn)室保存的西藏牦牛源Pm為B∶L2∶ST44型，對(duì)RpoE蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)無信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋占比最高，三級(jí)結(jié)構(gòu)模型為棒狀微彎曲，是存在至少4個(gè)抗原表位的胞內(nèi)親水性蛋白。推測(cè)RpoE蛋白有望成為Pm的疫苗候選抗原，將為后續(xù)深入研究RpoE蛋白的相關(guān)疫苗和疫病防控提供數(shù)據(jù)參考。